Introducción

El cultivo del pepino en México tiene gran importancia económica, se ha incrementado en producción y exportación, en el 2022 su producción fue de 1,028,567.57 toneladas (^{SIAP, 2023}). Dentro de los problemas fitosanitarios más importantes, se encuentran diversos géneros de nematodos fitopatógenos, entre ellos los noduladores de raíces, que alcanzan reducciones de la producción de hasta 60 % en agricultura protegida (^{Ornat et al., 1997}), disminuyendo la habilidad de la planta de absorber agua y nutrientes del suelo, ocasionando un lento crecimiento y un bajo rendimiento del cultivo (^{Machado et al., 2013}). La estrategia más utilizada para controlar infestaciones de nematodos es por medio de la aplicación de plaguicidas a base de organofosforados y carbamatos (^{Jones et al., 2016}), anteriormente se utilizaba el Bromuro de metilo, que por su alta toxicidad se ha retirado del mercado (^{Wang et al., 2015}; ^{Gupta et al., 2017}).

En la búsqueda de alternativas para controlar estos nematodos, sin dañar al medio ambiente y a la salud humana, se investigan diversas técnicas como enmiendas orgánicas, solarizaciones, fertilizaciones y control biológico (^{Collange et al., 2011}).

Existen bacterias que promueven el crecimiento de las plantas, ya que producen hormonas, solubilizan fósforo, potasio y zinc, e inducen resistencia hacia agentes bióticos o abióticos (^{Santos et al., 2019}). Estas bacterias también se han estudiado por su alto potencial como agentes de control (^{Radwan et al., 2012}). Las principales especies para este propósito, son aquellas encontradas en la rizosfera, donde se presenta una interacción entre las raíces de las plantas y microorganismos del suelo, los cuales se ven influenciados por los exudados radiculares (^{Mc Near, 2013}), entre estas se encuentra el género Bacillus^{Cohn (1872)}, que ha mostrado actividad nematicida sobre el género Meloidogyne Göeldi (^{Condemarin et al., 2018}).

Bacillus vallismortis^{Roberts et al. (1996)} es una especie poca estudiada como controlador de nematodos, se ha demostrado que es productora de una gran cantidad de metabolitos bioactivos, como la bacilomicina D, con actividad fungistática sobre diversos hongos fitopatógenos (^{Zhao et al., 2010}), así como los compuestos Iturin A y surfactina, utilizados para el control de otras enfermedades de plantas (^{Kaur et al., 2017}).

Bacillus velezensis (^{Ruiz-García et al., 2005}) se encuentra con frecuencia en el suelo, en alimentos fermentados e intestinos de animales, y comúnmente reconocido como un tipo de recurso biológico como Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn y Bacillus amyloliquefaciens (ex Fukomoto) (^{Priest et al., 1987}) estas últimas, producen enzimas líticas, fitohormonas y compuestos que inhiben el crecimiento de hongos fitopatógenos (^{Maung et al., 2017}). En análisis previos de esta bacteria con propiedades nematicidas, ^{Tian et al. (2022)}, obtuvieron resultados prometedores al evaluar caldos bacterianos y sobrenadantes en juveniles y raíces infectadas de M. incognita.

Pseudomonas fluorescens (Flügge) (^{Migula, 1895}), además de ser una bacteria que juega un importante rol en el crecimiento y salud de la planta, se ha descubierto que sus metabolitos secundarios, el 4-diacetylfloroglucinol (DAGP), fenazina y el ácido cianhídrico han mostrado efecto sobre microorganismos fitopatógenos (Hass y Defago, 2005), como huevos y larvas de Globodera rostochiensis (Wollenweber), mostrando una disminución en la eclosión y movilidad de estos organismos (^{Cronin, 1997}). El objetivo de esta investigación fue identificar los nematodos fitopatógenos asociados al cultivo de pepino y evaluar in vitro los filtrados de las rhizobacterias promotoras de crecimiento B. vallismortis, B. vellezensis y P. fluorescens sobre M. incognita, como alternativa de control para este organismo del suelo.

Materiales y métodos

La investigación se realizó en condiciones controladas en el Laboratorio de Entomología Molecular y Alternativas de Control de Plagas del Departamento de Parasitología de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Saltillo, Coahuila.

Se utilizaron nemátodos fitoparásitos extraídos de muestras del cultivo de pepino Cucumis sativus L. (Cucurbitaceae) var. 543 Harris Moran, del municipio de Guadalcázar San Luis Potosí, México. Se realizó un muestreo dirigido a plantas con síntomas típicos de la presencia de nematodos, como clorosis, achaparramiento, y observación de nódulos a la exposición de las raíces.

Las muestras consistían de raíces de las plantas, con aproximadamente 2 kg de suelo de la rizosfera. La extracción de nematodos de suelo se realizó por la metodología de tamizado- centrifugado (^{Araya et al., 1995}). La identificación de los géneros de nematodos filiformes extraídos de suelo se realizó con las claves taxonómicas de ^{Siddiqi (2000)} y las figuras publicadas por ^{Mai et al. (1996)}.

Las muestras de raíces fueron lavadas y una parte de ellas observadas bajo microscopio estereoscópico, con el fin de extraer manualmente hembras para la identificación de la especie en base a las claves de ^{Eisenback et al. (1983)}.

Otra sección de las raíces extraídas del cultivo fue lavada, seccionada y triturada en un molino eléctrico con 100 mL de agua, para su procesamiento por el método de tamizado-centrifugado. Con este procedimiento se obtuvieron huevos de nematodos, que fueron desinfectados e incubados a 25 °C, para observar su eclosión y utilizar a los juveniles en los bioensayos de mortalidad in vitro.

Las bacterias utilizadas para esta investigación fueron B. vallismortis, B. velezensis y P. fluorescens, otorgadas por el Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Autónoma de Coahuila.

Una muestra de las bacterias benéficas se agregó en un matraz erlenmeyer de un Litro de capacidad, el cual contenía 300 mL de caldo de Papa, enriquecido con extracto de malta y levadura y se mantuvieron en agitación constante a 150 rpm durante 5 d a temperatura ambiente (25 ± 5 º C). Se realizó un filtrado por medio de películas de nylon estériles con abertura de 0.45 µm. El extracto libre de células fue utilizado para las evaluaciones.

Para el bioensayo in vitro, se utilizaron placas plásticas de cultivo celular de 24 pozos de acuerdo con el método estándar de ^{Prasad et al. (1972)}. Se evaluaron siete tratamientos (filtrados bacterianos), incluyendo un testigo solo con agua destilada (Tabla 1).

Cada pozo fue una unidad experimental, donde se colocaron 15 nematodos juveniles y 500 µL de tratamiento, con 4 repeticiones. Las placas se colocaron en una incubadora (Yamato®) a 25 °C y fueron observadas bajo el microscopio estereoscópico a las 24 y 48 h para el conteo de juveniles muertos y determinar el efecto de los tratamientos sobre los juveniles, bajo un criterio de muerte, la falta de movimiento tras ser inducidos a un estímulo con un fino pincel.

Los datos de mortalidad de M. incognita fueron evaluados mediante un análisis de varianza y pruebas de comparación de medias de Tukey (p ≤ 0.05) bajo un diseño experimental completamente al azar mediante el empleo del programa Statistical Analysis System (SAS, 2009).

Resultados y discusión

Los nematodos fitopatógenos extraídos e identificados en las muestras de suelo fueron: Meloidogyne sp., Aphelenchoides sp., Pratylenchus sp., Tylenchorynchus sp., y Aphelenchus sp., destacando con mayor predominio el género Meloidogyne.

En las muestras de raíces se observaron síntomas característicos de agallas y deformaciones (Figura 1) donde se encontraron hembras globosas y masas de huevos (Figuras 2a y b), las cuales fueron extraídas manualmente.

Figura 1 Raíces de plantas de pepino con agallas. 

Figure 1 Cucumber plant roots with galls. 

Figura 2 a) Hembras de Meloidogyne incognita y b) masas de huevos presentes en raíces de Pepino.  

Figure 2 a) Meloidogyne incognita females and b) egg masses present in Cucumber roots. 

Bajo el microscopio estereoscópico se realizaron cortes perineales de las hembras por medio de los cuales se identificó al nematodo agallador M. incognita, utilizando como criterio las características del patrón perineal (Figura 3), mostrando un arco dorsal alto y cuadrado, con estrías onduladas, sin líneas laterales visibles.

Figura 3 Corte perineal de Meloidogyne incognita extraida de agallas de raices.  

Figura 3 Perineal pattern of Meloidogyne incognita extracted from root galls. 

Los nematodos juveniles de M. incognita expuestos a los filtrados bacterianos de P. fluorescens en las dos concentraciones, mostraron mortalidad a partir de las 24 h, siendo los tratamientos con mayor actividad nematicida sin diferencia significativa entre estos (P < 0.05). En la concentración más alta se presentó 95.9 % de mortalidad, y en la concentración de 50 % un 93.75 %.

El filtrado de B. velezensis en la concentración de 100 % causó mortalidad significativamente similar al filtrado de B. vallismortis con valores de mortalidad de 77.9 y 83.51 % respectivamente (P < 0.05).

La concentración al 50 % de B. velezensis causó el efecto nematicida más bajo de los tratamientos evaluados con 55.62 % de mortalidad de los juveniles a las 24 horas de exposición a los filtrados bacterianos (Tabla 2).

Después de 48 h de exposición, todos los tratamientos a excepción del testigo, presentaron los valores máximos de mortalidad, no difiriendo significativamente entre estos (P < 0.05), alcanzando el 100 % de mortalidad (Tabla 3).

De cada tratamiento, se tomaron nematodos filiformes y bajo el microscopio óptico se observaron los efectos sobre estos, en los nematodos del testigo con agua se observó movilidad, el cuerpo hialino, sin deformaciones en el interior y exterior (Figura 4). En los nematodos en contacto con los tratamientos de control, se observaron daños en el intestino, vacuolas en su interior y su notable falta de movilidad en el cuerpo (Figuras 5, 6 y 7).

Figura 5 Meloidogyne incognita expuesto al tratamiento de Bacillus velezensis.  

Figura 5 Meloidogyne incognita exposed to Bacillus velezensis treatment. 

Figura 6 Meloidogyne incognita expuesto al tratamiento de Pseudomonas fluorescens.  

Figure 6 Meloidogyne incognita exposed to Pseudomonas fluorescens treatment. 

Figura 7 Meloidogyne incognita expuesto al tratamiento de Bacillus vallismortis.  

Figure 7 Meloidogyne incognita exposed to Bacillus vallismortis treatment. 

En esta investigación, el nematodo juvenil predominante en las muestras del cultivo de pepino fue M. incognita, el cual causó los síntomas más severos en las plantas, como agallamientos visibles en las raíces. Comercialmente no existen variedades de pepino resistentes a nematodos agalladores, por lo tanto, sin resistencia genética el cultivo del pepino será vulnerable al parasitismo de este tipo de nematodos que causan grandes pérdidas (^{Hajihassani et al., 2019}). ^{Ravichandra et al. (2014)} reporta que los diez géneros de nematodos de mayor importancia económica, de acuerdo con la severidad de daño ocasionado en los cultivos hortícolas a nivel mundial son Meloidogyne spp., Radopholus spp., Heterodera spp., Globodera spp., Pratylenchus spp., Rotylenchulus spp., Ditylenchus spp., Tylenchulus spp., Helicotylenchus spp. y Xiphinema spp. En el cultivo de pepino se encontró a Meloidogyne sp. y Pratylenchus sp, los cuales representan riesgo en este cultivo. La presencia de Pratylenchus sp. es de suma importancia, ya que es un nematodo lesionador de las raíces hospederas, ocasionando heridas en el sistema radical como vía de entrada para otros fitopatógenos como hongos y bacterias (^{Villain et al., 1999}). Especies del género Aphelenchoides son fungívoros y están asociados a tejidos en descomposición (^{Yeates, 1999}), en este análisis se encontró a este género en menor cantidad que Meloidogyne sp. Estos nematodos se encuentran en una gran diversidad de plantas asociadas, no tienen hospedero específico (^{Sánchez-Monge et al., 2015}), ya que se han reportado más de 700 especies de 85 familias botánicas (^{Kohl, 2011}). Dentro de este género se encuentran los nemátodos foliares y de los brotes que causan deformaciones y necrosis en hojas, como A. ritzemabosi, A. fragarie y A. besseyi, que invaden hojas y tejidos de una gran cantidad de especies de plantas (Idowu and Keneth, 2021), estos daños no se observaron en las plantas seleccionadas para muestreo. Este género también se puede comportar como ectoparásito, afectando puntos de crecimiento (^{Eppo, 2017}).

En las raíces analizadas, además de agallas, se encontraron daños como decoloraciones, probablemente por la presencia del género Pratylenchus sp., que ocasiona numerosas lesiones, o de Tylenchorynchus sp., que se identificó en el suelo, y del cual se ha demostrado que los síntomas causados por este nematodo van acompañados con decoloración del tallo y clorosis en el sistema foliar (^{Handoo et al., 2007}). En el cultivo de pepino se encontró además Aphelenchus sp. y Aphelenchoides sp. En México, se han detectado estos dos géneros, en cultivos de papa sin causar daño a las plantas (^{Montes Belmont, 2002}). Por otra parte, ^{Baldwind et al. (2004)} describe al género Aphelenchus como degradador de hongos.

Para el control de estos nematodos, principalmente los agalladores, usualmente se utilizan nematicidas no fumigantes y fumigantes, los cuales son extremadamente tóxicos a humanos y a otro tipo de organismos benéficos (^{Zasada et al., 2010}).

Bacillus y Pseudomonas son géneros de bacterias predominantes que se han identificado como promotoras del crecimiento vegetal (^{Podile y Kishore, 2007}), además de excretar metabolitos con actividades frente a patógenos (^{Siddiqui y Shaukat, 2003}). Los filtrados bacterianos de la presente investigación en las concentraciones del 50 % mostraron excelente efecto al inactivar a las poblaciones de nematodos, observando parálisis en el cuerpo y detención de movilidad desde las 24 horas de exposición con el tratamiento.

Los filtrados de B. velezensis han sido evaluados para la inhibición de bacterias como Micrococcus flavus (^{Liu et al., 2007}), Listeria monocytogenes y Bacillus cereus (^{Frankland y Frankland, 1887}) en medios de cultivo, mostrando actividad antimicrobial.^{Tian et al. (2022)}, evaluó la mortalidad de J2 de M. incognita in vitro, inmersos por 24 h en sobrenadantes de B. velezensis cepa Bv-25, obteniendo una mortalidad de 78.3 y 59.5 % en concentraciones del 100 y 10 % respectivamente, similar a los resultados mostrados en este estudio, con una mortalidad de 77.91 y 55.2 % a las concentraciones de 100 y 50 % respectivamente.

B. vallismortis ha mostrado efectos sobre diversos hongos fitopatógenos, se le atribuye a la presencia de compuestos como Bacillomycina D (n-C14) y Bacillomycina D (iso-C15) con acción contra estos microorganismos (^{Zhao et al., 2010}). Pruebas cuantitativas han demostrado el incremento de unidades formadoras de colonias de la bacteria B. velezensis en raíces inoculadas. Esto indica que la colonización de esta bacteria en la planta es rápida y puede suprimir el parasitismo de nematodos como M. incognita (^{Tian et al., 2022}).

Especies de Bacillus producen metabolitos secundarios, como lipopéptidos con potencial importante como inhibidores de fitopatógenos (^{Ongena et al., 2008}; ^{Théatre et al., 2021}).

En este estudio a 24 h de exposición se observó una mortalidad del 95 % sobre juveniles con la bacteria P. fluorescens, atribuida a enzimas como la Proteasa AprA, la cual se ha detectado en algunas cepas de esta rizobacteria, como metabolito encargado del biocontrol sobre Meloidogyne sp. (^{Siddiqui et al., 2003}). Se ha descubierto que uno de los metabolitos importantes producidos por Pseudomonas sp., es el 2,4-diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG), compuesto fenólico con actividad antifúngica, antibacteriana, antihelmíntica y fitotóxica de amplio espectro (^{Keel et al., 1992}; ^{Dowling y O’Gara, 1994}), por el cual se le puede atribuir su excelente efecto nematicida en esta investigación.

El control biológico se ha convertido en una herramienta eficaz para el manejo de enfermedades de plantas, con esta investigación se ofrecen nuevas alternativas nematicidas, que deberán continuar evaluándose en invernadero y campo, además de identificar los metabolitos presentes en las rizobacterias y determinar su actividad nematicida para problemas de fitosanidad.

Conclusiones

Los microorganismos son una herramienta eficaz sobre fitopatógenos. Los filtrados libres de células de Bacillus vallismortis, Bacillus velezensis y Pseudomonas fluorescens en sus dos concentraciones, presentan una rápida y eficiente acción letal sobre nematodos juveniles.

Se comprueba que existen alternativas a los productos químicos fumigantes que se han utilizado en exceso para el control de nematodos fitopatógenos.