Introducción

México se ubica como el principal productor de aguacate a nivel mundial, lugar que obtiene por las 149 185 ha plantadas, el estado de Michoacán se coloca como líder productor de este frutal con 195 042 t que representan 94.9% de la producción nacional (^{SIAP, 2019}). En Michoacán el cultivo del aguacate se encuentra establecido en una región conocida como ‘la franja aguacatera del estado de Michoacán’ (^{Gutiérrez-Contreras et al., 2010}) en ella, existe una amplia diversidad genética de P. americana Miller variedad Drymifolia que se ha utilizado como portainjertos de la variedad Hass (^{Cuiris-Pérez et al., 2009}).

Por ser fuente de genes de resistencia a factores físicos, plagas y patógenos (^{Rincón-Hernández et al., 2011}); sin embargo, la enorme riqueza fitogenética es amenazada por la destrucción de ecosistemas y sustitución de cultivares tradicionales por cultivares mejorados (^{Lorea-Hernández, 2002}). Consecuentemente, durante los últimos años, se han sumado esfuerzos para la conservación y caracterización de estos recursos genéticos (^{Gutiérrez-Diez et al., 2009}).

En particular, en el estado de Michoacán se ha trabajado en la caracterización del germoplasma de aguacate criollo; estos trabajos incluyen información genotípica (^{Cuiris-Pérez et al., 2009}) y fenotípica (^{Guillén-Andrade et al., 2013}). La importancia de estudiar la química de las plantas radica en que éstas han desarrollado diversas estrategias de defensa bajo condiciones de estrés biótico y abiótico; por ejemplo, la planta sintetiza metabolitos secundarios (MS) que provocan que las plantas sean desagradables o tóxicas para algunos herbívoros (^{Anaya-Lang y Espinoza-García, 2006}).

Algunos con actividad biológica larvicida (^{Senthilkumar et al., 2008}), insecticida bactericida y fungicida (^{Khokra et al., 2008}; ^{Moreno et al., 2009}; ^{Hanamanthagouda et al., 2010}), además de su importancia ecológica al participar en los procesos de adaptación de las plantas, atracción de insectos polinizadores y dispersores de semillas (^{Sepúlveda-Jiménez et al., 2003}).

La variación de los perfiles químicos del género Persea, ha sido documentada en diversos estudios (^{Quing-Yi et al., 2009}; ^{Torres-Gurrola et al., 2009}; ^{Rincón-Hernández et al., 2011}) en el más (^{Torres-Gurrola et al., 2016}) informativo, se reporta un total de 363 MS identificados, que corresponden a 13 grupos químicos, del total, 258 se relacionan en diferentes tejidos de Persea american: se han reportado 125 en pericarpio, 109 en tejido foliar, 17 en semilla, tres en corteza, dos en flor y dos en raíz. Debido a la importancia de conocer los perfiles químicos, como mecanismos de defensa, de los recursos genéticos de P. americana Miller variedad Drymifolia.

Con el objetivo de conocer la variabilidad química foliar de las 54 colecciones de esta especie, establecidas en el banco de germoplasma de la Facultad de Agrobiología, dependiente de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, como parte integral de una estrategia para evaluar su potencial como portainjertos con características de resistencia a plagas y enfermedades, entre otros atributos adicionalmente, se planteó la necesidad de establecer la posible relación de los MS presentes en las colecciones con su origen geográfico.

Materiales y métodos

La investigación fue desarrollada en el Laboratorio de Recursos Fitogenéticos (LAREFI) de la Unidad de Investigaciones Avanzadas en Agrobiotecnología (UIAA) de la Facultad de Agrobiología ‘Presidente Juárez’, de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, ubicada en la ciudad de Uruapan Michoacán, México, en las coordenadas 19° 25’ 10’’ latitud norte y 102° 03’ 30’’ longitud oeste a 1 620 msnm. El proceso de extracción, identificación y cuantificación de MS se llevó a cabo en el Centro de Investigaciones en Ecosistemas (CIEco) de la Universidad Nacional Autónoma de México-Campus Morelia.

El material genético analizado consistió de 54 accesiones de P. americana Miller variedad Drymifolia, con cuatro individuos por accesión, las accesiones provienen de localidades pertenecientes a los municipios de Ario, Los Reyes, Salvador Escalante, Tacámbaro, Tingambato, Uruapan y Ziracuaretiro, todos ellos ubicados en la franja aguacatera de Michoacán entre las coordenadas 18° 45’ y 20° 6’ latitud norte y 101° 47’ y 103° 13’ de longitud oeste (^{Guillén-Andrade et al., 2007}; ^{Gutiérrez-Contreras et al., 2010}).

El perfil químico de cada una de las accesiones fue determinado a partir de tejido foliar de hojas maduras y con el empleo de un cromatógrafo de gases (Agilent HP6890^®), provisto con un detector de masas (Agilent 6890^®). Los procedimientos para la obtención de extractos, las condiciones del cromatógrafo de gases para inyectar y analizar las muestras, la identificación de MS con base en la información contenida en la biblioteca de espectro de masas NIST 05 (National Institute of Standars and Technology) y la cuantificación de MS fueron hechos con base a lo descrito por ^{Torres-Gurrola et al. (2009)}.

La base de datos de contenido y concentración (mg g^-1 de hoja seca) de cada uno de los MS identificados se sometió a un análisis de varianza en una vía, con base en un diseño experimental completamente al azar, con cuatro repeticiones, considerando a cada accesión como un tratamiento. Cada observación estuvo representada en el modelo estadístico correspondiente al diseño experimental, mediante la siguiente expresión: Yij= M +Ci + eij. Donde: Yij= concentración del MS en la colecta i y repetición j; M= media general del experimento; Ci= efecto de la colecta i; Eij= error experimental en la colecta i y repetición j; i= 1, 2, 3,…, 54 y j= 1, 2, 3, 4.

Este análisis se hizo mediante el procedimiento Proc Anova del paquete estadístico SAS⁽ versión 9.4 (^{SAS Institute Inc., 2012}). Con base en el análisis de varianza se seleccionaron los MS para los cuales hubo diferencias estadísticamente significativas (p< 0.05). Posteriormente, sobre el listado de esos MS seleccionados, se practicó un análisis discriminante de Stepwise (^{Romano y Wolf, 2005}) para depurar y mantener únicamente aquellos MS que aportaban mayor información a la varianza total.

Adicionalmente, se practicó un análisis de correlación de ^{Pearson y Filom (1898)} para eliminar variables altamente correlacionadas, y evitar problemas de colinealidad en las matrices. Posteriormente, se obtuvo una matriz de promedios para llevar a cabo un análisis de componentes principales (ACP), utilizando la matriz de correlaciones; se calculó la matriz de distancias euclidianas (DE) entre accesiones y con ella, se hizo el análisis de conglomerados mediante el paquete estadístico Genalex (^{Peakall y Smouse, 2006}).

Finalmente, se construyó el dendograma correspondiente utilizando el método de agrupamiento de Neighbor-Joinning. Todos los análisis fueron hechos con el paquete estadístico SAS⁽ versión 9.4 (^{SAS Institute Inc. 2012}). Las coordenadas geográficas de los sitios de origen de las accesiones se convirtieron a decimales con el programa de la Comisión Federal de Comunicaciones, (http://transition.fcc.gov/mb/audio/bickel/DDDMMSS-decimal. HTML), con estos datos se construyó una matriz de Distancias Geográficas (DG), ésta fue correlacionada con una matriz de distancias euclidianas, mediante la prueba de Mantel con el paquete estadístico GenAlex (^{Peakall y Smouse, 2006}; ^{Flanagan, 2006}).

Resultados y discusión

En el análisis de 54 accesiones de establecidas en el banco de germoplasma de la Facultad de Agrobiología, los resultados obtenidos indican la presencia de 47 MS del total, existe un primer grupo de 31 que han sido reportados en P. americana Miller y especies afines: α-pineno, sabineno, β-pineno, eucalipto, β-cis-ocimeno, estragol, óxido de cariofileno, limoneno, α-cubebeno, fitol, heptacosano, escualeno, chavicol, β-cubebeno, cariofileno, α-humuleno, germacreno D-4-ol, ácido tetradecanoico, copaeno, cubenol, decano, fenil etil alcohol, metileugenol, nerolidol (E), tetradecanal, (-elemeno, linolenato de etilo, ácido hexadecanoico, hexadecanoato de metilo, el mirceno y ácido oleico (^{Quing-Yi et al., 2009}; ^{Torres-Gurrola et al., 2009}; ^{Rincón-Hernández et al., 2011}; ^{Torres-Gurrola et al., 2016}).

Un segundo grupo, constituido por 11 MS, no han sido reportados para P. americana y especies afines; sin embargo, para estos existen reportes de su presencia en otras especies vegetales. El 4,8,13-duvatrien-1,3-diol se ha identificado en tabaco como inhibidor de crecimiento el 8,11,14 ácido eicosatrienoico (z,z,z)- en Melittis melissophyllum (^{Velasco-Negueruela et al., 2004}), el acetato de eugenol, se ha reportado como componente principal en el aceite esencial de Syzigium aromaticum y con actividad antioxidante; el cis,cis,7,10-hexadecadienal en Euphorbia heterophylla con actividad citotóxica, antioxidante y antimicrobial el cis,cis,cis-7,10,13-hexadecatrienal en Azadirachta indica y Allamanda cathartica con actividad larvicida.

El elemicin en Myristica fragrans y Daucus carota con actividad tóxica y antibacterial y en Syzigium aromaticum con actividad antioxidante la palmitona en Annona diversifolia actuando como anticonvulsivo (^{Cano-Europa et al., 2010}), el α-tocoferol en Elaeis oleífera y Vaccinium meridionale con actividad antioxidante el cicloartenol acetato en propoleo con actividad antimicrobial el 2H-pireno, 2-(7-heptadeciniloxi) tetrahydro- se identificó en la planta medicinal Andrographis paniculata el 2-metilenecholestan-3-ol, se reportó como componente del aceite esencial de las flores de Artemisia austro-yunnanensis con actividad antioxidante (^{Chen-xing et al., 2014}) y en Alstonia scholaris: planta utilizada en la medicina herbaria por sus propiedades medicinales (^{Islam et al., 2013}).

Finalmente, se identificó un tercer grupo de cinco MS para los cuales no existen reportes de su presencia en especies vegetales: el undecano y el tridecano han sido reportados como compuestos defensivos en Loxa deducta y Pellaea stictica el metil araquidonato como factor de crecimiento en animales el α-gliceril linolenato, es utilizado como solvente industrial, el undecano 4-metil se ha identificado en aguas residuales y en petróleo crudo.

Con base en los trabajos, que sobre este tema se han publicado, en esta investigación se identificaron un total de 16 nuevos metabolitos presentes en tejido foliar de P. americana Miller variedad Drymifolia y que pertenecen a nueve grupos químicos: ésteres (4), alcoholes (2), compuestos fenólicos (1) ácidos; (1) éter; (1) alcanos; (3) aldehídos; (2) acetona; (1); y politerpenos (1). En el Cuadro 1, se presenta el nombre del metabolito y su estructura química.

Al analizar la concentración y frecuencia a la que fueron identificaron los 47 MS en las 54 accesiones, se determinó que el β-pineno, estragol, cariofileno, ácido hexadecanoico, heptacosano y α-tocoferol, fueron identificaron en todas las accesiones y, de estos últimos, el estragol destacó por presentar los mayores valores de porcentaje (26.5327 mg g^-1 de hoja) de concentración. En contraste, el chavicol y el acetato de eugenol se presentaron en solo cinco de las 54 accesiones analizadas. Por otra parte, el fenil etil alcohol fue el que menor porcentaje (0.0164 mg g^-1 de hoja) de concentración mostró en las colecciones analizadas. En el Cuadro 2, se presenta la información del metabolito secundario, tiempo de retención, índice Kovats, concentración (%) y frecuencia de cada uno de los MS identificados en las 54 accesiones.

El estragol fue el metabolito secundario destacado por estar presente en mayor concentración y en las 54 colectas analizadas. Estos resultados son similares a los reportados en trabajos similares en germoplasma distintas especies de Persea procedentes de diferentes regiones de México (^{Rincón-Hernández et al., 2011}). La evaluación del contenido de este MS en cada una de las colectas resulta interesante, por ejemplo, se ha evaluado la interacción aguacate criollo-Trioza anceps, los árboles con mayor concentración de estragol presentaron menor presencia de agallas foliares (^{Torres-Gurrola et al., 2009}).

Además, se ha identificado al estragol como principal componente en otras especies y, con actividades biológicas de defensa importantes, como insecticida (^{López et al., 2008}) en Ocimum basilicum indujo mortalidad por contacto al gorgojo del arroz (Sitophilus oryzae) también se ha utilizado contra el escarabajo rojo de la harina (Tribolium castaneum Herbst) y el barrenador de grano (Rhyzopertha dominica) en Pimpinella anisum, se reportó con efecto bactericida, se le ha relacionado con actividad antifúngica (^{Fontenelle et al., 2008}), larvicida (^{Senthilkumar et al., 2008}) y genotóxica (^{Zani et al., 1991}).

En el presente estudio, tres colectas precedentes del municipio de Tingambato, Michoacán, México, fueron las que presentaron mayor concentración de estragol, por lo que se esperaría, que estas colecciones pudieran presentar mejores atributos de defensa para ser utilizados como portainjertos selectos.

En la Figura 1, se representa la variación determinada en el contenido de estragol en las 54 colectas analizadas.

Figura 1 Histograma para concentración de estragol en 54 accesiones de Persea americana Miller variedad Drymifolia colectadas en los municipios de Ario (ARI), Los Reyes (LES), Salvador Escalante (SES), Tacámbaro (TAC), Tingambato (TIN), Uruapan (URU) y Ziracuaretiro (ZIR) establecidas en el banco de germoplasma de la Facultad de Agrobiología.  

Los valores del coeficiente de determinación (R²) oscilaron entre 0.33 y 0.46, con relación a los coeficientes de variación (CV), los valores fluctuaron entre 98.13 y 896.43. El mayor valor de CV fue para el acetato de eugenol en contraste con el Cis, cis, cis 7, 10, 13-hexadecatrienal. Asimismo, los valores promedio oscilaron de 0.00108 a 0.28877 en porciento de concentración total.

Posteriormente, en el análisis discriminante Stepwise, se identificó el tridecano como uno de los MS que no aportó información para explicar la variación en concentración de MS y al revisar los valores de correlación de Pearson, el decano se mostró altamente correlacionado (<0.0001) con el tridecano.

Estos resultados se explican por que las colecciones presentan diferencias en su expresión génica y el perfil químico esté sujeto a un fuerte control genético, así como lo está en otras especies arbóreas (^{Langenheim y Stubblebine 1983}; ^{Gershenzon et al., 2000}; ^{McConkey et al., 2000}).

Los resultados obtenidos del análisis de varianza en una vía, practicados para contenido de 47 MS identificados al analizar 216 individuos de 54 colectas de P. americana Miller variedad Drymifolia, indicaron diferencias estadísticas significativas (p< 0.05) para concentración para diez de ellos y diferencias altamente significativas (p< 0.01) para fenil etil alcohol y el 8,11,14-ácido eicosatrienoico (z,z,z)-. En el Cuadro 3 se presentan los estadísticos simples obtenidos para los 12 metabolitos secundarios que presentaron diferencias estadísticas significativas.

Para reducir el número de variables a considerar para la explicación de la variabilidad en relación a la concentración de metabolitos secundarios, se practicó un análisis de componentes principales (ACP). Los resultados indicaron que los primeros tres componentes principales (CP), explican en conjunto 29.64% de la varianza que existe entre las accesiones, mientras que con 17 se logra explicar 80%.

Resultados similares se han obtenido en trabajos de caracterización morfológica in situ de Persea y otras especies, ya que se ha observado que en este tipo de trabajos no se logra más de 80% de la varianza explicada con los tres primeros componentes (^{Tofiño et al., 2012}; ^{López-Guzmán et al., 2012}; ^{Guillén-Andrade et al., 2013}; ^{Medina-Torres et al., 2015}; ^{Montes-Hernández et al., 2017}).

En la Figura 2, se muestra la distribución de las 54 colecciones en función de tres componentes principales. Al analizar los vectores propios con valores arriba de 0.3, se determinó que el CP1 está en función de la presencia del eucalipto, cariofileno y α-humuleno, el CP2 se determinó en función del decano, undecano,4-metil y tridecano. finalmente, el CP3 está en función del chavicol y τ-elemeno. Es importante señalar, que el tridecano y el undecano,4-metil con mayor peso en el CP2 son reportados por primera vez en Persea americana Miller variedad Drymifolia.

Figura 2 Dispersión de 54 colecciones de P. americana Miller variedad Drymifolia del banco de germoplasma de la Facultad de Agrobiología, en función de tres componentes principales.  

Por otro lado, el dendograma presentado en la Figura 3, generado del análisis clúster con base en el método de agrupamiento de Ward, mostró que las accesiones no se asocian de manera lógica con relación a su origen geográfico. Estos resultados fueron corroborados al efectuar la prueba de Mantel, el valor de correlación obtenido fue de r= -0.064 y una significancia de .069, lo que confirmó la no relación entre el origen geográfico de las colectas y el contenido de MS identificados en 54 colectas.

Figura 3 Dendograma de agrupamiento completo de 54 colecciones de Persea americana Miller variedad Drymifolia, con base en datos de concentración de 47 metabolitos secundarios. Los círculos de colores indican el lugar de procedencia del germoplasma.  

Estos resultados pueden estar enmascarados debido a que las muestras de tejido foliar fueron aisladas de las colecciones establecidas en el banco de germoplasma; es decir, se encuentran en un solo ambiente.

Los resultados de la prueba antes indicada son presentados en la Figura 4.

Figura 4 Correlación lineal entre el contenido de metabolitos secundarios y distribución geográfica de 54 colectas de colecciones de Persea americana Miller variedad Drymifolia.  

Conclusiones

Las 54 colecciones establecidas en el banco de germoplasma de la Facultad de Agrobiología de Persea americana Miller variedad Drymifolia, son contrastantes en el tipo y concentración de 47 metabolitos secundarios identificados. El estragol fue una constante en cuanto al contenido y mayor concentración en todo el germoplasma analizado. La identificación de 16 nuevos metabolitos secundarios en el germoplasma evaluado es una importante contribución del presente trabajo.

Finalmente, no se determinó relación alguna entre el perfil químico y el origen geográfico de procedencia de las colecciones analizadas.