Introducción

El hongo Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon y Maubl. es clasificado dentro de los Ascomicetos, en el orden Botryosphaeriales y familia Botryosphaeriaceae (^{Schoch et al., 2006}; ^{Slippers et al., 2013}). Es un hongo saprófito, endófito y se considera patógeno latente. No obstante, es patógeno cuando el hospedero está estresado (^{Rubini et al., 2005}; ^{Mohali et al., 2005}).

El hongo provoca la muerte regresiva de las ramas, lesiones en los tallos, genera goma y pudriciones de frutos en post cosecha (^{Sánchez et al., 1989}; ^{Herrera et al., 1993}). En campo, en el cultivo de naranja valencia y pomelos ruby red, los daños por L. theobromae consisten en: defoliación y presencia de goma en las ramas secundarias, necrosis del floema y xilema.

Por otro lado, también, ocasiona daños al cultivo de mamey [Pouteria sapota (Jacq.) H. E. Moore y Stearn], uva (Vitis vinifera L.), aguacate (Persea americana Mill), kumquat [Fortunella margarita (Lour.) Swingle] y mango (Mangifera indica Lin.) (^{Úrbez y Gubler, 2011}). En estos árboles, L. theobromae puede presentarse solo o en interacción con Colletotrichum sp., Fomitoporia maxonii y Fusarium sp. Dicha interacción provoca clorosis, necrosis, cribados, cancros, tizones, podredumbres húmedas o secas, momificaciones, agallas, costras y marchitez (^{Kimati et al., 1995}).

También, se ha demostrado la interacción de L. theobromae con Fomitiporia maxonii Murrill; Alternaria citri Ellis y Pierce; Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc; Fusarium solanii (Mart.), Appel y Wollen, Fusarium sp, Dothiorella sp, Phytophthora (Oomicetes), Cephaleuros virescens, Kunze) y C. Liberibacter asiaticus (^{Cabrera et al., 2012}, ^{Cabrera et al., 2017}). Por lo anterior, en el presente trabajo se determinó la presencia de L. theobromae en árboles de cítricos con deterioro y muerte descendente en la zona centro de Tamaulipas, México en 2017 y 2018.

Materiales y métodos

Resultados

Se determinó la presencia del hongo en los sitios prospectados caracterizando los daños y síntomas en los árboles (Figura 1). Se aislaron 33 cepas de hongos en las 19 huertas comerciales (Cuadro 2). De las cuales, 20 cepas fueron recolectadas en el limón italiano, 11 en naranja valencia, 1 en mandarina y 1 en el cultivo de toronja. En los árboles, 13 cepas fueron recolectadas en el tronco, 13 en las ramas, 3 en frutos, 3 en la raíz y uno en las hojas.

Figura 1 Síntomas de daños en cítricos: gomosis en ramas (a), daño en corteza y leño (b) y (c); pudrición en fruto con crecimiento de micelio (d). 

Del total de las cepas recolectadas, 26 pertenecieron al género Lasiodiplodia sp., 3 de Botryosphaeria sp., 1 de Colletotrichum sp., 1 de Cyphellophora sp., 1 de Fusarium sp. y 1 de Nigrospora sp.

De las cepas del género Lasiodiplodia sp., 17 cepas fueron aisladas del cultivo de limón italiano, 7 en naranja valencia, 1 en mandarina y 1 en toronja. En las estructuras de los árboles, 13 cepas fueron recolectadas en el tronco, 10 en las ramas y 3 en los frutos. Mientras que, las tres cepas del género Botryosphaeria sp. fueron recolectadas en las ramas del cultivo de naranja valencia. En contraste, la cepa Colletotrichum sp., Cyphellophora sp. y Fusarium sp., fue recolectada de la raíz de los árboles de limón italiano y la cepa del género Nigrospora sp., fue recolectada en la hoja de esta misma especie de cítrico (Cuadro 3).

Por otro lado, en el caso de las cepas del género Lasiodiplodia sp., las colonias en medio de cultivo a los 10 días desarrollaron un micelio algodonoso color blanco y abundante, posteriormente a los 16 días cambió a un tono gris oscuro (Figura 2) a partir de ahí, estas presentaron paráfisis hialinos, picnidios ostiolados solos o agregados en el tejido estromático, conidios inmaduros hialinos, elipsoides, granulosos y de base truncada. Asimismo, conidios maduros de color café oscuro, elipsoides, con estrías longitudinales y base truncada (Figura 3).

Figura 2 Micelio de Lasiodiplodia sp. (a), a los 10 días el color del micelio es blanco y cubre toda la caja, a los 16 días se tornó a un color gris con centro negro (b). 

Figura 3 Micelio (a), conidios maduros (b) y jóvenes (c) de Lasiodipodia sp. 

Caracterización genética de las cepas aisladas de L. theobromae

De las cepas aisladas, se obtuvieron 17 secuencias consenso de 542 pares de bases de la región ITS1/5.8S rDNA/ITS2 y 17 secuencias de 314 pares de bases del factor de elongación EF-1α. Las diecisiete secuencias de la región ITS1/5.8S rDNA/ITS2 mostraron homología de 100% con la especie L. theobromae (HM466958). Estas secuencias no mostraron diferencias genéticas entre si. Por lo anterior, fueron agrupadas en una sola secuencia consenso. Después, esta secuencia fue registrada en el Centro Nacional para la Información Biotecnológica con el acceso MK886711.

Por otro lado, las 17 secuencias del factor de elongación EF-1α no mostraron diferencias genéticas entre sí. Debido a esto, fueron agrupadas en una sola secuencia de consenso. Después, estas fueron comparadas con secuencias de L. theobromae descargadas del NCBI. La secuencia mostró homología de 100% con la especie L. theobromae. Finalmente, la secuencia analizada fue depositada en el NCBI con el número de acceso MK531139.

La construcción del árbol filogenético permitió agrupar las 17 secuencias ITS encontradas en ocho grupos o clados de acuerdo con la homología en las secuencias (Figura 4). Mientras que en el árbol filogenético de las secuencias TEF1 alfa, se agruparon en tres clados principales (Figura 5). En ambas construcciones se muestran una estrecha relación genética entre los aislados, Aunque las muestras provenían de diferentes municipios y ejido. La historia evolutiva se infirió utilizando el método de unión de vecinos de Neighbor-Joining. El árbol está dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades que las distancias evolutivas para inferir el árbol filogenético.

Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de máxima probabilidad compuesta. El análisis involucró 17 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1ª + 2ª + 3ª. Se eliminaron todas las posiciones que contenían lagunas y datos faltantes. Hubo un total de 507 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en Mega 7.

Figura 4 Análisis filogenético generado de las secuencias de la región del ITS ribosomal de las cepas aisladas de L. theobromae. El dendograma se obtuvo a partir del análisis por el método del ‘vecino más cercano’ basado en el método de Neighbor-Joining utilizando el programa Mega 7. 

Figura 5 Análisis filogenético generado de las secuencias del factor de elongación EF-1α del hongo L. theobromae. El dendograma se obtuvo a partir del análisis por el método del ‘vecino más cercano’ basado en el método de Neighbor-Joining utilizando el programa Mega 7. 

Discusión

En diferentes partes del mundo el hongo L. theobromae es reportado en los árboles de cítricos (^{Al-Sadi et al., 2014}; ^{Adesemoye et al., 2014}; ^{Rodríguez et al., 2016}). En México, L. theobromae ha sido reportado causando distintas enfermedades en varios cultivos principalmente frutícolas. En el presente trabajo, el hongo fue aislado del cultivo de naranja valencia, limón italiano, mandarina y toronja en el municipio de Güémez, Llera de Canales, Padilla y Victoria Tamaulipas.

En Llera de Canales, ^{Polanco et al. (2019)} reporto a este hongo en los árboles de naranja valencia. Mientras que, en el presente trabajo, el hongo fue reportado en el cultivo de limón italiano y naranja valencia en la huerta comercial ‘Las Angélicas’ y ‘La Cecilia’. También estos autores reportaron al hongo en el cultivo de naranja valencia en General Terán y Montemorelos, Nuevo León.

En los sitios donde se ha registrado el hongo, se ha asociado con la muerte regresiva y se ha aislado constantemente de las ramas, corteza, tejido vascular y frutos de las plantas afectadas (^{Mullen et al., 1991}; ^{Moghal et al., 1993}; ^{Mohali et al., 2005}). Por ejemplo, en Venezuela, L. theobromae se aisló de árboles cítricos con síntomas de muerte regresiva y gomosis (^{Ferrari et al., 1996}). En China, L. theobromae genero gomosis en plantas de Jatropha podagrica (^{Fu et al., 2007}).

Mientras que, en la India este hongo fue el agente causal de la podredumbre en la raíz y de la enfermedad de la podredumbre del collar en J. curcas (^{Latha et al., 2009}). En el presente trabajo, en los árboles de ambas especies de cítricos, el hongo fue recolectado en ramas y troncos con pudrición del xilema, en corteza y ramas secas con presencia de goma. Mientras que, ^{Polanco et al. (2019)} lo reportaron en los árboles con síntomas de muerte regresiva y necrosis en el tronco y ramas. ^{Cedeño y Palacios (1992)}, mencionan que L. theobromae produce gomosis y lesiones en las plantas de cítricos, síntomas parecidos a los observados en el campo.

Del total de las cepas recolectadas, 26 pertenecieron al género Lasiodiplodia sp., 3 de Botryosphaeria sp., 1 de Colletotrichum sp., 1 de Cyphellophora sp., 1 de Fusarium sp. y 1 de Nigrospora sp. De las cepas del género Lasiodiplodia sp., 17 cepas fueron aisladas del cultivo de limón italiano, 7 en naranja valencia, 1 en mandarina y 1 en toronja. ^{Cabrera et al. (2012)} en su estudio describe que las plantaciones de cítricos en estado de estrés y deterioro son importantes fuentes de inóculos de hongos fitopatógenos. Los frutales tropicales son hospedantes de un gran número de estos agentes que causan serios daños en los diferentes órganos de estas plantas, reducen su vida productiva, rendimiento y pueden ocasionar la muerte de estas.

En el caso de la muerte descendente de ramas en cítricos, esta no es una enfermedad exclusiva de este hongo, ya que las especies de L. theobromae se presentan de forma conjunta con N. mangiferum y N. parvum de la familia Botryosphaeriaceae y causan desórdenes de declinación de árboles y pudriciones del pedúnculo del cultivo de mango (^{Sakalidis et al., 2011}).

Además de la interacción con otros hongos fitopatógenos, L. theobromae interacciona con el HLB,^{Cabrera et al. (2017)} sugiere que C. liberibacter puede afectar de alguna manera los mecanismos de resistencia o inmunidad de la planta a determinados patógenos como hongos y algas entre otros, y de ahí, desencadenarse la enfermedad como tal. En tal sentido, los resultados infieren que la bacteria pudiera provocar una inmunodeficiencia en las plantas de cítricos. El grado de incidencia de ramas secas parece estar en función del avance de la enfermedad y el grado de debilitamiento de la planta, principalmente en aquellas que manifiestan los síntomas de HLB.

Se ha demostrado la interacción positiva y el deterioro acelerado hasta su muerte, que sufren los árboles de cítricos cuando son afectadas a la vez por HLB y L. theobromae. Se comprobó, mediante ensayos de inoculación de estos hongos en plantas sanas y enfermas con HLB, que las plantas con el hongo y el HLB fueron las más afectadas y exhibían una muerte regresiva más severa (^{Cabrera et al., 2012}). En el presente estudio, L. theobromae fue recolectado en árboles con presencia de la bacteria C. liberibacter asiaticus en psílidos; esto acelera el deterioro final del árbol enfermo.

^{Nariani y Singh (1971)}, atribuyeron a los hongos C. gloeosporioides; L. theobromae y Fusarium sp. el deterioro acelerado y muerte regresiva de las plantas tras la defoliación causada por HLB. En tal sentido se pudiera considerar que estos patógenos, la mayoría presentes en los cítricos, también ejercen un rol importante en la defoliación inicial. Si se toma en consideración que las plantas afectadas por HLB muestran una abscisión de frutos considerable, con una caída prematura de 60% al 70%. Esto permitiría inferir que otros hongos, como los señalados y no solamente la bacteria C. liberibacter asiaticus, pudieran ser los máximos responsables de la caída de frutas y de síntomas en plantas con un complejo cuadro patogénico (^{Gottwald et al., 2012}; ^{Cabrera et al., 2017}).

Conclusiones

Los resultados de caracterización sintomatológica, morfológica, análisis de secuencias ITS y factor de elongación 1 α, determinaron que L. theobromae está presente y se asocia a los síntomas de momificación y pudrición de frutos, gomosis, pudrición y muerte descendente en ramas y árboles de diferentes variedades de cítricos, además se detectó a C. gloesporoides, C. eucalipti y F. keratoplasticum en raíces podridas de árboles con presencia de L. theobromae donde se evidencia una posible asociación con el deterioro de los árboles. Este documento es el primer reporte sobre L. theobromae en la región centro de producción citrícola en Tamaulipas.