Zona de estudio

Los muestreos se realizaron en el Valle del Yaqui, ubicado en el sur del estado de Sonora, en cuatro predios agrícolas distintos y donde fueron sembradas dos variedades de algodonero genéticamente modificado, durante el ciclo 2014 (Cuadro 1).

En cada predio también se sembró una variedad que no expresa las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab, como refugio.

Toma y preparación de la muestra

Se tomaron muestras de hojas en seis fechas, en las primeras cuatro fechas también se tomaron muestras de cuadros y las bellotas fueron recolectadas en las últimas dos fechas. La toma de muestra de tejido vegetal se realizó a la altura del tercer nudo de arriba hacia abajo. Para la detección inmunológica se tomó un total de 120 muestras, correspondiendo a 60 de hojas, 40 de cuadros y 20 de bellotas, de éstas 24 (12 de hoja, ocho de cuadro y cuatro de hoja) fueron del refugio. Para la detección génica solo se tomaron muestras en tres fechas, tomándose cinco muestras en cada ocasión, de cada campo, las cuales fueron procesadas en forma independiente.

Para el caso de la hoja se tomó en cuenta que estuviera completamente desdoblada e integra, para cuadro y bellota se cuidó que no tuvieran alguna alteración al momento del muestreo. Se tomaron 30 mg de tejido de hoja, 80 mg de tejido de cuadro y 9 mg de tejido de bellota, todo en fresco. Para las pruebas de detección inmunológica los tejidos se procesaron en fresco con su respectivo buffer de extracción y se procedió a la maceración. Para la detección génica los tejidos se pusieron en contacto con nitrógeno líquido y se trituraron con la ayuda de un micropistilo estéril.

Tiras de flujo lateral

Antes de proceder a la cuantificación proteica y génica, se evaluó la presencia de las proteínas transgénicas mediante el uso de tiras de flujo lateral, siguiendo la metodología sugerida por el fabricante (EnviroLogix, Portland, ME, USA). Para ello en un tubo de 1.5 mL se realizó una muestra compuesta de cinco porciones de los distintos tejidos de algodonero, se le añadieron 0.5 mL de búfer de extracción para análisis de hoja y 1.5 mL para cuadro y bellota. Se homogenizó la muestra con la ayuda de un micropistilo. Posteriormente, se introdujo una tira dentro del tubo y se dejó por 10 min para observar e interpretar los resultados. Las muestras que resultaron positivas se pasaron al análisis mediante la prueba Elisa y PCR en tiempo real.

Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (Elisa)

Se realizó una prueba tipo ‘sandwich’ para ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (Elisa) siguiendo el protocolo del Kit QualiPlate AP 051 de EnviroLogix. Para las curvas de calibración se utilizaron cinco estándares en concentración de 3.13, 6.25, 12.5, 25 y 50 ng mL^-1 de proteína Cry1Ac y Cry2Ab. Se mezcló el contenido de los pozos y posteriormente se colocó en incubación a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación se agitó el contenido de los pozos, se inundaron los pocillos por completo con el búfer de lavado, luego se vació. Se repitió este paso de lavado tres veces.

Se añadieron 100 μL de p-nitrofenil fosfato (sustrato S1) a cada pocillo, se mezcló y se incubó a temperatura ambiente por 30 min. Se leyó en el espectro SpectrOstar Nano (BMG Lab Tech, Ortenberg, Alemania) a 405 nm para la proteína Cry2Ab. Se realizaron cuatro lavados para añadir posteriormente 100 μL de 3,3’, 5,5’-tetrametilbencidina (sustrato S2) a cada pocillo, se incubó a temperatura ambiente por 30 min y se leyó a 650 nm para Cry1Ac. La interpretación de los resultados se realizó con base en las absorbancias de cada muestra analizada (Cuadro 2).

Extracción de ARN a partir de tejidos vegetales

El tejido vegetal a analizar se colocó en un tubo de 1.5 ml y se añadieron 500 µL de PureLink^® Plant RNA Reagent (Life Technologies™, Carlsbad, California, USA), posteriormente se homogenizó. Se incubaron las muestras por 5 min a temperatura ambiente manteniendo el tubo de manera horizontal para máxima extracción. Se centrifugaron a 14 000 RPM por dos min a 4 °C y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo estéril. Se añadieron 100 µL de NaCl 5M para clarificar. Se adicionaron 300 µL de cloroformo y se mezcló vigorosamente.

Se centrifugó a 14 000 RPM por 10 min a 4 °C y se transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo estéril. Se precipitó el RNA con un volumen igual de isopropanol frío 100% a la fase acuosa que se separó y se mezcló por inversión. Se incubó por 10 min a temperatura ambiente. Se incubó a temperatura ambiente por 10 min y posteriormente se centrifugó a 14 000 RPM por 10 min a 4 °C. Se decantó el sobrenadante del tubo dejando el pellet de RNA, para el lavado se añadieron 500 µL de etanol al 75%, se agitó y se centrifugó a 14 000 RPM por cinco min a 4 °C, posteriormente se secó el pellet de RNA por aproximadamente 5-10 min y se procedió a la resuspensión con 50 µL de agua DEPC mezclando con la micropipeta. Se dejó resuspender a 4 °C y posteriormente se procedió a determinar la concentración y pureza de la extracción.

Síntesis del cADN por transcripción reversa

La retrotranscripción se realizó empleando el kit GoTaq^® Probe 2-Step RT-qPCR System (Promega, Madison, Wisconsin, USA) y se llevó a cabo en tubos para PCR de 0.2 mL conteniendo la siguiente mezcla por cada reacción: 2 µL de ARN (200 ng), 1 µL de oligo (dT)15 primers, 1 µL de primers aleatorios y 3 µL agua libre de RNAsas/DNAsas para completar un volumen de 7 µL. Se desnaturalizó el ARN y primers en un block de calentamiento a 70 °C por 5 min, se colocó inmediatamente en hielo por 5 min y posteriormente se centrifugó por 10 s.

Para la alineación y síntesis de cADN se añadieron los siguientes componentes: 4.9 µL de agua libre de RNAsas/DNAsas, 4 µL del búfer de reacción GoScript 5X, 1.6 µL de MgCl2, 1 µL de nucleótidos, 0.5 µL de RNasin recombinante como inhibidor, 1 µL de transcriptasa reversa GoScript, para completar un volumen de 13 µL y adicionarlo a los 7 µL del paso de desnaturalización. Para la alineación se colocaron a 25 °C por 5 min, para la elongación a 42 °C por 45 min y para inactivar la transcriptasa reversa a 70 °C por 15 min. Se procedió al RT-PCR o se almacenaron a -20 °C.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR)

La amplificación por PCR en tiempo real se llevó a cabo en tubos para PCR de 0.2 mL con la siguiente mezcla por cada reacción para las muestras: 2 µL de ARN (200 ng), 7 µL de agua libre de RNAsas/DNAsas, 10 µL de GoTaq^® Probe qPCR Master Mix (Promega, Madison, Wisconsin, USA) y 1 µL del mix de primer/probe (300 nM), obteniendo un volumen de 20 µL por cada reacción.

Para realizar las curvas de calibración la mezcla para cada reacción fue la siguiente: 5 µL de cada punto de la curva, 4 µL de agua libre de RNAsas/DNAsas, 10 µL de GoTaq^® Probe qPCR Master Mix y 1 µL del mix de primer/probe (300 nM), para obtener un volumen final de 20 µL por cada reacción. Todas las muestras fueron analizadas en el sistema 7500 Fast Real-Time PCR (Life Technologies™, Carlsbad, California, US) bajo las condiciones que se muestran en el Cuadro 3. Los primers utilizados para la amplificación en cada una de las reacciones se muestran en el cuadro 3.

Para la cuantificación se realizó una curva de calibración mediante diluciones seriadas a partir de una concentración inicial de 200 000 copias por microlitro (Cuadro 4 y 5).

Análisis de resultados

Los resultados obtenidos en la detección proteica se analizaron mediante un análisis de varianza (Anova), basado en un modelo lineal de efectos fijos para una p< 0.05, a partir de las medias obtenidas en los análisis. Se tomó como fuente de variación las fechas (seis niveles), sin interacción con las variedades ni los sitios, elementos que fueron tomados solamente para elevar el tamaño de la muestra. Para la conformación de las curvas de calibración de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab se realizó un análisis de regresión lineal simple, presentando, la ecuación de regresión y el coeficiente de determinación. Los resultados obtenidos en la detección génica se analizaron mediante la evaluación de medianas en la Prueba de Kruskal-Wallis con una p< 0.05. Se utilizó el paquete estadístico Statgraphics Centurion XV (StatPoint Technologies, Inc.).

Detección inmunológica

Tiras de flujo lateral

Previo a los análisis por ELISA y RT-qPCR se realizaron los análisis por inmunocromatografía, resultando positivas 96 de las 120 muestras recolectadas y que presuntamente expresaban la proteína Cry1Ac y Cry2Ab. ^{Dohare y Tank (2014)} detectaron la presencia de las mismas proteínas, que se buscaban en este estudio, mediante el análisis de un total de tres variedades de algodonero genéticamente modificado de la línea Bollgard II^®. Mientras que ^{Larbouga et al. (2013)} utilizaron la misma herramienta para un estudio similar cinco variedades de algodonero de la misma línea.

Esta tecnología permite que los anticuerpos inmovilizados y específicos para cada proteína se incorporen a una tira de nitrocelulosa acoplados a una molécula que reaccionará ante la presencia de las proteínas analizadas (^{Lipton et al., 2000}; ^{Wang et al., 2007}). Es por ello que esta herramienta es ampliamente utilizada en la actualidad debido a la rapidez y facilidad para la obtención de resultados, ya sea en campo o en laboratorio.

Parámetros de calidad en Elisa

Para la verificación de la linealidad y la cuantificación de las proteínas transgénicas se realizaron curvas de calibración con cinco concentraciones conocidas a distintos niveles. Para la proteína Cry1Ac se obtuvieron R² superiores a 0.99, lo mismo para la proteína Cry2Ab. Los valores de R² recomendados para asegurar la linealidad del método es ≥0.99, concordando con los resultados obtenidos por ^{Shan et al. (2007)}, en la construcción de curvas para la cuantificación de la proteína Cry1Ac en distintos tejidos de algodonero. En la Figura 1 se muestra las linealidades del sistema de la curva de calibración para las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab.

Figura 1 Curvas de calibración para la prueba Elisa de las proteínas, a) Cry1Ac y b) Cry2Ab.  

La exactitud y precisión del método se evaluó realizando todos los análisis por duplicado de cada una de las muestras cuantificadas. ^{Karuri et al. (2013)} obtuvieron coeficientes de variación menores al 15%, similar a los obtenido en este estudio, lo que refleja la calidad de los resultados.

Cuantificación de proteínas Cry a través de Elisa

Los resultados de los análisis de la cuantificación de la expresión proteica para Cry1Ac y Cry2Ab en los cuatro predios analizados, en seis momentos y dos cultivares distintos, arrojaron una tasa de expresión la cual disminuyó a lo largo del tiempo, con diferencias altamente significativas (p< 0.0025 para Cry1Ac y p< 0.0045 para Cry2Ab), llegando a niveles a los cuales no pudo ser detectada, esto para los casos de cuadro y bellota. El nivel mínimo de proteína Cry1Ac cuantificado en hoja (Cuadro 5) fue de 0.3 μg g^-1, mientras que en cuadros y bellotas (Cuadro 6 y 7) la tendencia ocurrió a cero, al resultar indetectable en el predio 5 de febrero.

Los niveles máximos de expresión ocurrieron en hoja, encontrándose hasta 8.5 μg g^-1 en etapas tempranas del cultivo, mientras que en cuadros y bellotas fue de 2.5 μg g^-1. ^{Greenplate et al. en 2003}, en un estudio similar con la variedad de algodonero MON-15985, lograron la determinación de la proteína Cry1Ac; a través, de la prueba Elisa, obteniendo valores promedio de 4.8 μg g^-1 en tejido de hoja, resultados muy similares a los obtenidos en este estudio.

En el análisis de expresión de las proteínas conferidas a los cultivos GM es importante tener presente su relación directa con el crecimiento y desarrollo de la propia planta y que ambos son influidos por factores ambientales. La temperatura, luz, salinidad, disponibilidad de agua, estado nutricional e interacciones ambientales (con agentes bióticos de su entorno) se identifican como los principales factores ambientales que afectan las condiciones de cultivo y por lo tanto el desarrollo de las plantas y su composición (^{Sivasupramaniam et al., 2008}; ^{Jamal, 2009}; ^{Knight et al., 2013}).

Según ^{Kranthi et al. (2005)}, la proteína Cry1Ac tiende a variar entre los distintos híbridos y los diferentes tejidos de la planta, encontrándose los niveles más altos en hojas terminales, seguido de cuadros, bellotas y por ultimo las flores. Dicha variación fue observada claramente a lo largo de los muestreos y análisis realizados. Un comportamiento muy similar fue el observado y cuantificado con la proteína Cry2Ab en todos los tejidos analizados. Los niveles más altos se cuantificaron en hoja con 74 μg g^-1 en etapa vegetativa, mientras que en etapas tardías se obtuvieron niveles inferiores de hasta 8.5 μg g^-1, sin llegar a niveles indetectables. En cuadro y bellota se obtuvieron niveles similares a los de hoja en etapas tempranas, cuantificando hasta 92.6 μg g^-1 mientras que en etapas tardías se obtuvieron niveles de hasta 0.3 μg g^-1 (^{Knight et al., 2013}).

Detección génica

Extracción y determinación de la concentración y pureza de ARN a partir de tejidos vegetales

La absorbancia a 260 nm y la relación A260/280 nos da una indicación de la cantidad de RNA y del grado de contaminación de impurezas orgánicas e inorgánicas. Se obtuvieron extractos de ARN a partir de tejidos de hoja, cuadro y bellota con relaciones de A260/A280 entre 1.7-2, lo cual indica un alto grado de pureza de ARN aislado, según ^{Kang (2012)}. Los rendimientos de extracción a partir de hoja fueron superiores a 1 000 ng µL^-1, mientras que para cuadro y bellota estuvieron entre 50 y 340 ng µL^-1.

Parámetros de calidad en la detección génica

Para la verificación de la linealidad y la cuantificación génica de las proteínas transgénicas se realizaron curvas de calibración con seis concentraciones, en número de copias, conocidas a distintos niveles. Para la proteína Cry1Ac se obtuvieron R² mayores al 0.99 en la mayoría de los casos, lo mismo para la proteína Cry2Ab. Los valores de R² recomendados para asegurar la linealidad del método es ≥0.99. En la Figura 2 se observan las linealidades del sistema de la curva de calibración para la cuantificación génica de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab.

Figura 2 Curva de calibración para las proteínas, a) Cry1Ac y b) Cry2Ab en RT-Qpc.  

Se midió la eficiencia del método (E), que es la adecuada duplicación de la secuencia de interés en cada ciclo. Las eficiencias obtenidas fueron de 107.63% para Cry1Ac y 109.72% para la proteína Cry2Ab. Una reacción adecuada arroja eficiencias con valores del 90-110%. Para ^{Kavanagh et al. (2011)} la pendiente debe ser otro parámetro de calidad evaluado en las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa, los obtenidos en este estudio fueron de -3.1515 para Cry1Ac y -3.109 para Cry2Ab, los cuales caen dentro de los recomendados por bibliografía que deben de oscilar entre -3.58 y -3.1.

Los resultados obtenidos en la validación cumplen con los criterios establecidos en la guía de información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativo en tiempo real (MIQE), por sus siglas en inglés publicada por ^{Bustin et al. (2009)} y usados por ^{Dinon et al. (2011)}, para el desarrollo y validación de métodos de detección de proteínas transgénicas mediante PCR en tiempo real.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR)

Una vez sintetizado el ADN complementario, se procedió a la cuantificación de los genes codificantes para las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab expresados en los tejidos ya mencionados anteriormente. Debido a la dispersión obtenida de los datos, se procedió a realizar la prueba de Kruskal-Wallis analizando la mediana de los datos para concluir si existió o no diferencia estadísticamente significativa. Dichos resultados evidenciaron que no existe una diferencia significativa, con respecto al tiempo, en la expresión de la proteína Cry1Ac (p= 0.84) y Cry2Ab (p= 0.446) en hojas; si existe diferencia en cuadros y bellotas para ambas proteínas (p= 0.0004 para Cry1Ac, p= 0.001 para Cry2Ab).

Se observó en cada uno de los campos que conforme el análisis se realizaba en etapas más tardías la cuantificación del gen resultaba menor, en algunos casos tendiendo a cero (Figuras 3 y 4), pero siempre hubo expresión.

Figura 3 Cuantificación de los genes de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab en tejidos de hoja de algodonero GM.  

Figura 4 Cuantificación de los genes de las proteínas Cry1Ac y Cry2Ab en tejidos de cuadro y bellota de algodonero GM.  

En un estudio similar realizado por ^{Adamczyk y Meredith en 2004}, la expresión génica de la proteína Cry1Ac tiende a variar entre distintas variedades y partes de la planta a lo largo de la temporada. ^{Adamczyk et al. (2009)}, correlacionaron las cantidades de la proteína Cry1Ac con los transcritos de mARN, encontrándose diferencias en las variedades estudiadas.

El orden de las fechas para los predios de izquierda a derecha es: Campo 1, 5 de febrero, Guamúchil y Campo 9.

La fecha correspondiente a la del análisis de bellota es la del 29/07/2014, el resto corresponde a cuadros. El orden de las fechas para los predios de izquierda a derecha es: Campo 1, 5 de febrero, Guamúchil y Campo 9.

Olsen et al. (2005); ^{Xia et al. (2005)}, concluyeron que el mecanismo resulta hasta cierto punto desconocido. ^{Adamczyk y Gore (2004)}; ^{Kranthi et al. (2005)}; Olsen et al. (2005); ^{Wan et al. (2005)}, concluyeron que la expresión del gen Cry1Ac puede llegar a disminuir la efectividad de la tecnología en los cultivos debido a los niveles de expresión que se observan en etapas tardías, recomendando monitoreos constantes para establecer las líneas base de cada insecto problema y evitar con ello el desarrollo de resistencias en los insectos blanco.

Para el caso de la proteína Cry2Ab en hoja, bellotas y cuadros los resultados demuestran que existe variación y diferencia de expresión en el tejido analizado entre las diferentes fechas y campos estudiados. ^{Bakhsh et al. (2012)} observaron que la expresión del gen Cry2Ab sufre variaciones entre las variedades estudiadas, al igual que en los distintos tejidos que la conforman. ^{Monsanto (2011)} indicó que las variaciones de expresiones génicas dependen de los periodos de producción, fisiología de cada planta, variabilidad genética de cada planta, condiciones medioambientales y de las prácticas agrícolas; además que pueden existir variaciones entre plantas de un mismo lote y que la conformación celular puede comprometer la expresión de las proteínas añadidas al genoma de la planta.

Wessel et al. (2001) sugirieron que la actividad de la región promotora del transgen puede ser caracterizada solamente por la distribución de los diferentes niveles de expresión en la planta, a cada nivel (o tejido) ocurre un comportamiento distinto. La característica de expresión temporal y espacial de un transgen en diferentes líneas transgénicas independientes debe ser intrínseco a la actividad del promotor. Por lo tanto, el promotor quien es el que dirige la expresión del transgen tiene comportamientos distintos en cada tipo de células en la planta, definiendo la regulación espacial de la expresión (^{Head and Greenplate, 2012}).