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Introducción
El maíz es uno de los cereales con mayor superficie de cultivo sembrado a nivel mundial, seguido por el trigo y el arroz, destinado tanto a la alimentación humana como animal (Mazzani et al., 1999; Chavarri, 2010). Son muchos los agentes etiológicos que generan enfermedades en las plantas de maíz, sin embargo, F. verticillioides, es uno de los mohos a los cuales se le ha prestado especial atención por su amplia distribución, especialmente en zonas tropicales y subtropicales, su capacidad toxigénica y resistencia (Mazzani et al., 2000; Peiretti et al., 2007; Mazzani et al., 2008; Chavarri et al., 2009; Figueroa et al., 2010; Aguaysol et al., 2013, De la Torre et al., 2014).
Se han descrito casi 400 micotoxinas, destacando a las aflatoxinas, fumonisinas, ocratoxina, citrinina, deoxidivalenol, zearalenona, toxina T2 y otros tricótecenos por su amplia distribución en producción pecuaria, e implicaciones en salud pública y animal (USDA, 2006; Norred and Voss, 1994).
Las fumonisinas, producidas por F. verticillioides y F. proliferatum, se han identificado en necropsias de equinos con leucoencefalomalacia, en porcinos con edema pulmonar y en humanos con cáncer esofágico y hepatocarcinomas celular (Norred and Voss, 1994). La incidencia de F. verticillioides y fumonisinas se ha demostrado consistentemente durante los últimos diez años en maíz cosechado en siembras experimentales y extensivas de Venezuela, en las cuales se utiliza alta tecnología agrícola (Mazzani et al., 2000; Luzón et al., 2007, Mazzani et al., 2008, García et al., 2013; Chavarri et al., 2013; Barroyeta et al., 2013).
La incidencia de mohos y micotoxinas generan cambios desfavorables en los granos, alterando su valor nutritivo, disminuyendo el contenido de grasas, proteínas y carbohidratos. Además, alteran las características organolépticas y ocasionan muerte del embrión de maíz con las consecuentes pérdidas económicas que esto conlleva (Chavarri et al., 2009; Chavarri, 2010; Chavarri et al., 2014).
La toxicidad (aguda o crónica) de las micotoxinas varía considerablemente según la especie, la edad, el sexo y el estado nutricional, la dosis ingerida, la duración y repetitividad de la exposición. Se han reportado 125 casos de muertes por el consumo de micotoxinas en Makueni y Kenia en el 2004 por el consumo de maíz contaminado. Correlaciones epidemiológicas entre cáncer esofágico y presencia de piensos y alimentos contaminados por F. verticillioides han sido demostradas en África y en China (Payne, 1999; Martinez, 2009).
Son múltiples las alternativas para prevenir la colonización de mohos en granos y semillas, así como para remover o inactivar las micotoxinas contenidas en los mismos; sin embargo, la selección de genotipos y el mejoramiento para la resistencia a la incidencia fúngica resulta ser la más favorable debido a la gran variedad de factores que influyen sobre su deterioro (Chavarri, 2014). Esto hace que la prevención de su formación sea la estrategia principal en el campo con una selección adecuada de la metodología a emplear.
En tal sentido, se realizó la presente investigación con el objeto de determinar la incidencia de F. verticillioides y las fumonisinas en granos de híbridos de maíz blanco producidos en siembras experimentales y comerciales en los estados Yaracuy y Guárico, Venezuela.
Método
Origen de las muestras
Se evaluó la incidencia fúngica y el contenido de fumonisinas totales en muestras provenientes de 11 híbridos de maíz blancos cultivados en 22 parcelas de Yaracuy y Guárico. Los granos fueron cosechados durante el ciclo verano 2011-2012 y secados al sol hasta alcanzar un contenido de humedad promedio de 12-13%, medido con un determinador marca Motomco, modelo 919S. Posteriormente, los granos fueron trasladados para su análisis micológico al Laboratorio de Micotoxicología de la Facultad de Agronomía, Universidad Central de Venezuela, Campus Maracay.
Detección, cuantificación e identificación de F. verticillioides
La detección y cuantificación de mohos totales y por especie se realizó mediante el método de siembra directa. Se seleccionaron 100 granos enteros de cada muestra y se desinfectaron con hipoclorito de sodio (NaClO) al 3,27% durante 30 seg, bajo una campana de flujo laminar; luego, se eliminó el exceso de NaClO lavándose tres veces con agua destilada estéril. Los granos fueron sembrados en la superficie del medio agarificado malta sal agar (MSA, pH 5,8) e incubados por un período de ocho d a temperatura ambiente (27±2 °C) con alternancia de 12 h luz/oscuridad. Los resultados fueron expresados como incidencia (%) total de granos colonizados por mohos e incidencia (%) de colonización por especie, según la escala establecida por Mazzani et al. (1999) , definiéndose como baja la incidencia, por debajo de 15%, intermedia entre 15 - 30% y alta superior a 30%.
La confirmación de la identidad de los aislados de F. verticillioides y otras especies se realizó mediante la caracterización macroscópica de las colonias y el estudio morfométrico de las estructuras con interés taxonómico. Los resultados obtenidos fueron comparados con lo establecido en los manuales de identificación micológica y otros textos especializados (Singh et al., 1991; Samson et al., 1995).
Detección y cuantificación de fumonisinas
La detección de fumonisinas totales en granos de maíz blanco, se realizó mediante el método inmunoquímico Fumonitest (VICAM, EUA), fundamentado en la utilización de columnas monoclonales específicas para la detección de fumonisinas B1, B2 y B3.
La extracción de la micotoxina contenida en los granos se realizó mediante la homogenización de 50 g de maíz blanco molido (molienda seca) con 5 g de sal (NaCl) y 100 mL de solución metanol (80:20) durante 1 min. El extracto obtenido se filtró con papel Whatman N°1 y luego se tomó una alícuota de 5 mL para mezclarlo con 40 mL de buffer de lavado y filtrar nuevamente con papel microfibra de vidrio. Posteriormente, se tomó 10 mL del segundo filtrado y se colocó en una jeringa de vidrio para ser pasado gota a gota a través de la columna de inmunoafinidad. Transferidos los 10 mL del extracto, se procedió al lavado de la columna con 10 mL de buffer de lavado, 10 mL de buffer fosfato (PBS) + Tween 20 y 10 mL de agua destilada estéril. La elusión de la micotoxina se realizó añadiendo 1 mL de metanol grado HPLC. Finalmente se agregaron los reveladores (0,5 mL de OPA y 0,5 mL de 2-mercaptoetanol) para hacer a la micotoxina fluorescente y cuantificar su contenido a través del fluorómetro (BBI Source Sciencitic Inc. VICAM, EE.UU), previamente calibrado. Los resultados obtenidos fueron expresados en μg/g, considerándose altos los valores mayores a 1 μg/g (Trucksess, 1996; Scott y Trucksess, 1997; Mazzani et al., 1999).
Tratamiento Estadístico
El diseño utilizado fue de bloques completamente al azar, sin repeticiones en parcelas, conformadas por dos hileras de 5 m de largo cada una, con una distancia entre planta de 0,80 x 0,25 m entre hileras, para una densidad de 40 plantas/parcela. Los resultados obtenidos fueron analizados con el programa estadístico Statistics versión 8.0, mediante la prueba ANAVAR con un nivel de significancia de 0,05.
Resultados
Las especies fúngicas detectadas en los granos de híbridos de maíz blanco cosechados en Yaracuy y Guárico durante el ciclo de verano 2011 - 2012, fueron variables, identificándose especies potencialmente toxigénicas como F. verticillioides, A. flavus, A. Niger, A. ochraceus, A. terreus, Penicillium spp., Eurotium chevalieri, Curvularia spp., y Alternaria spp. Sin embargo, solo A. flavus presentó diferencias estadísticas significativas entre ambos estados.
Los granos provenientes de Yaracuy fueron colonizados con F. verticillioides, presentándose en el 90,91% de las muestras analizadas, con una incidencia promedio de 14,65%. Estos resultados coinciden con investigaciones previas desarrolladas en zonas productoras de maíz en Venezuela y otros países de América Latina (Mazzani et al., 2000; Peiretti et al., 2007; Mazzani et al., 2008; Chavarri et al., 2009; Figueroa et al., 2010; Barroyeta et al., 2013; Aguaysol et al., 2013; De la Torre et al., 2014).
El híbrido que mostró mayor resistencia a F. verticillioides fue D1B-246 con 0% de incidencia, seguido por los híbridos D2B-259, D1B-255, D1B-265, D2B-290 que presentaron una incidencia baja, mientras que los híbridos D1B-718, D1B-683, DK-357, D1B-270, D1B-348 y D1B-287 obtuvieron una incidencia intermedia (Tabla 1).
Tabla 1 Incidencia de Fusarium verticillioides (FV), Aspergillus flavus (AF), Penicillium spp. (PN) y concentración de fumonisinas (FUM) en granos de híbridos de maíz blanco cosechados en Yaracuy, ciclo de verano 2011-2012.
| HÍBRIDO | Yaracuy | Guárico | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| FV 1 | AF 1 | PN | FUM 2 | FV 1 | AF 1 | PN | FUM 2 | |
| DK-357 | 21,0 | 14,0 | 14,0 | 1,9 | 35,0 | 1,0 | 8,0 | 1,0 |
| D1B-270 | 22,5 | 14,5 | 3,5 | 1,5 | 16,0 | 0,0 | 3,0 | 3,1 |
| D1B-683 | 16,5 | 10,5 | 3,5 | 0,8 | 25,5 | 0,5 | 5,5 | 2,9 |
| D2B-290 | 11,0 | 21,0 | 3,0 | 3,2 | 12,0 | 0,0 | 1,0 | 3,4 |
| D1B-348 | 23,0 | 26,0 | 8,0 | 1,4 | 6,0 | 11,0 | 47,0 | 0,3 |
| D1B-265 | 11,0 | 24,0 | 7,0 | 5,1 | 18,0 | 2,0 | 0,0 | 2,5 |
| D1B-718 | 15,0 | 23,0 | 5,0 | 1,5 | 20,5 | 1,5 | 2,5 | 72,0 |
| D1B-246 | 0,0 | 12,5 | 1,0 | 0,4 | 2,0 | 17,0 | 19,0 | 1,5 |
| D1B-287 | 29,0 | 34,0 | 1,5 | 0,9 | 19,0 | 18,0 | 41,0 | 0,4 |
| D2B-259 | 3,0 | 49,0 | 1,0 | 1,6 | 15,0 | 3,0 | 4,0 | 4,0 |
| D1B-255 | 9,0 | 39,0 | 1,0 | 1,0 | 15,0 | 1,0 | 21,0 | 1,3 |
| Media | 14,6 | 24,3 | 4,4 | 1,8 | 16,7 | 5,0 | 13,8 | 8,4 |
| (1) Porcentaje de incidencia fúngica | (2) µg/g | |||||||
En Guárico, las especies toxigénicas detectadas fueron F. verticillioides (16,7%), Penicillium spp. (13,8%) y A. flavus (5,0%) (Tabla 1). Similar a las investigaciones previas realizadas por Barroyeta et al. (2013) y Chavarri et al. (2009) en cultivos experimentales y comerciales en Venezuela.
En el presente estudio todos los granos de híbridos de maíz blanco presentaron contaminación con fumonisinas, independientemente de la zona de producción. Las muestras provenientes del estado Yaracuy presentaron contaminación con fumonisinas en un rango de 0,4 a 5,1 µg/g. El híbrido D1B-246 presentó el menor contenido de fumonisinas (0,4 µg/g), lo que coincide con la baja incidencia de F. verticillioides en la muestra analizada (0%) (Tabla 1).
El rango de contaminación con fumonisinas en las muestras provenientes de Guárico osciló entre 0,3 y 72,0 µg/g. Sin embargo, los híbridos que mostraron mayor resistencia a la producción de la toxina fueron D1B-348 y D1B-287 con 0,3 y 0,4 µg/g, respectivamente, mientras que el híbrido D1B-718 fue el más susceptible, acumulando hasta 72 µg/g de la toxina (Tabla 1).
El contenido promedio de fumonisisnas fue mayor en los híbridos cosechados en Guárico (8,4 ppb) al comparar con Yaracuy (1,8 ppb) (Tabla 1).
Discusión
Las especies fúngicas identificadas en el presente estudio han sido reportadas en numerosas investigaciones desarrolladas en Venezuela, indicando una incidencia natural en la zonas bajo estudio (Mazzani et al., 2000; Luzon et al., 2007; Mazzani et al., 2008; Chavarri et al., 2009; Barroyeta et al., 2013). Además, los mohos identificados coincide con los reportados en México, donde el género con mayor incidencia fue Fusarium seguido por Aspergillus, Penicillium y Alternaria, identificándose siete especies de Fusarium, de las cuales F. verticillioides y F. sonali destacaron como las más frecuentes (Gallardo et al., 2006).
En México, unas de las especies detectadas en las principales zonas productoras de maíz fueron F. subglutinans, F. verticillioides, F. heterosporum, F. esquiseti, F. proliferatum y F. reticulatum, siendo F. subglutinans la especie más abundante. Sin embargo, en cuanto a patogenicidad,F. verticillioidesyF. subglutinansresaltaron como las especies más patogénicas para las razas de maíz utilizadas en dicho país (Figueroa et al., 2010).
El género Fusarium, se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza y forma parte de la microflora natural del suelo. Es considerado uno de los problemas más importantes en las zonas productoras de maíz a nivel mundial, debido a que puede afectar al cultivo en cualquier etapa de crecimiento, causando pudriciones en diversos órganos vegetativos de la planta, pero principalmente afecta a la raíz, tallo y mazorca (Hernández et al., 2007).
En los granos de híbridos de maíz blanco proveniente de Yaracuy la incidencia de F. verticillioides fue baja, mientras que en Guárico fue intermedia. Estos resultado coincide con lo reportado por Mazzani et al. (2008) en pequeñas explotaciones y conucos de algunos estados de Venezuela. Sin embargo, en ambos estados el híbrido más resistente a la colonización con F. verticillioides fue D1B-246, lo que sugiere su uso a nivel de campo, con el fin de reducir las pérdidas económicas ocasionadas por este importante patógeno.
La diferencia en los porcentajes de colonización de F. verticillioides en ambos estados sugiere la existencia de condiciones ambientales intrínsecas en cada estado que influyen sobre el proceso de infección y colonización del moho en los granos de maíz. Peiretti et al. (2007) mencionan que uno de los factores que influye sobre la susceptibilidad de los genotipos de maíz a la infección con F. verticillioides es la longitud de las brácteas, ya que los resultados obtenidos sobre 26,13% de los genotipos evaluados, indican que a medida que aumentó la longitud de la brácteas y el volumen de los granos, disminuyó significativamente el grado de susceptibilidad. Además, que las variaciones en el ambiente provocan una fuerte modificación en la expresión de los genes de resistencia.
Adicionalmente, el Reglamento 1881/2006 de la Unión Europea, afirma que las condiciones climáticas durante el crecimiento de la planta, en particular en el momento de la floración, tienen una gran influencia en el contenido de toxinas sintetizadas por Fusarium. Sin embargo, las buenas prácticas agrícolas, mediante las cuales se reducen a un mínimo los factores de riesgo, pueden prevenir hasta cierto punto, la contaminación por este moho.
Como la infección natural de las plantas de maíz porF. verticillioidesy la producción de fumonisinas ocurre desde el campo, las condiciones ambientales durante el período de cultivo son decisivos para regular los niveles de contaminación alcanzados en los granos durante la cosecha. Así mismo, las características de las plantas juegan un papel relevante tanto en la infección como en la acumulación de la toxina (Santiago et al., 2015). Por lo tanto, el uso apropiado de híbridos de maíz resistentes a la infección de Fusarium y sus fumonisinas, así como el control de condiciones ambientales críticas mediante prácticas agronómicas adecuadas, son herramientas esenciales para reducir la contaminación de los granos con fumonisinas por debajo de los niveles de seguridad establecidos.
El Reglamento N° 1126/2007 de la Comisión Europea establece como límite máximo de fumonisinas (B1+B2) en maíz no elaborado, 4000 µg/g, ya que durante el proceso de industrialización parte de la micotoxina puede ser removida del grano. En los cereales para el desayuno y aperitivos a base de maíz el límite permitido es 800 µg/g, mientras que en los alimentos destinados a los grupos más susceptibles, como los niños de corta edad y los lactantes, el límite máximo es 200 µg/g. En los alimentos a base de maíz destinados al consumo humano directo de la población en general, se acepta hasta 1000 µg/g.
En el presente estudio todos los híbridos de maíz blanco evaluados mostraron contaminación con fumonisina. Los contenidos promedios más elevados se detectaron en los híbridos provenientes de Guárico; sin embargo, no sobrepasaron los límites máximos establecidos por la Comisión Europea. Las concentraciones de fumonisinas en las muestras evaluadas representan un alto riesgo para la salud humana y animal, especialmente por el aumento de la demanda de maíz para la elaboración de productos artesanales derivados de esta materia prima, especialmente la masa artesanal.
Con base en la baja incidencia de F. verticillioides detectada en el híbrido D1B-348 proveniente de Guárico y a su bajo contenido de fumonisina, se recomienda su uso a nivel de campo como medida preventiva para el control del patógeno y la consecuente contaminación con fumonisina.
En el caso de Yaracuy, se recomienda el uso del híbrido D1B-246, ya que no se detectó la presencia de F. verticillioides y además presentó los niveles más bajo de fumonisina. Sin embargo, la presencia de esa baja concentración de fumonisina puede atribuirse a la presencia de otras especies productoras de la micotoxina, como A. Niger. Ochoa et al. (2015), demostraron la capacidad fumonigénica de diferentes aislados de A. Niger provenientes de maíz, arroz, girasol, caraota y maní, donde el aislado de maíz produjo 3,3 µg/g. Así mismo, se ha demostrado la capacidad fumonigénica de diferentes cepas de A. Niger utilizadas a nivel industrial para la obtención de enzimas, ácidos orgánicos, entre otros (Frisvad et al., 2011).
La presencia de A. flavus en las muestras evaluadas es un problema de primer orden ya que éste moho es el principal productor de aflatoxinas. Por lo tanto, es necesario el monitoreo riguroso y continuo del contenido de aflatoxinas en granos de maíz, porque este cereal forma parte de la dieta del Venezolano, y si está contaminada con las aflatoxinas, puede ocasionar un riesgo de salud pública. Además, las condiciones imperantes en Venezuela, propias de áreas tropicales, favorecen la proliferación de hongos y la síntesis de ésta toxina en granos de maíz (Mazzani et al., 1999; Chavarri, 2014).
