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Introducción
El control biológico de nematodos a través de hongos nematófagos es una alternativa prometedora para el manejo de los parásitos de las plantas (Duponnois et al., 2001; Sorbo et al., 2003; Singh et al., 2007). Por tanto se han realizado estudios extensos de su taxonomía, filogenia, biología y ecología (Cooke 1963; Kerry 1987; Sayre y Walter 1991; Sikora 1992; Morton et al., 2004; Dong y Zhang 2006). Son considerados un grupo importante de microorganismos del suelo que pueden suprimir las poblaciones de nematodos parásitos de las plantas y animales. Se clasifican cuatro grupos de manera general en base a los mecanismos de ataque a los nematodos a) trampeo de nematodos: estos utilizan mecánicamente nódulos o hifas adhesivas, pertenecen a un grupo de ascomicetos asexuales con especies definidas por su tipo de dispositivos de captura (Scholler et al., 1999; Li et al., 2005; Yang y Liu, 2006; Yang et al., 2007); b) hongos endoparásitos usando sus esporas; c) los hongos que utilizan las puntas de sus hifas para invadir hembras y huevecillos; y d) hongos productores de toxinas que inmovilizan a los nematodos (Kendrick, 2001; Liu et al., 2009).
El control químico sigue utilizándose como la opción más rápida para enfrentar los problemas fitosanitarios. Sin embargo, la implicación ambiental es un tema muy discutido actualmente, y ante este panorama, el control biológico, surge como una alternativa promisoria en el control de patógenos y plagas incluidos los nematodos fitoparásitos. Los hongos nematófagos son habitantes del suelo que utilizan sus esporas o micelio para infectar nematodos vermiformes. Se les encuentra en diferentes tipos de sustratos y son capaces de sobrevivir en condiciones climáticas o nutricionales extremas en diferentes regiones geográficas del mundo (Gray y Soh, 1989). Su abundancia varía de 1, 8 y 150 propágulos por gramo de suelo y esto obedece principalmente a la cantidad de materia orgánica, contenido de agua, tipo de suelo, temperatura y presencia de nematodos hospederos (Persmark y Jansson, 1997).
Los antagonistas de estos nematodos han sido localizados en un amplio rango de organismos que incluyen hongos, bacterias, virus, plantas, protozoarios, turbelarios, tardígrados, ácaros e inclusive otros nematodos. Jansson y Lopez-Llorca (2001) afirman que de una a cinco especies de estos microorganismos son recuperadas de una muestra de suelo. Dentro de este amplio grupo de hongos nematófagos, los más importantes en la regulación de poblaciones de nematodos son algunas especies de los géneros: Arthrobotrys, Dactylella, Dactylellina, Gamsylella, Drechslerella, Monacrosporium, Monacrosporiella, Nematoctonus, Stylopage, Stropharia, Didymozoophaga (Chen y Dickson, 2004). Desde la descripción de Arthobotrys oligospora por (Zopf, 1988), se han realizado muchos estudios acerca de la taxonomía, ecología y fisiología de estos hongos. Más de 200 especies de hongos nematófagos han sido descritas; un grupo con un alto potencial para ser usadas como agentes de control biológico para la supresión de nematodos fitoparásitos (Qadri, 1989; Qadri y Seleh, 1990; De Leij y Kerry, 1991; Khan y Akram, 2000; Kerry, 2000). El presente estudio contribuye al conocimiento de hongos en nematófagos y el primer reporte de varios aislamientos, obtenido en el norte de Sinaloa, como una alternativa el manejo integrado del nematodo formador de nódulos en raíz Meloidogyne spp.
Materiales y métodos
Zona de estudio
Se muestrearon cuatro regiones productoras de chile Bell Pepper cv Lorca (Capsicum annuum L.) ubicadas en el Valle del Fuerte, Sinaloa (Figura 1). Las muestras de suelo fueron colectadas de la rizosfera en áreas naturalmente infestadas por el complejo de especies de Meloidogyne, durante el ciclo agrícola 2013-2014 primavera verano y otoño invierno, el cultivo a muestrear se determinó por dos factores, 1) producción bajo condiciones de invernadero casa sombra; y 2) productores cooperantes para realizar y seleccionar los sitios de muestreo, cada muestra compuesta consistió de 2.5 kg, de suelo, las etapas de muestreo en el cultivo fueron en los estados de desarrollo a los (0-30 ddt) inicial, (60 y 90 ddt-madurez de fruto) intermedio y (120 ddt-cosecha) final del cultivo en las regiones de los Ejidos: Las Panguitas (25° 54᾽ 56.65” latitud norte 108° 50᾿16.70” longitud oeste), Campo 35 (25° 49᾿ 32.02” latitud norte 108° 54᾿ 20.77” longitud oeste), Jiquilpan (25° 47᾿ 41.4” latitud norte 108° 55᾿ 52.8” longitud oeste) y Estación Bamoa (25° 50᾿ 11.33” latitud norte 108° 54᾿ 37.2” longitud oeste), en condiciones protegidas cuyos sitios agrícolas se encontraron establecidos con chile cv Lorca Bell Pepper susceptible a Meloidogyne spp. Con el fin de obtener un mayor número de aislamientos de hongos nematófagos en los sitios muestreados, se procesaron bajo dos métodos por separado embudo de Baermann y tamizado de Cobb.
Procedimiento de muestreo
En total se realizaron 20 visitas de campo. Para el aislamiento de larvas parasitadas y hongos nematófagos del suelo, se delimitaron en cada malla sombra para cada región, áreas reconocidas con problemas del nematodo agallador, en cuyo interior se seleccionaron dos áreas de muestreo de 140 m2, separadas entre si por una distancia de 1.6 m, reconocidas como altamente infestadas; es decir cada área consistió de 28 m de longitud por 5 m ancho. En cada región y área determinada se muestreó con la ayuda de una barrena modelo LS Soil Sampler de 91.4cm con un tubo de muestreo de 27.5 cm se colectaron 25 submuestras en zig-zag dentro del área con problema del nematodo agallador, a una profundidad de 25 cm, obteniendo en promedio de 2 a 2.5 kg de suelo por muestra compuesta almacenadas en bolsas de polietileno en el interior de una hielera debidamente etiquetadas y trasladadas al Laboratorio de Nematología de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte de la Universidad Autónoma de Sinaloa, para procesarlas. Se determinaron las coordenadas geográficas en cada invernadero tipo casa sombra mediante un geoposicionador marca Etrex®, Garmin.
Recolecta de nematodos
Se recolectaron muestras de suelo de la raíz del cultivo de chile c.v. Lorca Bell Pepper dentro áreas naturalmente infestadas por el complejo de especies de Meloidogyne, durante el ciclo primavera verano. Las muestras de suelo fueron recolectadas en la etapa de madurez del fruto (60 y 90 días después del trasplante) y final de cosecha (120 días), con la ayuda de una barrena modelo LS Soil Sampler se colectaron 25 submuestras en zig-zag dentro del área con problema del nematodo agallador, a una profundidad de 25 cm, obteniendo en promedio de 2 a 2.5 kg de suelo por muestra compuesta. El método utilizado para la extracción de larvas parasitadas de nematodos fue el embudo de Baermann modificado según (Christie y Perry, 1951) consiste en suspender el suelo en un determinado volumen de agua, y después de un corto período de reposo, la suspensión se vierte sobre un juego superpuesto de tamices de 100 y 400 mallas Duves® . El suelo retenido en el tamiz más fino, se transfiere a un cilindro con fondo de tela, que posteriormente se coloca en el embudo. Después de 24 a 48 h, todas las formas activas de nematodos han pasado a través de la tela o papel y pueden ser recogidas en un pequeño volumen de agua al retirar la pinza mohr de la manguera y posterior se observaron bajo un microscopio compuesto marca Nikon Eclipse E200, los nematodos que demostraron parasitismo se colectaron con la ayuda de una micropipeta 10 a 100 μL eppendorf®, y se colocaron en placas con medio agua-agar 5 g L-1 (A-A) (Barron, 1977).
Recolecta de hongos
Se recolectaron muestras de suelo de la raíz del cultivo de chile c.v. Lorca Bell Pepper dentro áreas naturalmente infestadas por el complejo de especies de Meloidogyne, a una profundidad de 25 cm, durante el ciclo otoño invierno (O-I), en la etapa de madurez del inicial (0 y 30 días después del trasplante) e intermedio (60 días), con la ayuda de una barrena modelo LS Soil Sampler se colectaron 25 submuestras en zig-zag dentro del área con problema del nematodo agallador, a una profundidad de 25 cm, obteniendo en promedio de 2 a 2.5 kg de suelo por muestra compuesta, debidamente etiquetadas se trasladaron al Laboratorio de Nematología. El método utilizado fue el tamizado de Cobb (Staniland, 1954); es decir, cada muestra de suelo, se homogenizó con agua en una cubeta de 19 L, después el volumen de suelo se deposito en otra cubeta pasando a través del tamiz de 80 mallas Duvesa®, desechándose el sedimento y lo obtenido en el tamiz para eliminar piedras y materia orgánica de gran tamaño difícil de manipular en cajas de Petri, posteriormente se hizo pasar el sobrenadante a través del tamiz de 200 mallas Duvesa®, el material retenido en el tamiz fue recolectado con la ayuda de una piceta Cienceware ®, a un vaso de precipitados de 500 ml Pyrex ®, eliminando la mayor cantidad de agua a través de un tamiz de 500 mallas Duvesa ® y con la ayuda de una espátula se realizó un estriado con 1 g de suelo tamizado en las placas de agua-agar 5 g L-1 (A-A).
Aislamiento de hongos nematófagos
Esta fase se llevó a cabo en el Laboratorio de Nematología en la Escuela Superior de Agricultura Valle del Fuerte. Las muestras de suelo se procesaron mediante el método de “espolvoreado en placa” descrito por Barrón (1977) para el aislamiento de hongos nematófagos. La técnica consistió en utilizar por cada área de muestreo, cinco repeticiones colocando en cajas Petri de 9 cm de diámetro con agua-agar (A-A) y 1 g de la muestra de suelo tamizado. Con la ayuda de una espátula se realizó un estriado en la placa (A-A). Las cajas se incubaron a temperatura ambiente (27-30 ºC) y luz fluorescente. A partir del cuarto día de incubación las cajas se observaron diariamente con un microscopio estereoscópico Labomed Luxeo 4Z®, en busca de hifas, conidios, esporas o nematodos parasitados (Figura 2).
Figura 2 A) Estriado en placa (agua-agar); B) Dos tipos de medios específicos para el estriado; C) Nematodo de vida libre parasitado; D-E) Larvas de Meloidogyne spp., parasitadas; y F) Crecimiento de hongo Dactylella en medio especifico agar-harina de maíz (CMA).
Las observaciones se realizaron por una semana más con el fin de aumentar la posibilidad de encontrar alguna estructura fúngica. Una vez observada la posibilidad de presencia de hongos nematófagos, se procedió a su aislamiento y purificación. Con la ayuda de una micropipeta de 10 a 100 μL eppendorf® y la observación bajo un microscopio compuesto, se tomaron conidios, micelio o nematodos parasitados y se colocaron en medio agar harina de maíz (CMA) (cornmeal-agar) Bbl™ 17 g L-1, con cloramfenicol Vixim® al 0.1% (p/v) (Núñez, 2002a), para evitar el crecimiento de bacterias, adicionalmente se preparo otro medio especifico CMA 17 g L-1 más el reactivo rosa de vengala Faga-lab® al 5 g L-1, de acuerdo a lo descrito por (Peréz et al., 2007) para el crecimiento especifico de Pochonia chlamydosporia. Las muestras se incubaron a temperatura ambiente (27° a 30C) y una semana después se verificó el crecimiento de los hongos respecto a los crecimientos en medio (CMA + rosa de vengala) no se observo crecimiento alguno; sin embargo, en las placas con medio agua-agar se observó crecimiento de micelio, las colonias obtenidas fueron transferidas en medio (CMA + cloramfenicol Vixim® al 0.1% (p/v) (Núñez, 2002) para su purificación y posteriormente en medio CMA 17 g L-1, sin antibiótico para su replicación. Los hongos identificados se conservaron en tubos de ensaye de 20 ml KIMAX®, con medio CMA inclinado y aceite mineral Faga-lab® a 4 ºC para su posterior utilización en pruebas patogenicidad (Kerry, 2001). Los tiempos de aparición de hongos nematófagos varían considerablemente, y con el fin de recuperar la mayoría de las especies en una muestra en particular, las placas deben ser examinadas diariamente durante un máximo de diez días para asegurar encontrar los posibles hongos nematófagos del suelo incluyendo los de crecimiento lento (Barron, 1978).
Identificación de hongos nematófagos
Se prepararón montajes semipermanentes por el método muestra entre dos vidrios (Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1972; Connell y Padgett, 1988), la cual consiste colocar en cada portaobjetos Fisherfinest® (25 x 75 x 1 mm) se agrego una delgada sección de agar que contiene las estructuras fúngicas de cada uno de los hongos aislados cubierto por cubreobjetos Fisherfinest® superslip (24 x 50 mm) (Shephered, 1995). Las preparaciones e identificaciones de hongos nematófagos se estudiaron por observación directa en un microscopio compuesto marca Nikon Eclipse E200 a diferentes aumentos debido a que algunas estructuras son accesibles en aumentos menores, se compararon estructuras como son: micelio en crecimiento, conidióforos y conidios, las estructuras de trampeo solo fue posible observarlas al momento de transferir y purificar los hongos colectados en placas en medio agar-harina de maíz sin antibiótico (CMA) y agregarles nematodos fitoparasitos y “vida libre”, la toma de microfotografías se realizo con el microscopio de contraste de interferencia Nomarski en el Laboratorio de la Universidad de California Campus Riverside.
La identificación taxonómica de los hongos nematófagos se realizó mediante la utilización de las claves propuestas por (Cooke y Godfrey, 1964; Barnett y Hunter, 1998). La cual depende de (conidios forma, septos y tamaño) y la presencia o ausencia de clamidosporas (Drechsler, 1937). La colección de hongos nematófagos identificados se encuentra depositada en el Laboratorio de Nematología de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte. Se conservan en tubos de ensaye de 20 ml KIMAX®, con medio CMA inclinado y aceite mineral Faga-lab® a 4 ºC, técnica que disminuye la deshidratación del medio, retarda la actividad metabólica y reduce la posibilidad de infección por ácaros (Jong y Atkins, 1985).
Figura 3 Microfotografías de hongos nematófagos aislados de suelo de zonas productoras de chile Bell Pepper en el Valle del Fuerte, Sinaloa. A - C) Clamidosporas, conidios y anillos no constrictores de Dactylella; D y E) Nódulos y micelio adhesivo de Nematoctonus e inciso; y F) Red de hifas y conidio de Arthrobotrys.
Resultados y discusión
Se obtuvieron 15 aislamientos de hongos asociados al cultivo de chile Bell Pepper de cuatro zonas productoras del Valle del Fuerte, 14 fueron identificados y uno más se clasificó como micelio estéril ya que no produjo estructuras de reproducción que facilitaran su identificación, se aislaron 11 géneros, basado en sus descripciones microscópicas y aspectos morfológicos como fitoparásitos. El género aislado con mayor frecuencia fue Fusarium, con 25%, seguido de Phytophthora, 19%, Sclerotinia, 13%, F. oxysporum 9%, Phythium, 8%, Aspergillus, 6%, Trichoderma, 5%, Fusarium moniliforme 5%, Corynespora, 5%, Geotrichum, 3%, Rhizoctonia, 2%. Algunos de estos géneros como Fusarium, Sclerotinia y Phytophthora, son considerados patógenos del cultivo sin acción deletérea sobre nematodos. Con respecto al manejo de nematodos fitopatógenos, los hongos nematófagos asociados a suelos infestados por Meloidogyne spp., se aislaron tres géneros basado en sus descripciones microscópicas y aspectos morfológicos, el género más frecuente aislado e identificado fue Dactylella, 11%, Arthrobotrys, 5% y Nematoctonus, 4%. En el ejido Las Panguitas fue donde se presentó el mayor número de hongos aislados (57%), seguida del “Campo 35” (21%), Jiquilpan con (12%) y Estación Bamoa con el 10%. Adicionalmente al porcentaje de hongos nematófagos obtenidos de los sitios Las Panguitas y “Campo 35” se han adoptado prácticas culturales como la rotación de cultivos al termino de la cosecha, con pastos forrajeros, crotalaria y rábano. Por su parte (Velasco, 2002), encontró que la adición de materia orgánica mejora considerablemente las propiedades del suelo.
Al incorporar abonos orgánicos se ha registrado un efecto positivo en las poblaciones de bacterias, actinomicetos y hongos benéficos estos resultados coinciden con lo reportado por otros autores (Sánchez et al., 1987; Álvarez-Solís et al., 1992). (Hajieghrari et al., 2008) confirmaron que el pH, la temperatura y materia orgánica son parámetros clave en el crecimiento, esporulación y la capacidad saprófita de los hongos. Otros trabajos reportados (Capstick et al., 1957; Giuma y Cooke, 1972) afirman que los nematodos que viven en suelos normalmente serán colonizados por hongos parásitos, por lo tanto, se pueden aislar mediante la extracción de los nematodos del suelo y transferidos en agar a bajas concentraciones. En estudios previos (Hidalgo et al., 2000; Flores et al., 2007; Pérez et al., 2007; Flores et al., 2008; Franco et al., 2009) han obtenido aislamientos de hongos nematófagos con un alto potencial de parasitismo promisorios al reducir las agallas en raíces de jitomate (Huang et al., 2004; Gan et al., 2007) confirman que las quitinasas en hongos nematófagos degradan los componentes quitinolíticos en los huevecillos de los nematodos de la raíz.
Estos aislados son semejantes al trabajo obtenido por (Verdejo et al., 2002), encontraron Dactylella ovi-parasitica, Pochonia chlamydosporium y P. catenulatum, asociados a masas de huevos de Meloidogyne spp. (Nuñez, 2002) comprobó la presencia de tres especies de Cladosporium spp., asociados a quistes de Globodera rostochiensis en el cultivo de papa (Solanum tuberosum L.) en la región del Cofre de Perote, Veracruz (Yang et al., 2012) reporta a Dactylella como un hongo promisorio en el parasitismo de huevos de la familia Heteroderidae. Resultados semejantes deportan a Dactylella como viable en el parasitismo de hembras jóvenes lo cual reduciría la ovipostura de huevecillos de Meloidogyne spp. (Smith et al., 2011). Otros trabajos realizados por (Timper et al., 1993) demuestran poca virulencia de Nematoctonus es por ello que se sugiere pruebas de patogenicidad y comprobar su efectividad bilógica en fitonematodos de la región.
(Persson et al., 1993) afirman que los aislados de hongos nematófagos como Arthrobotrys dactyloides y A. superba, tienen la capacidad de colonizar las raíces de las plantas de tomate resultando un control biológico eficaz. Estudios anteriores, (Stirling y Mani, 1995; Galper et al., 1995; Jaffee y Muldoon, 1997; Jacobs, 1997; Stirling et al., 1998) reportan la capacidad de Arthrobotrys de suprimir a Meloidogyne spp. Los resultados obtenidos coinciden con trabajos donde Meloidogyne se encuentra asociado a microorganismos benéficos del suelo (Gallegos et al., 2009).
Conclusiones
La existencia de hongos nematófagos asociados a cultivos afectados por Meloidogyne spp., se confirmó en tres de las cuatro regiones estudiadas. Es importante mencionar, que para el aislado de hongos nematófagos existen otras metodologías como la técnica de centrifugación diferencial, biología molecular, las cuales pueden favorecer a futuros trabajos para obtener diversidad de hongos particularmente los endoparásitos, obligados o altamente específicos, promisorios en la búsqueda del manejo biológico de las poblaciones de Meloidogyne spp., reportadas para Sinaloa.
