Tratamientos

Medio de dilución de la auxina y pH de la solución auxínica. Se aplicaron tres tratamientos con diferente pH (4, 7 y 11) con 2 000 mg de AIB (ácido 3-indolbutírico, Sigma I-5386) L^-1 disuelto en alcohol (pH ácido y neutro) e hidróxido de sodio (pH alcalino). Con el alcohol, se disolvieron 0.2 g de AIB en 15 ml de alcohol y después se agregaron 85 ml agua destilada.

Debido a que el pH fluctuó entre 3. 43 y 3.46, se ajustó a pH 4 y 7 con NaOH 1 N. Con NaOH, se disolvieron 0.2 g de AIB en 10-15 gotas de NaOH 1 N e inmediatamente se agregaron 100 ml de agua destilada a 60-65 °C, el pH se ajustó a 11 con NaOH 1 N. La longitud de las estacas se ajustó a 15-20 cm y en su base se hicieron cuatro heridas verticales de aproximadamente 2 cm de largo y 3 mm de profundidad con una navaja. El experimento se replicó cuatro veces independientes entre sí en las fechas: 21 de mayo a 11 de junio (E1), 7 de junio a 29 de junio (E2), 30 de junio a 22 de julio (E3) y 29 de julio a 19 de agosto (E4).

A la par del E3, también se realizaron dos experimentos independientes. En estas evaluaciones complementarias el número de yemas por estaca varió de 3 a 5. Niveles de pH sin aplicación de auxina. Se modificó el pH de las soluciones con alcohol al 15% (pH 4 y 7). Para pH 4, después de mezclado los 15 ml de alcohol con los 85 ml de agua, se aplicaron gotas de HCl preparado a 1 N.

Con respecto al pH 7 y pH 11, se aplicaron también gotas de NaOH 1 N. Concentración de alcohol. Se utilizó el procedimiento descrito para diluir la auxina en 15% de alcohol, pero también en 10% y 20%, como el pH fue cercano a 4 se modificó a 4 aplicando gotas de NaOH 1 N.

Luego, se sumergieron los 4-6 cm basales de las estacas durante 5 s en las respectivas soluciones. En los experimentos con niveles de pH sin AIB y concentraciones de alcohol, el número de yemas por estaca varió de 3 a 5. Por último, las estacas se colocaron en cajas de material plástico, de 30 cm de altura x 50 cm de longitud x 35 cm de anchura, con mezcla húmeda de turba y agrolita (1:1, v/v).

La humedad relativa fue de 100% y las temperaturas mínimas, medias y máximas en E1 y E2 fueron 11.3, 21.2 y 26.4 °C y 12.5, 18.7 y 22.9 °C. Debido a disminución en la temperatura ambiental durante los experimentos E3 y E4, poco recomendada para enraizamiento, se utilizó un calentador de aceite con termostato que encendía de 7 pm a 9 am y las temperaturas fueron 17.4, 23.3 y 36.4 °C.

Cambios anatómicos

Se seleccionaron tres estacas al azar, a los 0, 3 y 6 días después del tratamiento con pH 4 (tiempo en el que ocurre la inducción), se eligió este pH debido a que no se observaron diferencias en el tiempo de enraizado entre tratamientos. Se cortó la base de la estaca (2 cm) y se colocó en solución fijadora formaldehido: ácido acético: etanol 96%: agua (10:5:50:35 v:v) durante 24 h en campana de vacío. La deshidratación duró 8 h, en soluciones de etanol de 50, 60, 70, 80, 90 a 100% (dos veces); etanol: xileno (3:1) tres veces y xileno 100% (dos veces).

Las muestras se embebieron en Paraplast^®, se hicieron cortes transversales de 10 µm de espesor con micrótomo rotatorio 820 (American Optical USA^®) se colocaron en portaobjetos eliminando el exceso de parafina y tiñeron con safranina-verde rápido (0.05% safranina, 2% NaCl en etanol 50% y 0.12% verde rápido en etanol 95%). Se identificaron grupos de células meristemáticas, su tejido de origen y primordios de raíz con forma definida y ápice meristemático.

Variables de enraizamiento

Se caracterizó porcentaje de enraizamiento, producto del número de estacas enraizadas entre el número de estacas puestas por 100, número de raíces por estaca, longitud de la raíz más grande, porcentaje de yemas brotadas por estaca (sin incluir la yema de la base).

Diseño experimental y análisis estadístico

El diseño experimental empleado para E1, E2, E3, E4, pH sin AIB y concentraciones de etanol fue completamente al azar con tres tratamientos y con 10, 19, 19, 10, 9 y 7 repeticiones por tratamiento respectivamente. La unidad experimental en todos los experimentos fue una estaca y la fuente de variación, en E1-E4, dos niveles de pH (4 y 7), dos formas de disolver el AIB (NaOH y alcohol), en enraizamiento sin AIB, tres niveles de pH (4, 7 y 11), y en concentraciones de alcohol, tres concentraciones de alcohol (10, 15 y 20%). Los resultados de los tratamientos se analizaron independientemente de los otros experimentos mediante Andeva, prueba de medias de Tukey (p< 0.05) y para las variables con varianzas no homogéneas se realizó prueba Kruskal-Wallis con el paquete estadístico SAS (Statistical Analisys System 9.4).

Cambios anatómicos durante el enraizamiento de estacas de F. carica

Las estacas mostraron anatomía similar a la de una dicotiledonea con crecimiento secundario. De la periferia hacia el centro del tallo se identificaron: epidermis (Ep), parénquima cortical (PC), fibras de floema (FF), floema (Fl), cambium vascular (CV) y xilema (Xi). En los días 0 y 3 no se observaron divisiones celulares. Las primeras células meristemáticas y primordios de raíz (con meristemo apical bien definido) se presentaron hasta el sexto día en las células de floema adyacentes al cambium (recuadros c y d de la Figura 1).

Figura 1 Corte transversal de estacas de higo (Ficus carica) tratadas con 2 000 mg L ^-1 de AIB al 15% de alcohol y con pH 4. a) día 0 (al momento del corte de la estaca); b) día 3; c y d) día 6 en donde se aprecia: epidermis (Ep) parénquima cortical (PC) fibras de floema (FF), floema (Fl), cambium vascular (CV) y xilema (Xi). Recuadros dentro de las imágenes, muestran acercamiento de las células meristemáticas y primordio de raíz. Corte realizado a 0.5-1.5 cm arriba del sitio de corte basal. Barras de escala= 300 µm. 

También en el sexto día las imágenes mostraron grupos de células meristemáticas sin forma, en división recuadro (Figura 1c) y primordios con forma típica de raíz recuadro (Figura 1d), con núcleos visibles. Esto difiere a los reportados en Carnation y Rosa ya que en estas desde el segundo y tercer día se presentaron pequeños grupos de células meristemáticas o divisiones cerca del cambium vascular o en el (^{Costa et al., 2003}; ^{Agulló-Antón et al., 2011}). Al contrario, los resultados coinciden con lo que se observó en Petunia donde a partir del día 6 se visualizaron los primeros primordios de raíz (^{Ahkami et al., 2009}).

Lo anterior, muestra que el tiempo de inducción, iniciación y diferenciación de raíces depende de la especie, por lo que es importante que se determinarlas en cada una para definir el tiempo en el cual se deben ‘cosechar’ de las estacas, para evitar raíces demasiado largas y dificultades en el trasplante. En este estudio, las estacas ‘se cosecharon’ a los 21 días, tenían 69 raíces, longitud promedio de raíz más larga de 5.24 cm, y porcentaje de sobrevivencia y de enraizamiento de 100% considerándose aptas para trasplantadas, mientras que ^{Sivaji et al. (2014}); ^{Aghera y Makwana (2018}); ^{Kaur et al. (2018}) trasplantaron a los 90 días y ^{Becker et al. (2010}) a los 60 días con mayores longitudes de raíz, pero menor porcentaje de enraizamiento y número de raíces. Lo que demuestra que el protocolo utilizado en esta investigación es más eficiente.

pH de la solución auxínica y medio de dilución

Con excepción del tratamiento pH 4 en E2, donde se obtuvo 73% de enraizamiento, en el resto de los experimentos y tratamientos el resultado fue de 100% (Cuadro 1).

En cuanto al número de raíces (Cuadro 2) en E1 y E3 no hubo diferencia estadística significativa entre los tres pH, En contraste, en E2 el pH neutro y alcalino, superaron estadísticamente a pH ácido por otro lado, en E4 el mejor tratamiento fue el pH alcalino seguido del ácido.

Las diferencias de la longitud promedio de la raíz más larga por estaca no fueron significativas entre los tres pH evaluados en E1, E3 y E4, al contrario, en E2 el mejor tratamiento fue el que incluyó el AIB diluido con etanol y con pH ajustado a 7 con NaOH (Cuadro 3).

La generación de brotes a partir de las yemas es importante debido a que generarán la estructura en donde se alojarán las hojas para que la planta provea de energía química y metabolitos secundarios necesarios para la planta (^{Hartmann et al., 2014}). Todas las estacas evaluadas emitieron brotes, similar a lo documentado por ^{Barcelos et al. (2016}) en la especie. Las diferencias del porcentaje de yemas brotadas por estaca, por tratamiento, no fueron significativas (según la prueba Kruskal-Wallis) entre E1, E2 y E3; únicamente E4 mostró diferencias estadísticas significativas entre los tratamientos (Cuadro 4), donde el mejor tratamiento fue AIB a pH 7, después pH 11 y por último pH 4.

Investigaciones en la especie no han analizado el pH en la FRA (^{Hiral et al., 2017}; ^{Aghera y Makwana, 2018}; ^{Kaur et al., 2018}) por lo que dificulta comparar los resultados obtenidos, por ello compararemos con otras especies donde hayan evaluado el efecto del pH. Los resultados de porcentaje de enraizamiento en E1, E3 y E4 (Cuadro 1), en E2 y E3 con número de raíces (Cuadro 2) y longitud de la raíz más grande difieren con los reportados por ^{Kumar et al. (2011}), en Gmelia arborea ya que en esta especie el pH ácido (5.5) con AIB incrementó el porcentaje de enraizamiento en comparación con pH neutro o ligeramente alcalino (8.5).

Por otro lado, son similares en número de raíces y longitud de la raíz más grande ya que tampoco encontraron diferencia. Los resultados obtenidos con F. carica, G. arborea, muestran que la respuesta al pH de la solución depende de la especie y que son factores que deben ser considerados al momento de hacer investigaciones con enraizamiento de estacas para tratar de entender mejor el proceso, también permite sugerir que además del pH, la época de estacado es importante.

Probablemente el sustrato intervenga en la respuesta obtenida, ya que, si bien modificamos el pH del medio que transporta la auxina, esta conserva su pH. Lo anterior, ha sido comprobado en Camellia sinencis por ^{Abdulkadir y Muharrem (2018}) quienes encontraron que pH ligeramente ácido en el sustrato promueve porcentaje mayor de enraizamiento.

Tal vez para inhibir el efecto del sustrato se tendría que hacer uso de soluciones amortiguadoras de pH en la solución auxínica, o aumentar el tiempo de exposición de esta, similar a lo descrito por ^{Khosh-Khui y Tafazoli (1979}); Jin-Hao et al. (1993). Con relación al medio en el que se diluyó la auxina, los resultados en E1, E3 y E4, son similares a lo encontrado en Olea europea y Varronia curassavica, pues no se notaron diferencias en el porcentaje de enraizamiento y longitud de las raíces al diluir AIB con NaOH o etanol (^{Oliveira et al., 2009}; ^{Pereira et al., 2021}).

Actualmente no están identificados las causas del porcentaje menor de enraizamiento de pH 4 en E2. El enraizamiento mayor en E2 y E4 con pH 11 no concuerda con lo descrito por ^{Pereira et al. (2021}) en Varronia curassavica, ya que el AIB diluido con etanol presentó mayor promedio en número de raíces en comparación con el AIB diluido con NaOH. Tampoco coincide con los descrito por Jin-Hao et al. (1993), en Helianthus annus, quienes observaron que el pH ácido incrementó el número de raíces adventicias y siguieren que esto se debe a que promueven el movimiento de las auxinas a la zona de formación.

Nuestros resultados, tal vez tengan relación con lo descrito por ^{AL S’ady et al. (2018)}, quienes encontraron que pHs alcalinos alteran la estabilidad y actividad de la enzima peroxidasa que oxida al AIA. ^{Becker et al. (2010}), demostraron que estacas de F. carica pueden tener 100% de enraizamiento al aplicar 1 000 mg de AIB L^-1 y lesión en su base, pero con 2 000 mg de AIB L^-1 el porcentaje disminuye a 94%. En otros estudios el enraizamiento fue menor a 100% con 1 000, 2 000, 2 500, 3 000 y 3 500 mg de AIB L^-1 (^{Lajús et al., 2007}; ^{Aghera y Makwana, 2018}).

En los resultados puede influir el sustrato, humedad, y contenido de metabolitos en las estacas. Empero, ^{Pipattanawong et al. (2008}) informaron que ambientes casi herméticos incrementan los porcentajes de enraizamiento. Este factor podría explicar la diferencia entre los resultados del presente estudio con la mayoría de los documentados en la literatura en esta especie, siendo entonces una opción para considerar para futuras investigaciones en enraizamiento de estacas.

El número de raíces contabilizadas en E1, E3 y E4 fue mayor que lo reportado para las variedades ‘Poona’ y ‘Brown Turkey’ en concentraciones de 2000 mg de AIB L^-1 (^{Becker et al., 2010}; ^{Sivaji et al., 2014}; ^{Kaur et al., 2018}) y también para concentraciones de 800, 3 000 y 4 000 indicadas como mejores para enraizar F. carica (^{Araújo et al., 2006}; ^{Hiral et al., 2017}; ^{Kaur et al., 2018}).

Los resultados en E1 (Cuadro 3), son similares a los indicados por ^{Hiral et al. (2017}), en dos tratamientos, aun cuando ellos realizaron la evaluación nueve días después, ya que documentaron que la longitud promedio de la raíz más larga fue de 5.5 cm con 4 000 mg de AIB L^-1. Los resultados en E1, E2, E3 y E4 son superiores a los reportados por ^{Becker et al. (2010}), quienes evaluaron a los 60 días y reportaron longitud promedio de 1 cm con 2 000 mg de AIB L^-1. La diferencia en el tiempo de evaluación de las investigaciones hace necesario definirlo para que otros trabajos puedan comparar sus resultados obtenidos.

Las diferencias entre los resultados de este estudio y los documentados podrían deberse a condiciones fisiológicas de las estacas y a que en este estudio estas provenían de plantas madre con manejo y cultivadas en espacio protegido, características señaladas por ^{Saya et al. (2008}) como adecuadas para incrementar porcentaje enraizamiento y número de raíces. Sugiriendo que la época de enraizamiento y manejo de plantas madre es importante para el éxito de la propagación de F. carica.

Con las características y condiciones de enraizamiento de este estudio, el análisis anatómico indicó que la iniciación de las raíces sucedió en los primeros seis días, lo que permite sugerir que: 1) futuras investigaciones que evalúen el enraizamiento en F. carica deben reducir el tiempo de evaluación; y 2) el trasplante de las estacas puede realizarse en menos tiempo al documentado en la literatura (que nos puede hacer cometer errores), con el fin de proporcionar espacio y manejo adecuado para un mejor y rápido desarrollo.

Con respecto a la brotación de yemas (Cuadro 4) los resultados difirieron con lo observado por ^{Abdulkadir y Muharrem (2018}), en C. sinensis donde el AIB en conjunto con pH ácido en sustrato propició porcentajes mayores de brotación en comparación con las estacas tratadas con pH ligeramente ácido y neutro.

Los resultados de E4 son similares a lo reportado por ^{Pereira et al. (2021}), en V. curassavica y M. alternifolia donde estacas tratadas con auxina diluida con NaOH presentaron porcentajes mayores de brotación con respecto al etanol. La brotación se presentó una semana después de establecidos los experimentos, y aunque no depende de los tratamientos, es conveniente que las estacas broten después de iniciada la diferenciación de raíces, que de acuerdo con las observaciones en los cortes anatómicos, ocurre antes del sexto día.

Investigaciones como las de ^{Martínez-Alcántara et al. (2015}), mencionan que el crecimiento de un órgano requiere energía metabólica y la vez puede limitar el crecimiento de otro, esto podría explicar los resultados obtenidos en E4, donde el tratamiento con pH 7 con más brotación, fue el que presentó menor número de raíces. Estos resultados coinciden con los reportados por ^{Souza et al. (1986}), en estacas leñosas en F. carica. Con relación a lo anterior de manera general, en E3, que obtuvo 100% de brotación, presentó menor número promedio de raíces (58.5) y menor longitud promedio de raíz más larga (3.63 cm) que E1 (74.7 y 6.07 cm) y E4 (112.04 y 8.68 cm) (Cuadro 2 y 3).

Enraizamiento con diferentes niveles de pH sin auxina

El pH afectó el porcentaje de enraizamiento; con pH 7 se obtuvo porcentaje de enraizamiento mayor; al contrario, las diferencias en número de raíces, longitud de la raíz más larga y yemas brotadas por estaca no fueron significativas (Cuadro 5). Aunque hubo diferencias en el porcentaje de enraizamiento, se observa que estos valores son inferiores a los obtenidos a cuando se agrega la auxina (100%) (Cuadro 1), así también los valores de número y longitud de raíces son inferiores, 44 raíces y 3.7 cm como valores máximos en E2 (Cuadro 2 y 3), reafirmando la importancia de este regulador en la propagación por medio de estacas.

Debido a que actualmente no existe información en F. carica sobre enraizamiento de estacas en diferente pH con o sin AIB, compararemos con otras especies en donde hayan trabajado el pH sin auxina. Lo anterior, difiere con los reportado por ^{Kumar et al. (2011}) en Gmelina arborea, en porcentaje de enraizamiento ya que el pH 5.5 generó enraizamiento mayor en comparación con 7 y 8.5, pero es similar en el número de raíces ya que tampoco encontraron diferencias. También difiere a lo observado en Camellia sinensis donde obtuvieron mejores resultados en pH de 5.5 (^{Lima et al., 2013}).

Tal vez la diferencia entre nuestros resultados y los observados por ^{Kumar et al. (2011}) para G. arborea y por ^{Lima et al. (2013}) en C. sinencis se debe a que una de las concentraciones de pH evaluadas fue 5.5, misma que favorece el transporte por medio del influjo de la forma protonada de AIA (^{Taiz y Zeiger, 2010}).

Concentraciones de alcohol

Usualmente, la solución acuosa de etanol se utiliza para diluir las auxinas que se aplican para promover enraizamiento es de etanol: agua 1:1 (^{Pereira et al., 2021}), tal vez tomado de lo recomendado por ^{Hartmann et al. (2014}). La única variable en la que se observaron diferencias estadísticas es longitud de raíces (Cuadro 6) donde 10% superó a las otras concentraciones, incluso, este valor superó los obtenidos 3.95 cm como valor máximo (Cuadro 3) en los tres pH en E3, a 15% de etanol (experimento que se realizó a la par) lo que significa que la inducción, iniciación y diferenciación de raíces se dio primero en esta concentración.

Tomando en cuenta que las tres concentraciones utilizadas en este experimento son inferiores a las empleadas en la mayoría de los trabajos de enraizamiento, podemos señalar que este factor podría estar afectando la respuesta de ‘las otras investigaciones’ por lo que es necesario establecer concentraciones apropiadas de etanol para diluir el AIB.

Los resultados difieren a los reportados en Phaseolus vulgaris en número y longitud de raíces; en ellas, 0.2% incrementó el número de raíces en comparación con 2% que incrementó la longitud (^{Middleton et al., 1978}). En Vigna radiata el número de raíces disminuyó por concentraciones altas de etanol (^{Bhattacharya et al., 1985}). Lo anterior, tal vez a que el etanol puede ser tóxico para las plantas e inhibir su desarrollo y crecimiento (^{Kern et al., 2009}). Tal vez la diferencia entre lo reportado y el presente estudio son las concentraciones de etanol, que varían entre 0.5 y 2% y contrastan con nuestra concentración menor, 10%.