Colecta de muestras de suelo y aislamiento de hongos nativos

Se colectaron 60 muestras de suelo cultivado con caña en Acatlán de Pérez Figueroa, Oaxaca. El muestreo fue realizado en tres temporadas en el año 2016 en las cuales se recogieron 300 g de cada muestra en bolsas siplox que fueron etiquetadas y trasladadas en hieleras al laboratorio de patología de insectos del Colegio de Posgraduados donde fueron aisladas. Para el aislamiento de hongos entomopatógenos se utilizó la técnica del insecto trampa (^{Zimmermann, 1986}), para la cual las muestras de suelo fueron colocadas en vasos de 10 cm de altura por 5 cm de diámetro a los cuales se les colocaron cinco larvas de Galeria mellonella y se monitorearon hasta que las larvas pasaron al estado de pupa.

En los vasos con suelo contaminado con esporas de Beauveria se observaron larvas con micelio blanco y después de cinco días de estas larvas se aisló el hongo en el medio agar dextrosa saboraud (ADS) (Bioxon^®) y se incubó a 32 °C + 2. Todos los hongos crecidos fueron colocados en viales de 20 ml con medio ADS y guardados para la amplificación de su ADN por la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Extracción de ADN y Amplificación de producto por PCR

La extracción de ADN por PCR se hizo en el laboratorio de la Facultad de Ciencias Agrícolas y Pecuarias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP) en el año 2020. Para lo cual se desarrollaron cinco aislados con características morfológicas de Beauveria en papel celofán adherido sobre la superficie del medio de cultivo ADS por cinco días a 30 °C + 2. El micelio obtenido fue cosechado con una espátula y colocado en viales de 1.5 ml y posteriormente fue liofilizado por 24 h.

Posteriormente este micelio fue macerado con un micropistilo y Nitrógeno líquido en viales de 1.5 ml y se siguieron las instrucciones del fabricante del kit (Qiagen^®) para extraer el ADN el cual fue visualizado en un gel de agarosa y un transiluminador (UVP, Modelo 3UV-LMS26), cada muestra de ADN obtenida se almacenó en un refrigerador a 7 °C. Para la amplificación de la región ITS del gen 5.8S rRNA por PCR se utilizaron los primers ITS1: 5’-ATTACCGAGTTTTCAACTCCC-3’ y ITS2: 5’-ACCTGATTCGAGGT CAACGTTC-3’ (^{White et al., 1990}) y un kit (Promega madison), de acuerdo con el procedimiento descrito por ^{Rehner y Bunkley (2005}).

La mezcla de reacción se preparó a un volumen final de 50 µl e incluyó 0.2 µM de cada primer; 20 mM de TrisHCl; 50 mM KCl; 2.5 mM MgCl₂; 0.1 mM de cada deoxinucleotido (dATP, dCTP, dGTP y dTTP); 1 U Taq DNA polimerasa y 50 ng de DNA genómico. Las muestras fueron amplificadas mediante un programa de 15 s a 94 °C, seguido por 40 ciclos de 94 °C a 15 s, 50 °C a 30 s, 72 °C a 30 s) y una extensión final de 7 min a 72 °C. El producto amplificado fue secuenciado por los laboratorios Macrogen en Corea. Las secuencias fueron editadas con el programa BioEdit versión 7.1.9 (^{Hall, 1999}) y el árbol filogenético fue generado con el método Neighbor-joining con el programa Mega versión 3.6 (^{Tamura et al., 2013}).

Eficacia de mortalidad y micosis de aislados sobre larvas de Galleria mellonella

Para el establecimiento del bioensayo se prepararon concentraciones de 1x10⁶ esporas ml^-1 de cada aislado identificado, además se usaron una cepa comercial de Beauveria bassiana (PHC) y un testigo, con cada una de estas se inocularon 12 larvas distribuidas sobre seis círculos de papel sanita; es decir, dos larvas por círculo de papel humedecido con 300 µl de agua destilada estéril. Todas las cajas con larvas fueron colocadas a temperatura ambiente y el número de larvas vivas, número de larvas muertas, número de larvas con micosis fueron registrados a las 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168.

Diseño experimental y análisis estadístico

El experimento fue completamente al azar con siete tratamientos (cinco aislados comparados más un aislado comercial y un testigo) donde la unidad experimental fue una larva y se repitió dos veces en el tiempo para disminuir el error estándar que se pudiera generar en el análisis estadístico y obtener resultados confiables. Con los resultados obtenidos del experimento se realizó un análisis estadístico con el paquete estadístico ^SAS para Windows 9.0 en un arreglo factorial (dos factores; factor= aislado y factor= tiempo de muerte y micosis). Se llevó a cabo una comparación de medias con la prueba Tukey para determinar si hubo diferencia significativa entre los resultados de las variables (número de larvas muertas y número de larvas con micosis).

Amplificación por PCR del ADN de los aislados nativos

Se logró amplificar por PCR el ADN de cinco aislados con características morfológicas al género Beauveria. El ADN amplificado fue visualizado entre 200 a 350 bp al ser comparadas con un marcador de peso molecular de manera similar a los resultados de la amplificación de la región ITS obtenidos por ^{Rehner y Buckle (2005}); ^{Zhang et al. (2020}) para identificar especies de Beauveria bassiana extraídas de diferentes regiones y estudiar su diversidad.

Los números de accesiones al banco de genes generados con el registro de los aislados se muestran en la Figura 1, en la cual también se observa la posición filogenética de cada uno ellos dentro de árbol el cual se obtuvo de los datos ITS del gen 5.8S rRNA por el método de Neighbor-joining (^{Tamura et al., 2013}). Los resultados de este análisis posicionaron a todos los aislados en el género Beauveria con cuatro aislados de Beauveria bassiana y una de Beauveria pseudobassiana (Figura 1).

Figura 1 Filogenia de aislados de Beauveria. Se usó como referencia secuencias de la colección USDA-ARS de números de acceso: MT111139.1 y MN960454.1 de cultivos fúngicos. Se muestran los valores de bootstrap por arriba de 80%. 

Este resultado mostró bajo número de aislamientos extraídos, además de baja diversidad, a diferencia de los resultados obtenidos por ^{Pérez-González et al. (2014}); ^{Medo et al. (2016}); ^{Serna-Domínguez et al. (2019}), quienes encontraron mayor diversidad de este género en diferentes sitios, así mismo, esto autores mencionan la asociación de grupos genéticos de Beauveria bassiana con el origen geográfico y tipos de hábitats, factores que podría estar implicado en la baja diversidad en este caso, debido a que sólo se tuvieron muestras de un lugar.

Por otra parte, de acuerdo con ^{Serna-Domínguez et al. (2019}); ^{Toledo et al. (2019}) es común detectar diversidad intraespecífica en este género de hongo además de dominancia de algunos de ellos en suelos agrícolas, y aunque en este caso no se analizó diversidad dentro de la especie si hubo dominancia de la especie Beauveria bassiana en este lugar de estudio.

Mortalidad y micosis de aislados sobre larvas de Galleria mellonella

Mortalidad de Galleria mellonella causada por aislados nativos de Beauveria: el análisis estadístico de los datos mostró diferencia significativa entre las interacciones de los factores, aislados x tiempo (p≤ 0.05) y aunque se observó diferencia en el aislado 11 (100% de mortalidad a las 96 h) (Figura 2).

Figura 2 Porcentaje acumulado de larvas muertas por efecto de cada uno de los aislados. 

Estadísticamente no se observó diferencia significativa entre los aislados, pero si con el testigo, incluso con el aislado identificado como Bauveria pseudobassiana y el aislado comercial los cuales tuvieron el 100% de la mortalidad hasta las 168 h. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por ^{Ibrahim et al. (2016}); Tuncsoy et al. (2020) quienes reportan mortalidad hasta de 98 y 100% con 1x10⁶ esporas ml^-1 de Beauveria bassiana después de 1.7 días de la aplicación. Asimismo, ^{Vertyporokh et al. (2019}) mencionan que Beauveria bassiana mata al huésped infectado por destrucción mecánica de sus tejidos con el micelio en crecimiento y por la acción de metabolitos secundarios secretados.

Por otra parte, hubo diferencia en los tiempos en que murieron las larvas (p≤ 0.05), donde se observó que la mayor cantidad de larvas murió a las 96 h; es decir, que al aplicar esporas de los aislados sobre larvas de Galleria mellonella L., se debe esperar su efecto después de 72 h y mayor mortalidad a las 96 horas (Cuadro 1).

Resultados similares fueron obtenidos por ^{Alcazar (2007}) en un estudio realizado con seis aislados en los cuales la mortalidad fue a las 72 h en todos los aislados probados, excepto en uno que presentó mayor actividad enzimática a las 48 h. También ^{Vertyporokh et al. (2019}) observaron actividad antifúngica en la hemolinfa de larvas infectadas por Beauberia bassiana a las 96 h después de la infección.

En adición, de acuerdo con los resultados alcanzados en este estudio, ^{Vertyporokh et al. (2019}); ^{Boston et al. (2020}); ^{Zhang et al. (2020}) mencionan que a pesar que en las poblaciones de Beauveria se ha encontrado una baja diversidad genética, las especies muestran diferencia en su virulencia la cual está directamente relacionada con la mortalidad y aquellos organismos cuyos mecanismos de defensa o virulencia parecen ser más efectivos pueden sobrevivir a cierta dosis de esporas.

Micosis de los aislados nativos de Beauveria sobre larvas de Galleria mellonella: se observó diferencia significativa en las interacciones de los factores micosis y tiempo (p≤ 0.05). Asimismo, también se observó el efecto de micosis de los aislados de manera independiente, donde el aislado 11 identificado como Beauveria bassiana fue diferente (p≤ 0.05) al testigo con 100% de micosis, incluso fué diferente al aislado comercial PHC (20% de micosis) y Beauveria seudobassiana (60% de micosis).

Algunos autores como ^{Hajek et al. (2018}); ^{Hajek et al. (2021)} mencionan ventajas en la capacidad de micosis de aislados de hongos ya ésta representa una oportunidad de dispersión de esporas para provocar epizootias y reducir poblaciones de insectos. Por otra parte, hubo diferencia significativa en los tiempos en que se presentó la micosis de larvas (p≤ 0.05) (Cuadro 2) y la mayor cantidad de larvas con micosis se observó a las 96 h (Figura 3).

Figura 3 Porcentaje de larvas con micosis por efecto de cada uno de los aislados. 

El tiempo de micosis reportado por ^{Quintero-Zapata et al. (2020}) fue de 48 h en larvas de mosquito Aedes Aegypti; sin embargo, este tipo de larvas son de menor tamaño y diferente especie lo que puede influir en el periodo de micosis a diferencia de Galleria mellonella. Al respecto, ^{Rohrlich et al. (2018}) de acuerdo con un estudio realizado al medir severidad de la enfermedad basada en la mortalidad y micosis observaron diferencia en micosis que dependía del rango de hospedantes de cada especie de Beauveria por lo que sugieren variación en el tiempo de micosis entre diferentes tipos de insectos.