Cepas fúngicas fitopatógenas

Las cepas fúngicas Lasiodiplodia theobromae y Fomitopsis meliae fueron proporcionadas por la Facultad de Agronomía de la Universidad Autónoma de Nuevo León (FAUANL).

Aislamiento de microorganismos del suelo

Se realizaron 17 muestreos de suelo con diferentes tipos de vegetación en zonas del estado de Nuevo León (Cuadro 1), se colectaron muestras de la rizósfera a una profundidad de 10 a 15 cm, después de eliminar la capa superficial. Para el muestreo se seleccionaron al azar cinco puntos diferentes para formar una muestra. Las muestras se colocaron en bolsas de plástico, se sellaron y almacenaron en el laboratorio en condiciones de clima fresco.

Un gramo de cada muestra se disolvió en 9 mL de agua destilada estéril. Las diluciones fueron tratadas con calor (50 °C) durante 10 min. De cada suspensión se prepararon diluciones seriales 1:100, 1:1 000 y 1:10 000. De cada dilución se transfirieron 100 µL a cajas Petri con agar papa dextrosa adicionado con extracto de levadura (0.3%) y extracto de malta (0.3%) (PDLMA) mediante el método de extensión. Las cajas Petri se incubaron a 25 ±2 ºC. Se aislaron y purificaron microorganismos que presentaron halos de inhibición (^{Oskay et al., 2004}).

Caracterización morfológica y genética de actinomicetos y bacterias con actividad antagónica

Las cepas de actinomicetos se identificaron de acuerdo con sus características de crecimiento macroscópicas (forma, color del micelio aéreo, textura y la producción de pigmentos en el medio de cultivo). Adicionalmente, se realizaron observaciones microscópicas utilizando para ello la tinción de Gram. Para la identificación de las bacterias se consideraron forma, color y textura de las colonias, para la visualización microscópica se utilizó la tinción de Gram.

Para la identificación molecular de los actinomicetos se extrajo el ADN utilizando el DNeasy Plant Mini Kit^MR (Qiagen Inc.) y se amplificó por PCR utilizando los iniciadores 8F (5’-agagtttgatcctggctcag-3’) y 1492R (5’-ggttaccttgttacgactt-3’) (^{Sacchi et al., 2002}). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador Thermo^MR, las cuales consistieron en una desnaturalización a 94 ºC por 1 min, seguido por 35 ciclos a 94 ºC por 30 s, un anillamiento a 48 ºC por 50 s y una extensión a 72 ºC por 80 s y una extensión final a 72 ºC por 4 min. Los productos se visualizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1% teñido con 0.5 ng µl^-1 de bromuro de etidio. Se utilizó el marcador de peso molecular ladder-100^MR (Axygen).

Caracterización morfológica y genética de los hongos con actividad antagónica

La identificación morfológica de los aislados obtenidos estuvo basada en las características de las colonias (color, tipo y forma) además de la morfología de conidios y conidióforos utilizando un microscopio óptico (^{Úrbaez et al., 2013}). Además, se realizaron montajes en laminillas utilizando el colorante lactofenol azul de algodón como solución, y se describieron las características particulares de las estructuras. Los hongos se identificaron siguiendo los criterios de ^{Barnett y Hunter (1998}); ^{Phillips et al. (2013}).

Para la caracterización genética, se extrajo el ADN genómico a partir de micelio siguiendo las instrucciones del fabricante del kit DNeasy Plant Mini Kit^MR (Qiagen Inc.). El ADN se cuantificó con un espectrofotómetro Take3^MR (Bioselec). Se amplificó por PCR la región ITS-1, el gen ribosomal 5.8S y el ITS-2 utilizando los iniciadores ITS-1fu 5`-tccgtaggtgaacctgcgg-3’ e ITS-4 5’-tcctccgcttatttgatatgc-3’ (^{White et al., 1990}). Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un termociclador Termo^MR, las cuales consistieron en una desnaturalización a 94 ºC por 1 min, un anillamiento a 55 ºC por 25 s, una polimerización a 72 ºC durante 50 s, con 35 ciclos, seguido de una extensión final a 72 ºC por 4 min. Los productos de PCR fueron secuenciados y comparados con secuencias del GenBank para confirmar la identidad de las cepas a nivel de especie.

Prueba de antagonismo in vitro

Se realizó una prueba preliminar para seleccionar las cepas que presentaran mayor efecto inhibitorio sobre los hongos patógenos. Las confrontaciones se realizaron con cada cepa de los microorganismos aislados contra los hongos fitopatógenos L. theobromae y F. meliae. Se sembró una azada de cada uno de los microorganismos en los cuatro puntos cardinales (3 cm de distancia del centro, en cajas Petri) en el medio PDLMA. Cuarenta y ocho horas después un explante de 0.5 cm de crecimiento de cada hongo fitopatógeno fue colocado en el centro. Las cajas fueron incubadas a 25 ±2 ºC durante 5 días. Cada microorganismo se tomó como un tratamiento con tres repeticiones, considerando cada caja Petri como una repetición y un control negativo con cada hongo sin antagonista. El ensayo se realizó dos veces.

La capacidad inhibitoria de los microorganismos se cuantificó midiendo el diámetro del crecimiento fúngico con un vernier, usando dos diámetros cardinales previamente dibujados en la parte baja de cada caja Petri como referencia.

El porcentaje de inhibición fue calculado usando la siguiente fórmula: (%) de inhibición = [(A1-A2)/A1] x 100. Donde: A1= crecimiento de la colonia del fitopatógeno (testigo); A2 = crecimiento de la colonia fungosa del fitopatógeno creciendo frente al actinomiceto.

Con base a los resultados de las pruebas preliminares de las confrontaciones in vitro, se seleccionaron las cepas M1-101 y M104 para un segundo ensayo por presentar los valores más altos de inhibición. Las cepas antagonistas fueron cultivadas en caldo papa dextrosa adicionado con extracto de levadura y extracto de malta al 0.3% (CPDLM), e incubadas a 25 ±2 ºC y 125 rpm durante 10 días. Posteriormente, el contenido fue centrifugado, filtrado y colocado en frascos estériles.

La actividad de inhibición de cada antagonista fue evaluada a concentraciones de 25, 50 y 100% del filtrado. La técnica consistió en esparcir por extensión 100 µl del antagonista. Posteriormente, fue colocado un disco de 5 mm del crecimiento micelial del fitopatógeno en el centro de la caja Petri. Además, se confrontó cada antagonista con los dos hongos fitopatógenos al mismo tiempo, para lo cual se esparcieron 100 µl del antagonista por el método de extensión en cajas e inmediatamente un disco del crecimiento micelial de cada hongo de 5 mm de diámetro fue colocado a una distancia de 4 cm entre ellos. Se realizaron observaciones diarias durante cinco días, al final de los cuales se midió el crecimiento micelial de los hongos, cuando el crecimiento del control cubrió por completo la caja Petri.

Inhibición de la germinación de conidios y micelio

Con base en los resultados preliminares se seleccionó la cepa M1-101 para la prueba de inhibición de la germinación de conidios y micelio de los hongos F. meliae y L. theobromae, respectivamente. La cepa M1-101 se sembró en 50 ml de caldo CPDLM mediante la adición de un cuadro de la cepa en agar de aproximadamente 1 cm² por cada matraz Erlenmeyer bafleado de 250 ml. Los matraces se incubaron en agitación a 125 rpm y 25 ±2 ºC durante 10 días. Al término del periodo de incubación, se filtró al cultivo y el filtrado se diluyó hasta tener concentraciones de 25, 50 y 100%.

Para la preparación del inóculo de los hongos fitopatógenos se usaron cepas incubadas por 6 días en papa dextrosa agar (PDA). Se agregaron 10 ml de agua destilada estéril a cada caja Petri para resuspender los conidios de F. meliae y el micelio de L. theobromae raspando la superficie de la caja con un asa bacteriológica. El inoculo se conservó en tubos cónicos de 15 ml.

La actividad de inhibición de la germinación del antagonista fue evaluada a concentraciones de 25, 50 y 100%. La técnica consistió en extender con ayuda de un asa de vidrio, 100 µl de cada concentración en cada caja Petri. Después de absorción, se añadieron 100 µl del inoculo de los fitopatógenos de la solución previamente preparada (conidios y micelio) de los fitopatógenos. Se evaluaron tres réplicas de cada concentración y las cajas Petri se incubaron a 25 ±2 ºC. Cada 24 h se realizaron observaciones para ver la inhibición de la germinación de conidios y los posibles cambios en la morfología del micelio.

El recuento de conidios germinados y no germinados fue realizado usando un microscopio compuesto (Leica DM500). Se contabilizaron 100 conidios cm^-2, 500 conidios en total (germinados y no germinados). Para determinar el porcentaje de conidios germinados se utilizó la siguiente fórmula: % germinación = (a/a+b) x 100. Donde: a = número de conidios germinadas; y b= número de conidios sin germinar. Con L. theobromae, sólo se observaron los cambios en la morfología del micelio inducido por la presencia de los compuestos antifúngicos, producidos por el antagonista a un nivel microscópico.

Caracterización morfológica y genética de los actinomicetos y bacterias bacilares

Las características de crecimiento colonial de los actinomicetos en cultivo fueron masas aéreas secas, polvosas, con bordes irregulares, de pigmentaciones variadas, observándose tonalidades de color amarillo, gris y otras de color anaranjado. Al microscopio (40X) mostraron las ramificaciones típicas de los actinomicetos. Por tinción Gram se observaron estreptobacilos esporulados Gram positivos.

Las bacterias mostraron tonalidades variables como amarillo y crema (Figura 1), con textura acuosa y bordes regulares. Mediante tinción Gram se observaron bacilos Gram positivos y Gram negativos. No se logró la identificación molecular de las cepas de actinomicetos por una falta de amplificación por PCR atribuida posiblemente a que los iniciadores o primers han sido más utilizados con otras bacterias y tal vez no tengan la especificidad suficiente para unirse a las secuencias de actinomicetos.

Figura 1 Bacterias aisladas del suelo. a) cepa A23 mostrando halo de inhibición; y b) cepa A18. 

Las bacterias bacilares obtenidas fueron amplificadas por PCR y se secuenció parte del gen 16S. Las secuencias consenso de las bacterias bacilares fueron comparadas con secuencias depositadas en el GenBank a través del programa Blast; la cepa A18 correspondió a Achromobacter xylosoxidans con un 96% de homología y A23 mostró 96% de similitud con Delftia sp.

Caracterización morfológica y genética de los hongos con actividad antifúngica

Las colonias de la cepa M104 en medio de cultivo fueron de color blanco, compactas y con bordes irregulares, y el micelio de la cepa M5-102 de color café (Figura 2). La cepa M104 fue identificada como Penicillium sp. Las características del conidióforo mostraban forma de escobilla y conidios hialinos, unicelulares en forma cilíndrica. La cepa M5-102 presentó conidióforos y cabezas aspergilar, conidios hialinos, unicelulares y cilíndricos; esta cepa fue identificada como Aspergillus sp. La identificación morfológica fue confirmada por su secuencia de ADN, correspondiendo a Penicillium citrinum y Aspergillus sp.

Prueba de antagonismo in vitro

Acromobacter xylosoxidans redujo el crecimiento micelial de L. theobromae 63% y a F. meliae 59%. Por otro lado, Delftia sp. inhibió en un 39% a ambos hongos fitopatógenos. Aspergillus sp., redujo 82% el crecimiento de L. theobromae y a F. meliae en 83%. La cepa identificada como P. citrinum fue capaz de reducir el crecimiento micelial de L. theobromae en 83% manteniéndolo inhibido durante más 20 días. Los valores más altos de inhibición se obtuvieron con el hongo P. citrinum (M104) y acinomicetos M4R, y M1-101, los cuales mostraron porcentajes de inhibición de 85, 84 y 91% contra L. theobromae y 91, 83, y 91%, contra F. meliae respectivamente.

En la prueba de inhibición con las diferentes concentraciones de los filtrados del actinomiceto y P. citrinum (25, 50 y 100%), hubo diferencias estadísticamente significativas (p< 0.001) en el porcentaje de inhibición de los patógenos. El control presentó el crecimiento micelial más alto a los 5 días, después de que los hongos se colocaron en PDA. Los hongos L. theobromae y F. meliae tuvieron un crecimiento similar, no mostrando diferencias significativas entre ellos. Los tratamientos que mostraron mayor inhibición de los patógenos fueron L. theobromae y F. meliae frente a P. citrinum al 100%, seguido por L. theobromae + P. citrinum y F. meliae + P. citrinum con la concentración al 100%. No hubo diferencias entre las tres concentraciones de la cepa M101 contra F. meliae. En la prueba de inhibición con las diferentes concentraciones de los filtrados del actinomiceto y P. citrinum (25, 50 y 100%), hubo diferencias estadísticamente significativas (p= 0) en el porcentaje de inhibición de los patógenos.

Figura 2 Microorganismos con actividad antifúngica. a) colonias de la cepa M1-101 en PDA; b) bacilos Gram positivos observados al microscopio; c) cepa M5-102 en PDA; d) conidióforos y cabezas aspergilar de Aspergillus sp.; e) cepa M104 en PDA; y F) conidióforos, fiálide y conidias de P. citrinum. 

Inhibición de la germinación de conidios

L. theobromae a las 96 h de incubación cubrió por completo la caja Petri sin obtenerse ninguna estructura reproductiva. Sin embargo, en presencia del antagonista, L. theobromae produjo clamidosporas de color café oscuro y células conidiógenas (Figura 3). Con la confrontación, los conidios de F. meliae son inhibidos y no fueron capaces de germinar, se observó que los conidios se agrupan y engrosan tendiendo a formar clamidosporas (Figura 3).

Figura 3 Crecimiento de L. theobromae bajo condiciones de confrontación. a) células conidiógenas; b) y c) clamidosporas.