Recolección y acondicionamiento de muestras

Las biomasas de chiles tipo pimiento morrón, variedad Thames, chile poblano variedad Allende y chile jalapeño variedad Orizaba se recolectaron en estado senescente (mezcla de hojas y tallos 25% y 75%, respectivamente), en el valle agrícola de Culiacán, Sinaloa, México, durante 2022. Se deshidrataron en un horno semi industrial durante 12 h a 60 °C, se molieron en un pulverizador Pulvex, se tamizaron en un tamiz de 0.45 mm y se conservaron a -15 °C hasta su uso.

Tamizaje fitoquímico

Los fitoquímicos se extrajeron por maceración, durante 24 h a 30 °C, a 700 rpm. Se usó hexano (Hx), cloruro de metileno (CM) y metanol (MeOH). Los extractos se filtraron con papel Whatman número 1 y se conservaron a -20 °C hasta su uso. La identificación de los fitoquímicos se realizó mediante técnicas colorimétricas (^{Harborne, 1984}).

Determinación de compuestos fenólicos totales (CFT), ligados (CFL) y flavonoides totales (FT)

Se extrajeron los CFT y FT con EtOH al 80%, mediante un baño ultrasónico, a 45 °C durante 45 min. Se centrifugaron los extractos a 10 000 rpm durante 15 min a 4 °C. Se recuperó el sobrenadante y conservó a -15 °C hasta su uso. Para obtener los CFL, al pellet resultante de la extracción anterior, se le adicionó 10 ml de NaOH 2N y se calentó durante 30 min a 95 °C. Después se dejó en agitación durante 1 h a 25 °C. Terminado el tiempo se le adicionó 2 ml de HCI concentrado y 10 ml de Hx, se centrifugó a 10 000 rpm durante 10 min a 4 °C.

Se desechó el sobrenadante y al pellet resultante se le añadió 10 ml de acetato de etilo. Se concentró la muestra en un rotavapor y se recuperaron los CFL con 2 ml de EtOH al 80%. Para determinar los CFT y CFL se siguió el método de Folin-Ciocalteu (FC) descrito por ^{Swain y Hillis (1959}). Los resultados se expresaron como mg equivalentes de ácido gálico (EAG) por 100 g de muestra seca La determinación de FT se realizó por el método de cloruro de aluminio, descrito por ^{Ebrahimzadeh et al. (2015}). Los resultados se expresaron como mg equivalentes de quercetina (EQ) por 100 g de muestra seca. Ambas determinaciones se leyeron en un espectrofotómetro Synergy HT (Biotek, USA) a 725 y 415 nm, respectivamente.

Actividad antioxidante (AOX)

Se evaluó la capacidad captadora de radicales de oxígeno (ORAC), mediante la metodología descrita por ^{Huang et al. (2002}), los resultados se expresaron como µmoles equivalentes de Trolox (ET) por 100 g de muestra seca. La capacidad reductora de radicales catiónicos ABTS^•+ se efectuó mediante el método propuesto por ^{Thaipong et al. (2006}). La capacidad reductora del radical DPPH se efectuó siguiendo el método de ^{Karadag et al. (2009}). Para ambas determinaciones los resultados se expresaron como mmoles ET 100 g^-1 de muestra seca. La cuantificación se efectuó en un lector de microplacas Synergy HT (Biotek, USA) a 734 y 540 nm, respectivamente.

Cuantificación de capsaicinoides HPLC

Los capsaicinoides se extrajeron con acetonitrilo (ACN) asistido por sonicación durante 1 h a 65 °C. El extracto se filtró mediante un acrodisc de nylon de 0.45 μm. Se usó un cromatógrafo tipo HPLC Varian 9012, acoplado a un detector de fluorescencia Varian ProStar 363. Se usó una columna C18 Eclipse XBD Agilent. La fase móvil consistió en una mezcla de 49:50% agua MiliQ y ACN, acidificando con 1% v/v de ácido acético.

Las condiciones de detección fueron longitud de onda de excitación 280 nm y emisión 325 nm (^{Daood et al., 2015}). Se usaron estándares grado analítico de capsaicina (CAP) (8-Methyl-N-vaillyl-trans-6-nonenamida) 99% y mezcla de capsaicinoides UPS 90% (dihidrocapsaicina DHC y nordihidrocapsaicina NDHC).

Determinación de compuestos orgánicos volátiles vía GC-MS/MS

Se analizaron los extractos de MeOH y ACN. Se usó un cromatógrafo de gases Agilent 7890B con detector de espectrometría de masas de trampa iónica (CG-MS/MS Agilent 240). Se usó una columna VF-5 MS, 30 m x 0.25 mm x 0.25 µm. Se usó como gas de arrastre helio a un flujo de 1 μl min^-1. Los compuestos se identificaron mediante la biblioteca de espectros de masas del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología, por sus siglas en inglés (NIST).

Análisis estadístico

Los resultados del contenido de compuestos fenólicos, flavonoides y AOX se contrastaron con un análisis de varianza y un modelo lineal general (Anova) de un factor (tipo de biomasa) y tres niveles (chile jalapeño, poblano y pimiento morrón). Se utilizó la prueba de Tukey al 95% para determinar las diferencias estadísticas entre las biomasas.

Tamizaje fitoquímico

La diversidad genética del chile es amplia dando como resultado diferentes variedades y tipos, los cuales difieren en su composición nutricional y fitoquímica (^{Hernández-Pérez et al., 2020}). Según el tamizaje fitoquímico (Cuadro 1), se observó en los extractos metanólicos de las tres biomasas una abundancia y variedad de grupos de metabolitos secundarios, resaltando los flavonoides, saponinas, terpenoides, esteroles, alcaloides, cumarinas y quinonas.

Estos resultados concuerdan con ^{Swamy et al. (2018}) donde identificaron taninos, flavonoides y terpenoides de tallos de C. annuum longum. ^{Bhat y Rajanna (2017}) reportaron la presencia de polifenoles, taninos, flavonoides, alcaloides, glicósidos, terpenos y saponinas en tallos de C. annuum var. glabriusculum. En las hojas de C. chinense, también se han identificado taninos, flavonoides, polifenoles, alcaloides y terpenoides (^{Gayathri et al., 2016}). El perfil de metabolitos secundarios presentes en las biomasas de chile es similar entre especies (Cuadro 1).

Cuantificación de CFT, CFL y FT

Las tres biomasas presentaron cantidades importantes de CFT, CFL y FT (Cuadro 2), resaltando la biomasa de chile poblano. Se ha observado una mayor acumulación de metabolitos, en las hojas y tallos que en los frutos de diferentes especies de Capsicum. ^{Barrajón-Catalán et al. (2020}), analizaron el metaboloma del pimiento morrón var. Palermo, mostrando un mayor contenido de flavonoides, que en los frutos. Estos resultados son relevantes para optar por la extracción de flavonoides y ácidos fenólicos de biomasas de chiles.

^{Chen y Kang (2014}), analizaron el contenido de CFT de tallos de las variedades PR star y Chengyang, resaltando que las concentraciones (9 190 mg EAG g^-1) fueron superiores a las mostradas por el pericarpio y la placenta. Las hojas de chile var. Special, mostraron un elevado contenido de CFT (1 714.2 ±47.72 mg equivalentes de catequina ECAT 100 g^-1), siendo superior a lo reportado en frutos (731.75 ±19.64 mg ECAT 100 g^-1) (^{Kim et al., 2011}).

Dichos resultados son similares a lo reportado en la presente investigación, como se pudo observar, los hojas y tallos de diferentes especies de Capsicum son abundantes en compuestos fenólicos. Las variaciones de CFT, CFL y FL entre especies se pudieron deber a las condiciones de cultivo, estrés biótico y abiótico, nutrición, exposición a luz solar, genotipo, manejo cultural entre otros factores extrínsecos (^{Lozada et al., 2023}).

Actividad antioxidante

Se demostró la AOX que ejercen las biomasas de chiles sobre radicales y su capacidad para donar protones y electrones, sobresaliendo la biomasa de pimiento morrón (Cuadro 2). Los autores ^{Kim et al. (2014}), analizaron las hojas de tres variedades de chiles coreanos, resaltando la variedad Blackcuban por mostrar una IC₅₀ de inhibición de los radicales DPPH y ABTS con 49.2 y 26.2 µg ml^-1, respectivamente. También hojas de chile var. Sweet Italian, han demostrado inhibir el radical DPPH y O₂ ^₋ con porcentajes de inhibición de hasta 80 y 90%, respectivamente esto con concentraciones de 1 mg ml^-1 (^{Silva et al., 2014}).

Se logró demostrar la AOX, de los extractos de las tres biomasas de chiles, resaltando el ensayo ORAC por obtener mayor inhibición, este ensayo se caracteriza por simular el proceso de oxidación a nivel celular causado por el oxígeno (^{Prior, 2015}). Este efecto se relaciona con la estructura molecular de los flavonoides, en particular por la presencia de grupos OH y dobles enlaces, así como su naturaleza aromática (^{Chen et al., 2020}).

Cuantificación de capsaicinoides

En esta investigación a pesar de que el tamizaje fitoquímico arrojó abundancia de alcaloides, en la cuantificación por HPLC (Figura 1), solo se detectó la presencia de DHC en concentraciones de 1.762 y 0.618 µg kg^-1 esto en las biomasas de chiles jalapeño y poblano, respectivamente. No se detectó CAP ni NDHC.

Figura 1 Cromatograma de cuantificación de capsaicinoides en biomasas de chiles. NDHC= nordihidrocapsaicina; CAP= capsaicina; DHC= dihidrocapsaicina. 

^{Simonovska et al. (2016}), cuantificaron CAP (28.75 mg kg^-1) en tallos de C. annuum var longum conoides. ^{Silva et al. (2014}), cuantificaron CAP en hojas de chile var. Sweet Italian reportando 78.3 mg kg^-1. Por su parte, ^{Estrada et al. (2002}), cuantificaron CAP (19.99 ±7 µg g^-1) y DHC (27.28 ±0.3 µg g^-1), está última encontrándose en mayor cantidad en las hojas que en los tallos.

La biosíntesis y el metabolismo de los capsaicinoides difieren del tipo de chile y el cultivar así como temperatura de crecimiento y estadio de maduración (^{Rahman et al., 2012}), estos compuestos normalmente se biosintetizan en las vacuolas de la placenta, en las semillas y en el septo de los frutos (^{Aza-González et al., 2011}).

Identificación de compuestos orgánicos volátiles vía GC-MS/MS

Se identificaron principalmente triterpenos y fitoesteroles como el campesterol, stigmasterol, β y γ sitoesterol, y β-amirina. También se identificaron algunos alcaloides como la atropina (C₁₇H₂₃NO₃) y sus derivados, esto puede explicar la abundancia de alcaloides en los extractos metanólicos. Se identificó el fitol un alcohol diterpénico, el cual presenta actividad antiinflamatoria y antioxidante.

Los fitoesteroles identificados en las biomasas de chiles podrían ser valorizados por la industria farmacéutica para la obtención de nutracéuticos ya que estos compuestos tienen una relación directa con el metabolismo de lípidos, ayudando a disminuir los niveles de colesterol en sangre y coadyuvar a tratar patologías relacionadas con la hipercolesterolemia (^{Li et al., 2022}).