Materiales utilizados

En un invernadero de tipo túnel del Área de Nutrición Vegetal del Colegio de Postgraduados, de mayo a julio de 2018 se instaló el experimento. Se utilizaron semillas de chile serrano (Capsicum annuum L.) variedad Tampiqueña 74 (Caloro^®), con tasa de germinación de 85%. Se utilizaron charolas de germinación de polietileno flexible negras de 25 cavidades redondas (85.6 cm³ cavidad^-1), desinfectadas con cloro a una concentración de 200 ppm y lavadas con agua.

Se sembraron dos semillas por cavidad para garantizar la germinación. El sustrato fue a base de una mezcla de peat moss (Premier^®), perlita (Agrolita^®) y vermiculita (Termita^®) con relación de 1:1:1 (v/v/v), la mitad de la mezcla preparada se esterilizó con una olla de presión (1.3 kg cm^-2), la otra mitad se utilizó sin esterilización de acuerdo con los tratamientos establecidos.

Establecimiento y diseño experimental

El experimento se estableció bajo un diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial de 2×2×2, donde los factores de estudio fueron: con o sin inoculación con P. tolaasii (P), el sustrato esterilizado (SE) y sustrato no esterilizado (SNE) y la solución nutritiva con Steiner (St) y té de vermicompost (Te).

Se evaluaron un total de ocho tratamientos con cuatro repeticiones cada uno. La unidad experimental fue una charola de almácigo con 25 plántulas de chile serrano, las cuales se regaron con agua esterilizada dos a tres veces por día. La emergencia de plántulas se presentó a partir de los 12 días y se ralearon cuatro días después dejando una plántula por cavidad.

Material microbiológico

Como inóculo se utilizó la cepa bacteriana P61 de P. tolaasii, perteneciente a la colección del Laboratorio de Microbiología de Suelos del Postgrado de Edafología. La inoculación de la bacteria se realizó a los seis días después de la emergencia, aplicando 1 mL de inóculo con una concentración de 1×10⁹ UFC mL^-1 en la base de cada plántula.

Solución nutritiva

Al tercer día después de la inoculación se inició la nutrición de las plántulas, utilizando la solución nutritiva universal Steiner al 25% (^Steiner,1984). Como segunda fuente de nutrición se elaboró el té de vermicompost preparado de acuerdo con el método de ^{González-Solano et al. (2014)}. Ambas soluciones se ajustaron a pH de 5.5 y 24 días después se incrementó su concentración a 50% en ambas soluciones hasta el trasplante. La concentración se calculó con base en la conductividad eléctrica de la solución de Steiner.

Variables evaluadas

A los 56 días después de la siembra se realizó una cosecha destructiva. Las variables evaluadas fueron: diámetro de tallo (mm), altura de plántula (cm), número de hojas, área foliar (cm²) con un equipo medidor de área LI-COR^®, la longitud (cm) y volumen radical (cm³) se determinaron con el método de desplazamiento de agua con probeta de 25 mL.

Además, se cuantificó el NO₃ ^-, K⁺ y Ca²⁺ en extracto celular del peciolo (savia) con ionómetros Laquatwin^®. Las plántulas se secaron en el horno a 55 °C durante 72 h y se pesaron para obtener la biomasa seca de la parte aérea y radical. Con los valores obtenidos se calcularon los índices de crecimiento según ^{Hunt (2017)} (Cuadro 1).

Análisis nutrimental

En el material vegetal seco se determinó el nitrógeno (N) total por el método microKjeldahl, fósforo (P) y potasio (K) por medio de digestión húmeda y espectroscopia de emisión atómica de inducción por plasma utilizando la metodología propuesta por ^{Alcántar y Sandoval (1999)}.

Análisis estadístico

Los datos obtenidos de las variables evaluadas fueron sometidos a la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk (α= 0.05) y la prueba de Levene para homogeneidad de varianza. A las variables de longitud radical, biomasa seca radical, biomasa seca de la parte aérea, AFE, RAF, NO₃, K⁺, Ca²⁺ en extracto celular y concentración nutrimental (N, P, K), que cumplieron con ambas pruebas se les aplicaron análisis de varianza (Anova) y la prueba de comparación de medias de Tukey (α= 0.05).

Las variables altura, diámetro de tallo, número de hojas y área foliar que no cumplieron con las pruebas de homogeneidad de varianza o normalidad, fueron transformadas a logaritmo natural (ln) hasta observar normalidad y homocedasticidad, posteriormente se calculó el Anova y la prueba de comparación de medias de Tukey (α= 0.05).

Los datos del volumen radical, biomasa seca de hoja no cumplieron con ambas pruebas, por lo que se hizo un análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis y la sumatoria de rangos de Wilcoxon, de acuerdo con la metodología de Siegel (2015). Para todos los casos se trabajó con el programa estadístico Statistical Analysis System (SAS) Versión 9.4 (^{SAS, 2014}).

Variables agronómicas

La longitud y biomasa seca radical, la biomasa seca de la parte aérea, AFE y RAF presentaron diferencias estadísticas entre los tratamientos según Tukey (p< 0.05) (Figura 1). Las plántulas que se desarrollaron en sustrato no estéril tuvieron un ligero incremento en la longitud de raíz, a diferencia de las que crecieron en sustrato estéril, sin embargo, en biomasa seca de raíz no hay diferencias entre estas.

Figura 1 a) Longitud radical y biomasa seca radical; b) biomasa seca de la parte aérea; c) área foliar específica; y d) relación de área foliar de plántulas de chile serrano inoculada con p. tolaasii y diferente solución nutritiva. Barras con diferente letra, son estadísticamente diferentes de acuerdo con la prueba de medias de Tukey (p< 0.05). P= Pseudomonas tolaasii; S=sustrato; E= esterilizado; NE= no esterilizado; St= Steiner; Te= té de vermicompost.  

En relación con la fuente de nutrición, cuando se aplica té como solución, hay incremento en la longitud y biomasa seca, aunque la prueba de Tukey indica en algunos casos que no hay diferencias (Figura 1a). Es interesante ver que la altura y biomasa de raíz en plántulas sin sustrato estéril y con té presentan los valores más altos de longitud y biomasa seca radical.

Respuestas favorables a fuentes orgánicas han sido registradas por ^{David-Santoya et al. (2018)} para chile habanero (Capsicum chinense Jacquin) y con inoculantes para incrementar la longitud radical de C. annuum con Rhizobium etli, y con Trichoderma viride por ^{Vazallo et al. (2013)}. Una mayor longitud radical en las plántulas permite que pueda sobrellevar de manera eficiente el trasplante y lograr una rápida adaptación y absorción de agua y nutrientes (^{Vazallo et al., 2013}).

En el análisis de la parte aérea, la Figura 1b muestra que los tratamientos PSNESt y PSESt registraron la mayor biomasa seca (tallo + hojas) de las plántulas, alcanzando 0.34 g y 0.33 g planta^-1, respectivamente. Esto significa que en la parte aérea de la plántula hay una respuesta a la inoculación de Pseudomonas tolaasii y a la aplicación de solución nutritiva Steiner sin importar la esterilización de sustrato.

Esto se atribuye a que, P. tolaasii benefició la absorción de nutrientes disponibles incorporadas con solución Steiner (^{Angulo-Castro et al., 2018}) y a la mejora en el desarrollo de la raíz cuando hay inoculación con las rizobacterias (^{Natarajan et al., 2012}). La inoculación de P. tolassi a plantas de fresa, favorece el desarrollo de la planta (incremento en área foliar y peso fresco de follaje), aunque no se refleja en incremento en la producción de fruto (^{Ortiz et al., 2016}).

La biomasa de la parte aérea de las plántulas crecidas en sustrato no estéril (Figura 1b) y regadas con solución Steiner fue muy similar a las inoculadas con Pseudomonas; sin embargo, la longitud de raíz y biomasa fueron reducidas (Figura 1a) y esto tiene mucho que ver con la adaptación de las plántulas al trasplante. En los índices de AFE (Figura 1c) y RAF (Figura 1d), la incorporación de solución Steiner sin la inoculación incrementaron los valores, en sustratos esterilizados.

Resultados similares han sido registrados en plántulas de pimiento (^{Luna et al., 2013}) y en chile jalapeño (^{Angulo-Castro et al., 2018}), cuando se inocularon con Pseudomonas. ^{Amanullah et al., 2007}, indican que los valores altos de AFE, representan mayor espesor de la hoja y mejor balance entre la capacidad potencial de la fotosíntesis y el costo de respiración.

Estos valores se alcanzaron en las plántulas donde hubo un suficiente suministro de nutrientes inorgánicos (St), lo que genera mayor vigor de la planta, determinado por la RAF, así como mayor grosor de hoja regulado por la AFE (^{Hunt, 2017}), índice que permite explicar hasta 80% de la variación en las tasas de crecimiento (^{Villar et al., 2004}).

En la Figura 2a se muestra las medias de las variables de altura de plántula y diámetro de tallo, donde la inoculación generó mayor altura (20% más) y diámetro de tallo (entre 13 y 5% más) entre los tratamientos PSNESt y PSESt con respecto a sus testigos (SNESt y SESt). La prueba de Tukey muestra diferencias altamente significativas entre estos dos tratamientos y los otros. Resultados similares obtuvieron ^{Luna et al. (2013)}, con un incremento significativo de altura y diámetro de tallo de plántulas de pimiento al inocular Bacillus subtilis hasta 37%, en comparación con el testigo.

Figura 2 a) altura de plántula y diámetro de tallo; y b) número de hojas y área foliar de plántulas de chile serrano inoculadas y diferente solución nutritiva. P= Pseudomonas tolaasii; S=sustrato; E= esterilizado; NE= no esterilizado; St= Steiner; Te= té de vermicompost. 

El ácido indolacético (AIA) producido por la cepa inoculada es la principal fitohormona que induce el crecimiento de las plantas, al aumentar la división celular y la diferenciación de los tejidos (^{Bhattacharyya y Jha, 2012}; ^{Glick, 2012}). En el caso de chile poblano el incremento en crecimiento fue de 35% con respecto al testigo por el efecto de la inoculación con bacterias promotoras de crecimiento entre ellas P. tolassi (^{Quiroz-Sarmiento et al., 2019}).

En el número de hojas y área foliar por plántula, el tratamiento inoculado con P. tolaasii y regadas con solución nutritiva Steiner en sustrato estéril (PSESt) fue el que registró mayor número de hojas, hasta 12% más que el testigo (SESt), tal y como se muestra en la Figura 2b. En contraste, para la variable área foliar, se observó la mayor superficie foliar (hasta 20% más que el testigo), con el tratamiento PSNESt. Los resultados de esta variable indican que la inoculación y la solución nutritiva de Steiner al 25% suministran los nutrimentos balanceados que se reflejan en el incremento del número de hojas en todas las plántulas que fueron regadas con Steiner. Ya que posiblemente las rizobacterias, proporcionan beneficios para el crecimiento a las plantas cuando se agregan cantidades bajas de fertilizante químico al suelo que no inhiban el crecimiento como lo establecen ^{Bhattacharyya y Jha (2012)}; ^{Glick (2012)}.

Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el volumen radical de acuerdo con la prueba de Kruskal-Wallis, siendo el tratamiento PSNETé el que registro mayor volumen con un rango promedio de Wilcoxon de 180.18 (datos no mostrados), mientras que la mayor biomasa seca de hoja se registró con el tratamiento PSNESt, con un rango promedio de Wilcoxon de 224.75 y el tratamiento PSESt con 216.72. En la Figura 3a se muestra las medias de volumen radical, donde se aprecia que el tratamiento PSNETé presentó 3 cm³, superando 31% a su testigo (SNESt) y el tratamiento SESt obtuvo 2.2 cm³.

Figura 3 Diagrama de caja contrastando: a) volumen radical; y b) biomasa seca de hojas de plántulas de chile serrano inoculadas y diferente solución nutritiva. P= Pseudomonas tolaasii; S= sustrato; E= esterilizado; NE= no esterilizado; St= Steiner; Te= té de vermicompost (análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis). 

^{Pérez et al. (2015)} obtuvieron incrementos en el volumen radical de hasta 64% en plántulas de mora (Rubus glaucus L.) inoculadas con Pseudomonas migulae en comparación con el tratamiento sin inoculación. De acuerdo con ^{Amara et al. (2015)}Pseudomonas es un género de bacterias capaces de producir y excretar auxinas que son aprovechadas por las plántulas; la más investigada es el ácido indol-3-acético, que es una fitohormona involucrada en la estimulación del crecimiento radical (^{Glick, 2012}).

En la Figura 3b se muestra que la mayor biomasa seca se presentó en los tratamientos PSNESt con una media de 0.253 g planta^-1 y PSESt hasta 0.248 g planta^-1. ^{Parra-Terraza (2016)} identificó que el suministro de NO₃ ^- en la solución nutritiva, aumentó la biomasa seca de hojas; sin embargo, con la participación de P. tolaasii esta variable agronómica es superior entre 20% y 9% a sus testigos SNESt y SESt, respectivamente.

Variables nutritivas

En la concentración de nitratos, potasio y calcio en extracto celular de peciolo de las plántulas de chile, se encontraron diferencias estadísticas (p< 0.05. En la Figura 4a se observa que las plántulas crecidas en sustrato no estéril, inoculadas y regadas con té, presentaron los valores más bajo de nitratos (1 450 ppm). Las plántulas crecidas con sustrato estéril no presentaron diferencias estadísticas significativas entre éstas.

Figura 4 Variables nutritivas: a) nitratos en savia; b) potasio en savia; c) calcio en savia; d) nitrógeno; e) fósforo; y f) potasio en plántulas de chile serrano inoculada y diferente solución nutritiva. Columnas con diferente letra, son estadísticamente diferentes de acuerdo con la prueba de medias de Tukey (p< 0.05). P= Pseudomonas tolaasii; S=sustrato; NE= no esterilizado; St= Steiner; Te= té de vermicompost. 

El potasio en el extracto celular (Figura 4b) presento los valores más altos en las plántulas crecidas en sustrato no estéril y únicamente en el testigo estéril (SESt), en cambio el Ca²⁺, incrementó su contenido en plántulas con sustrato no esterilizado y la inoculación de P. tolassii independientemente de la solución nutrimental. Por debajo de estos y estadísticamente igual fue el contenido en las plantas de sustrato no estéril y regadas con sol, Steiner (Figura 4c).

La importancia de conocer la composición química estriba en la calidad del material vegetal de las plántulas, y la reserva de nutrientes minerales, altas concentraciones de nitrógeno y potasio pueden influir sobre el crecimiento y la supervivencia de las plántulas (^{Villar et al., 2004}). ^{Shabayev (2012)} informó que la inoculación con P. seudomonas, aumentan la absorción de nutrientes por las plantas, el crecimiento, la absorción nutrimental y excreción del sistema radicular asociadas con la secreción de compuestos fenólicos que tiene entre otras cosas la misión de favorecer el micronicho de la rizobacteria.

^{Moreno et al. (2018)} indicaron que las RPCV participan en la liberación de forma gradual de nutrimentos y contribuyen a la reserva de N y P orgánico del suelo, reduciendo las pérdidas de N por lixiviación y la fijación de P (ciclo de nutrientes) Además, de suministrar micronutrientes a los cultivos (^{Glick, 2012}). En las Figuras 4d, e, f , se muestra la concentración de N, P y K en biomasa seca de plántulas, con diferencias altamente significativas entre los tratamientos (p< 0.05).

En el tratamiento SESt presentó la mayor concentración de N con un promedio de 55.5 g kg^-1; mientras que el tratamiento SNETé registró la concentración más baja (33.6 g kg^-1). Los demás tratamientos fueron estadísticamente similares. En cuanto a la concentración de P, resultaron mejores los tratamientos del sustrato estéril con solución Steiner (PSESt y su testigo SESt), los cuales registraron 4.15 y 4.13 g kg^-1 respectivamente.

La inoculación combinada con solución nutritiva de Steiner (PSESt y PSNESt), aumentó la concentración de K en biomasa seca, superando en 150% a 68% a los testigos (SESt y SNESt), en cambio, el tratamiento PSETé registró la menor concentración de K (6.56 g kg^-1), siendo 36% menor que su testigo (SESt). ^{Jones (2014)} indicó que la fertilización con solución Steiner mejoró la calidad de las plántulas, para el trasplante, debido a una mayor disponibilidad de nutrientes.

Mientras que en la presente investigación el suministro de solución Steiner benefició las variables nutritivas en plántulas y algunas variables agronómicas. El equilibrio adecuado y la utilización de iones en la solución nutritiva se logró mediante el uso de sus fórmulas universales de solución nutritiva que mejoran la concentración de nutrientes en la materia vegetal (^{Steiner 1984}).

En el Cuadro 3 se sintetizan las variables en estudio sobre el efecto de la inoculación con Pseudomonas tolaasii que al ser combinada con solución nutritiva de Steiner en sustratos no estériles tuvieron mejores resultados en variables agronómicas como altura, diámetro de tallo, área foliar y biomasa seca aérea, observándose que la combinación de la inoculación con té de vermicompost en sustrato no estéril influye al aumentar la longitud y volumen radical.

No así cuando se aplica solo té de vermicompost, ya que no presenta ninguna respuesta positiva, lo que significa que la inoculación de P. tolaasii probablemente tiene efectos positivos cuando tiene interacción con otros microrganismos nativos o coinoculados con diferente capacidad promotora (sustrato y té) (^{Ahemad y Khan, 2012}; ^{Rojas et al., 2001}).

Sin embargo, cuando solamente se aplica solución Steiner eliminando todos los microrganismos solo se beneficia la concentración nutrimental e influye en los índices de crecimiento debido a que la nutrición aplicada a las plantas puede afectar la estructura de las comunidades bacterianas en la rizosfera (^{Glick, 2012}, ^{Shabayev, 2012}). Y es que el proceso de colonización en un paso decisivo en la interacción entre bacteria y planta, esta última secreta exudados ricos en nutrimentos que son utilizados por las bacterias en la sprimeras etapas de reconocimiento (^{Abaid-Ullah et al., 2015}).

La hipótesis que se plantea en el presente estudio es que la inoculación de P. tolaasii combinada con té de vermicompost favorece el desarrollo agronómico y nutritivo de plántulas de chile serrano. Por lo tanto, el objetivo de la presente investigación fue cuantificar el efecto de la inoculación de Pseudomonas tolaasii en la fisiología y desarrollo de plántulas de chile serrano (Capsicum annuum L.) utilizando diferentes soluciones nutritivas.