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Introducción
La producción ganadera tiene como propósito producir alimentos de calidad, asequibles para la sociedad y que se obtengan en un ambiente sustentable; lo cual, es difícil ante una creciente necesidad de carne y leche. Por lo que investigadores del INIFAP mantienen una constante atención a las demandas de los productores, mediante la generación de conocimientos científicos e innovación tecnológica en los problemas de salud animal.
En México el inventario es de poco más de 34 millones de bovinos1 mismos que están expuestos a agentes patógenos de naturaleza viral, bacteriana o parasitaria, los que con frecuencia se comportan como coinfecciones o complejos. Las enfermedades presentan una distribución y frecuencia que varía de acuerdo a las interacciones entre el agente patógeno, el hospedador bovino y las condiciones ecológicas. Su presentación ocasiona diferentes tasas de morbilidad, mortalidad y baja productividad, con un efecto detrimental en el aprovechamiento del potencial de producción. De manera inherente, se generan restricciones del comercio nacional e internacional; se ha estimado que un brote de enfermedad puede afectar el 20 % de las actividades comerciales del hato2. En las enfermedades se involucra una amplia variabilidad de la relación costo-beneficio de los programas de prevención y control; lo cual genera subestimaciones de los impactos en la producción y por ende hay inconsistencia en la información sobre las pérdidas. Asimismo, es importante remarcar que algunas enfermedades de los bovinos afectan a la población humana3. Cada enfermedad tiene una carga económica diferente que se determina a través de los costos directos, indirectos del consumo o de la pérdida de recursos; en términos generales incluye recursos humanos, estructurales y económicos. El objetivo de esta revisión es presentar de manera concisa, las aportaciones que investigadores del INIFAP han realizado, directamente o en colaboración con investigadores de otras instituciones, sobre diferentes aspectos de las principales enfermedades que afectan a la ganadería bovina en México. Al mismo tiempo se trata de identificar líneas de investigación que permitan mitigar el impacto de las enfermedades en la producción.
Rabia paralítica bovina
La rabia paralítica bovina (RPB) o derriengue es una encefalitis causada por un virus ARN de polaridad negativa de la familia Rhabdoviridae y del género Lyssavirus. En México el principal transmisor es el quiróptero Desmodus rotundus que es un murciélago hematófago, cuya distribución en América Latina es desde las costas de México hasta el Norte de Argentina4. En México es una enfermedad frecuente, en el año 2019 se diagnosticaron 284 casos positivos5.
Aportes del INIFAP
Diagnóstico. En países endémicos como México, el diagnóstico es crítico para la prevención y control de la rabia. La prueba de referencia es la inmunofluorescencia directa (IFD); sin embargo, en climas tropicales frecuentemente ocurre la descomposición del tejido cerebral cuando se manipula, lo cual imposibilita la ejecución del diagnóstico o deriva en resultados falsos negativos. Por lo que, a partir de secuencias de 40 aislamientos de virus provenientes de diferentes reservorios y zonas geográficas del país, se desarrolló una prueba de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR). Para lo cual, del gene N que es el más conservado del virus, se diseñaron iniciadores. Con la aplicación de la prueba se obtuvieron tasas de sensibilidad, especificidad y valor predictivo de 86, 91 y 96 %, respectivamente6. También se logró detectar al virus en muestras conservadas a 27 °C durante 23 días. Así, la RT-PCR actualmente se acepta como una excelente alternativa para el diagnóstico del virus7.
Epidemiología Molecular. Investigadores del INIFAP han sido pioneros de la caracterización antigénica y molecular del virus de la rabia. Realizaron la detección de variantes antigénicas usando un panel de anticuerpos monoclonales obtenido del Instituto Pasteur en Paris, Francia8. Posteriormente, utilizando anticuerpos monoclonales del Centro para el Control de Enfermedades de los EE.UU. lograron la caracterización molecular de muestras provenientes de humanos y animales domésticos y silvestres recolectados de 1990 a 1995. Con lo que se reconoció un nuevo ciclo denominado “hipervariables” que circula en zorrillos en Baja California Sur. Al mismo tiempo, se identificaron variantes antigénicas y moleculares que circulaban en vampiros y en otra fauna silvestre9,10. En un estudio colaborativo con investigadores del Instituto Pasteur, se determinaron los principales ciclos epidemiológicos de rabia en México mediante la técnica de Fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP)8. En otra investigación, usando una porción del gen P se descubrió que una variante del virus que circula en gato, también lo hace en el murciélago Tadarida brasiliensis11,12.
Vacunación. Con el uso de radiación gamma con una fuente de Cobalto-60 se logró mantener la potencia, inocuidad, estabilidad y caducidad en vacunas tradicionales13-16. Para la aplicación de una vacuna génica en perros, se pudo sustituir con éxito a la pistola de genes por una jeringa de insulina17.
Se generaron vacunas antirrábicas comestibles en las que se usó el gen N expresado en jitomate, aunque se obtuvo un bajo nivel de inmunogenicidad18. En contraste con la proteína G expresada en callos embriogénicos de zanahoria, se alcanzó una protección del 60 % en ratones19. Posteriormente se produjo una vacuna antirrábica en maíz con la que la protección se incrementó al 80 % en borregos ante un desafío con virus letal4.
Recientemente en investigaciones colaborativas, se han descubierto diferencias de los receptores tipo Toll (TLR) entre los quirópteros y mamíferos terrestres20. En la serie Nature se ha publicado el hologenoma del vampiro, y se ha inferido que el murciélago hematófago se ha adaptado a la sangre a través de una estrecha relación entre su genoma y el microbioma intestinal21.
Perspectivas. En condiciones tropicales el mantenimiento de la cadena fría es un serio inconveniente; por lo que es una exigencia generar una vacuna termoestable que permita su uso a nivel masivo. También, es forzoso aplicar pruebas masivas para detectar anticuerpos neutralizantes que se asocian con protección, para evaluar la efectividad de las vacunas. Además, es esencial producir un conjugado de buena calidad que permita altas tasas de sensibilidad, especificidad y menor costo de la prueba.
Diarrea viral bovina
La diarrea viral bovina (DVB) es una enfermedad de distribución mundial que ocasiona importantes pérdidas a la ganadería. El agente causal es un Pestivirus de la familia Flaviviridae, tiene un efecto inmunodepresor que facilita infecciones secundarias o concomitantes. Afecta el sistema digestivo, respiratorio y reproductivo, y es un componente del complejo respiratorio bovino22. El virus posee alta variabilidad genética, se clasifica en dos genotipos y varios subgenotipos.
Aportes del INIFAP
Epidemiología. En México la primera descripción de DVB se hizo en 1975, específicamente en bovinos con problemas reproductivos en los que se detectaron anticuerpos circulantes23. Los estudios realizados por el INIFAP se han limitado a entender la epidemiología y a la medición de factores de riesgo. No obstante, en México se ha demostrado la presencia de los subgenotipos 1a, 1b, 1c y 2a24.
En un reporte se describe un muestreo en ganado lechero en diferentes estados del país, en el que se determinó una seroprevalencia de 78.8 %. En el mismo estudio los factores de riesgo significativos fueron tamaño de hato, corrales, producción intensiva y periodos inter-parto largos25.
Perspectivas. La alta prevalencia de la DVB sugiere la oportunidad para crear líneas de investigación de tipo básico y aplicado para su prevención y control. El reto ideal sería la eliminación de la DVB, para lo cual, se debería desarrollar una vacuna con aislados mexicanos que representen a los subgenotipos presentes. Sería deseable que se desarrollen vacunas de nueva generación, así como técnicas diagnósticas con alta sensibilidad y especificidad que permitan reconocer infecciones concomitantes.
Anaplasmosis bovina
La anaplasmosis bovina es una enfermedad causada por la bacteria Gram-negativa Anaplasma marginale, afecta mayormente a ganado en pastoreo de las zonas tropicales en donde se concentran las mayores poblaciones de bovinos en explotaciones extensivas en México. La enfermedad puede ocasionar hasta 25 % de las pérdidas totales por muerte de animales que se movilizan al trópico para programas de mejoramiento genético26. La forma clínica se manifiesta por anemia, ictericia, inapetencia, pérdida de peso y producción láctea, aborto en el tercer tercio y muerte. En el INIFAP, la Unidad de Anaplasmosis fue fundada por el Dr. Ramón Aboytes Torres en 1994, ahí se realizan investigaciones sobre diagnóstico, epidemiología, respuesta inmune del bovino, cultivo in vitro de la bacteria y la generación de vacunas.
Aportes del INIFAP
Diagnóstico y epidemiología. Se han efectuado estudios serológicos y moleculares de las que se estimaron tasas de prevalencia del 50 % en el norte de Veracruz27. El diagnóstico serológico se mejoró con el desarrollo de un ensayo inmuno enzimático indirecto en placa (ELISAi), el cual ha sido adoptado por el SENASICA28. En estudios de epidemiología molecular usando como marcadores a los genes msp1α y msp4, se ha observado que las cepas mexicanas poseen una distribución que permite suponer su migración. También se encontró que varias cepas de A. marginale presentes en México, son más parecidas a las caracterizadas en Brasil que a cepas de los EE.UU.29. En el laboratorio se tienen resguardadas más de 20 cepas, las que han sido recolectadas en diferentes estados de la República, mismas que se han usado para la comprobación de antígenos conservados30,31.
Inmunidad y vacunas contra la anaplasmosis. A. marginale infecta eritrocitos maduros lo que hace que se comporte como una bacteria extracelular, ya que no infecta células nucleadas por lo que no induce una respuesta típica tipo Tc con células CD8+, y se presenta una respuesta Th1. Ese modelo de respuesta inmune tipo Th1 había sido previamente postulado32; en el INIFAP fue ensayado en terneras en las que normalmente se establece la infección pero resisten la presentación clínica de la enfermedad. El modelo también fue corroborado en bovinos adultos, en los que se observó una respuesta de tipo Th1, asociada a la presencia de IgG2, Interferón-γ y linfocitos T cooperadores (Th) CD4+, lo cual, es esencial para la resistencia a la presentación clínica de la anaplasmosis33.
Se desarrolló un inmunógeno inactivado con el que se logró inducir inmunidad protectora a un desafío homólogo28,34,35. Buscando alternativas de amplio espectro, se identificó una cepa de A. marginale del estado de Yucatán, a la que se le denominó “Tizimín” y se caracterizó como cepa de baja virulencia natural36. Esa cepa se utilizó como vacuna y se demostró que protegió ante un desafío heterólogo en bovinos vacunados con dosis de 1x104-1x1010(37. Con el inmunógeno inactivado se han vacunado animales tanto locales como de importación en Veracruz y Tamaulipas; de esa manera se ha contribuido para reducir la morbilidad y mortalidad por anaplasmosis. Por otra parte, el uso del inmunógeno vivo se ha limitado debido a la dificultad de su mantenimiento en nitrógeno líquido.
En México se sabe que el vector biológico más importante de A. marginale son las garrapatas Rhipicephalus microplus38,39. En los laboratorios del propio INIFAP se demostró la transmisión trans-ovárica, lo que se logró con larvas de R. microplus que fueron alimentadas sobre bovinos infectados, las que posteriormente transmitieron la infección a bovinos susceptibles40.
Estudios del genoma. La publicación del primer genoma completo de A. marginale fue en 200541. Lo que revolucionó el estudio de los candidatos potenciales para vacunas de esta bacteria; actualmente existen 23 secuencias completas, incluyendo a siete cepas mexicanas42,43. Para el desarrollo de inmunógenos se han analizado proteínas de membrana con potencial vacunal44, y se han realizado ensayos con proteínas recombinantes o péptidos sintéticos31. Sin embargo, todavía no existe un inmunógeno capaz de proteger de manera total a bovinos desafiados experimental o naturalmente contra esta bacteria. Actualmente, en la Unidad de Anaplasmosis los estudios están enfocados en dichas secuencias, para que en el diseño de vacunas se incluyan proteínas asociadas a vías de transporte, señalización o metabólicas30.
Perspectivas. Con la publicación de los 23 genomas de A. marginale, las secuencias se deben analizar mediante procedimientos de bioinformática. De modo que se establezcan criterios para la identificación de candidatos vacunales, ligados a funciones vitales o de virulencia. Actualmente, existen ejemplos de vacunas multiepitópicas y estrategias de vacunología reversa; por lo que el grupo de investigación está haciendo uso de esas herramientas para diseñar nuevas vacunas contra A. marginale30. Es muy probable que se identifiquen proteínas diferentes a las ya estudiadas para incluirlas en una vacuna. Lo cual, puede ocurrir en un periodo no mayor de cinco años, para entonces disponer de un inmunógeno que se use de manera amplia y segura.
Brucelosis
La brucelosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Brucella que afecta a diferentes especies domésticas como los bovinos, ovinos y caprinos. La especie más importante que afecta al ganado bovino es Brucella abortus45. En México la brucelosis es la principal zoonosis de origen bacteriano. En los bovinos los signos clínicos más notorios son de tipo reproductivo, incluyen aborto y reducción en la producción láctea, por lo que tiene alto impacto en la ganadería bovina. Para el control de la enfermedad en el país existe la Campaña Nacional contra la Brucelosis en los animales, en la que se aplica la norma NOM-041-ZOO-1995 basada en el diagnóstico y la vacunación.
A nivel nacional para la inmunización del ganado bovino se usan las cepas S19 y RB51 ambas de B. abortus. La S19 induce la presencia de anticuerpos en el suero y en la leche, pero interfiere con las pruebas diagnósticas oficiales; por lo que la alternativa es la RB5146-49. Para el diagnóstico los métodos serológicos más utilizados son la prueba de tarjeta al 8% y la de rivanol50; estas pruebas detectan anticuerpos contra los componentes de la membrana externa de Brucella, dirigidos contra la cadena O del lipopolisacárido (LPS) que es la estructura más antigénica de las cepas lisas51.
A pesar de los esfuerzos realizados en la campaña, la brucelosis en México continúa con un efecto desfavorable en la salud animal y humana. La prevalencia en las unidades de producción es superior al 20 %; en humanos cada año en promedio se reportan 3,000 casos nuevos (Secretaria de Salud, CENAPRECE 2013-2018).
Aportes del INIFAP
En el INIFAP los investigadores han hecho contribuciones relevantes a la campaña en múltiples aspectos. Las pruebas diagnósticas que se aplican de manera directa o indirecta han sido producto de sus investigaciones, y son avaladas por la Norma Oficial Mexicana. Las pruebas que se utilizan son la de rosa de bengala, rivanol, fijación de complemento y anillo en leche. No obstante, con el uso de esas pruebas se dificulta diferenciar entre animales vacunados e infectados, especialmente en los que son revacunados; lo cual, se ha solventado con la prueba de inmunodifusión radial (IDR)52. Esa prueba a su vez facilitó el desarrollo de otras con mayor sensibilidad y especificidad, como la ELISA y la fluorescencia polarizada, en las que se utiliza como antígeno el polisacárido denominado hapteno nativo (HN)49,53.
En relación a la patogenia de la brucelosis, se estudió la sobrevivencia y tráfico intracelular de la cepa vacunal RB51 vs cepas de campo en células fagocíticas. De esa manera se observó menor tiempo de sobrevivencia de la cepa vacunal y se infirió una menor probabilidad de causar enfermedad54.
Para demostrar la efectividad de las vacunas que se usan en la campaña se ha evaluado el efecto de la revacunación y el manejo de hatos infectados. También se han realizado ensayos con vacunas de nueva generación como las mutantes rfbK47,55,56. Con la vacuna RB51 se expuso el riesgo potencial para la salud pública, debido a que se demostró su eliminación en leche y en secreciones vaginales de las vacas57. Si bien la cepa vacunal RB51 desplazó a la Cepa19, aún se desconoce su potencial protector real; aunque se ha demostrado su eficacia en la eliminación de animales reactores a las pruebas convencionales. La vacunación per se no ha sido suficiente para reducir la alta incidencia en hatos infectados46,47. La vacunación con la cepa RB51 se ha descrito que no interfiere con las pruebas de diagnóstico oficiales por carecer de la cadena “O”. Si bien se han observado algunas respuestas “atípicas” positivas, estas se han atribuido a contacto con cepas de campo ocurridas durante los estudios58,59. Al usar como vacunas las mutantes rugosas RB51 y la rfbK se ha descrito la inducción de una protección adecuada en un hato en condiciones de prevalencia media56.
Perspectivas. A pesar de la existencia de la campaña nacional para el control de la brucelosis se mantiene un nivel de prevalencia e incidencia que conlleva repercusiones económicas y sociales. Por lo que la prevención y control de la brucelosis podría plantearse bajo el concepto de “Una Salud”; así se involucraría a los productores y a las autoridades encargadas de la salud animal y salud humana. Técnicamente se deben continuar proyectos que permitan mejorar la eficacia y seguridad de las vacunas existentes y, desarrollar nuevos tipos de vacunas.
Tuberculosis
La tuberculosis bovina es una enfermedad crónica causada por la micobacteria Mycobacterium bovis que pertenece al complejo de Mycobacterium tuberculosis. M. bovis afecta a una gran variedad de especies incluyendo al humano. En México la tuberculosis es la segunda zoonosis de origen bacteriano más importante después de la brucelosis60. El control depende de la aplicación de la Norma Oficial Mexicana NOM-031-ZOO-1995 de la Campaña Nacional Contra la Tuberculosis Bovina (Mycobacterium bovis)61, cuya estrategia se basa en el diagnóstico y la eliminación de reactores. Para el diagnóstico se realiza la prueba de la tuberculina, utilizando como antígeno el derivado proteico purificado bovino (PPD) elaborado con M. bovis de la cepa AN5. El PPD bovino se aplica en el pliegue caudal o bien a la par con el PPD aviar elaborado con M. avium cepa D4, en una prueba cervical comparativa62. Los animales positivos a esta prueba son enviados al rastro, el diagnóstico se confirma por análisis bacteriológico específico y por histopatología de lesiones granulomatosas, lo que está establecido en la NOM-031-ZOO-199561. En nuestro país la prevalencia usualmente superior al 2.5 % en las unidades de producción de leche, en ganado productor de carne es inferior, pero en ambos sistemas afecta la comercialización del ganado. En humanos cada año se reportan más de 15,000 casos nuevos de tuberculosis (Secretaria de Salud, CENAPRECE 2017).
Aportes del INIFAP
El INIFAP a través de sus investigadores ha contribuido en el desarrollo y aplicación de las diferentes técnicas de diagnóstico que se aplican en la campaña, las cuales son avaladas por la Norma Oficial Mexicana. Destaca el estudio que demostró que animales en las fases terminales de la tuberculosis no se pueden identificar con la prueba de la tuberculina. Por lo que se instrumentaron pruebas complementarias como ELISA, Interferón-γ y spoligotyping con las que se mejoró la confiabilidad del diagnóstico y, se logró identificar a esos animales anérgicos62.
Para el aislamiento de micobacterias se estableció como rutina el uso del tetraborato de sodio para la conservación óptima de muestras hasta por 90 días, esa también es una contribución de investigadores del INIFAP. Otro aporte fue el uso de la PCR y del análisis histopatológico con tinción de Ziehl-Neelsen, con lo que se mejoró la sensibilidad y especificidad sobre el cultivo bacteriológico63. Un logro a destacar fue el desarrollo de la PCR de punto final y de la PCR-multiplex, pruebas con las que es posible diferenciar entre animales vacunados con BCG e infectados con cepas de campo64,65.
En México no existe ninguna vacuna autorizada para prevenir la tuberculosis en animales; no obstante, en el INIFAP se han realizado estudios de la vacuna BCG utilizada en humanos, para evaluar su capacidad protectora en animales. Se han utilizado animales de laboratorio como modelo y se han realizado ensayos preliminares en bovinos. En un estudio con becerras vacunadas con BCG y desafiadas con una cepa patógena de M. bovis, se demostró una marcada reducción de lesiones granulomatosas. Por lo que se ha sugerido su uso para el control de la tuberculosis en zonas de alta prevalencia66.
La información científica que se ha generado, asociado a la existencia de una campaña para el control de la tuberculosis con una Norma Oficial presume la factibilidad de un control eficiente de la tuberculosis bovina. Sin embargo, se debe demostrar sólidamente la conveniencia del uso de la vacuna BCG, que es actualmente la única posible vacuna para prevenir la tuberculosis en el ganado bovino. Al mismo tiempo, se debe establecer una línea de investigación alterna para otra vacuna que no interfiera con la discriminación entre animales vacunados e infectados. Lo que implicaría una reducción de la prevalencia y un control eficiente de la tuberculosis bovina.
Paratuberculosis
La paratuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa crónica que afecta al ganado bovino, ovino y caprino. Es causada por Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map); se caracteriza por producir lesiones de tipo granulomatoso en intestino delgado. Ocasiona el síndrome de mala absorción de los nutrientes, los animales infectados pierden su condición corporal y disminuye la capacidad productiva. El agente etiológico es eliminado en las heces, por lo que los animales se infectan al ingerir calostro, leche, alimento o agua contaminados. La propagación lenta de la enfermedad y su curso crónico ocasionan pérdidas económicas periódicas67.
Aportes del INIFAP
Investigadores del entonces CENID-Microbiología obtuvieron un antígeno protoplásmico de una cepa denominada Map 3065 derivada de un caso clínico de un ovino. Ese antígeno se usó para estandarizar las técnicas de inmunodifusión en agar (IDGA) y el ensayo inmuno-enzimático (ELISA)68.
En México se han determinado indicadores epidemiológicos en unidades de producción (UP) de los estados de Chihuahua, Coahuila, Sinaloa, Durango, San Luis Potosí, Jalisco, Aguascalientes, Guanajuato, Querétaro, Hidalgo, Puebla, Chiapas y Veracruz. Las prevalencias variaron de 1.0 a 32.37 % en los diferentes estados; al considerar a cada UP las prevalencias variaron de 1.0 a 88.87 %. En otro estudio epidemiológico la presencia de la paratuberculosis se asoció a las condiciones sanitarias de cada UP, lo cual, permitió emitir recomendaciones del manejo sanitario del para el control de la enfermedad67,69,70,71.
Otra técnica que se instrumentó fue la fluorescencia polarizada (FPA), con la que se mejoraron las tasas de sensibilidad y especificidad epidemiológicas72. También se implementó una PCR, en la que la extracción del ADN se hace a partir de las heces, leche, quesos, o tejidos con lesiones. Usando esa técnica se confirman casos de animales negativos en serología; los cuales en caso de permanecer en el hato serían la principal fuente de infección. Así es que la PCR resulta útil como prueba confirmatoria de la enfermedad.
Adicionalmente se ha estandarizado una PCR en formato anidado (PCRa), para la que se diseñaron iniciadores que amplifican una región del gen de la secuencia de inserción 900 específica de Map. Con la PCRa los resultados se consiguen en un tiempo más corto y se obtiene alta sensibilidad y especificidad. Se debe contrastar que con el aislamiento bacteriológico regularmente se requieren 16 semanas73.
Perspectivas. Para entender los procesos de la inmunidad humoral y celular del bovino hacia M. avium subespecie paratuberculosis, se requiere generar una línea de investigación, y el reto será desarrollar un inmunógeno efectivo para la prevención de la enfermedad.
Enfermedad respiratoria de los bovinos
Es una enfermedad multifactorial que involucra la exposición a agentes virales, bacterianos, factores del ambiente y fisiológicos que estresen a los bovinos. Se ha descrito que es la enfermedad más común y costosa que afecta al ganado bovino en el mundo. Clínicamente se manifiesta fiebre (>40 °C), secreción nasal y ocular, disnea, inapetencia, depresión, postración y muerte. El impacto económico es cuantioso debido a la morbilidad, mortalidad, costos de los tratamientos y baja en la producción.
En la enfermedad respiratoria de los bovinos (ERB) participan los virus de la rinotraqueitis infecciosa bovina (IBR), el respiratorio sincitial bovino (VRSB), el de diarrea viral bovina (DVB), el de parainfluenza-3(PI3) y el herpes virus bovino tipo 1. Los virus crean las condiciones propicias para la colonización y replicación de las bacterias, facilitando su adhesión en las células infectadas. De esta manera en bovinos con infecciones virales y sometidos a condiciones de estrés, se presentan infecciones respiratorias severas asociadas a bacterias. Las más frecuentes son Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida e Histophilus somni, estas normalmente son parte de la microbiota del tracto respiratorio alto. Poseen diversos factores de virulencia, M. haemolytica produce una leucotoxina que afecta a leucocitos de rumiantes; P. multocida tiene una cápsula antifagocítica y lipopolisacáridos; H. somni puede sobrevivir intracelularmente y es capaz de producir biopelícula74. El complejo es capaz de alterar las funciones de los macrófagos alveolares, se suprime la proliferación de los linfocitos, se induce apoptosis, se modifican la expresión de citocinas y se provoca un proceso inflamatorio75.
Aportes del INIFAP
Se desarrolló un proyecto colaborativo entre el entonces CENID-Microbiología del INIFAP y la UNAM denominado "Complejo Neumónico en Rumiantes", cuyo objetivo fue determinar los géneros bacterianos participantes en la ERB, sus serotipos y resistencia a los quimioterapéuticos. Así se logró el aislamiento de H. somnus (H. somni)76, P. haemolytica (M. haemolytica) y P. multocida. También se hizo la serotipificación y la caracterizaron de su resistencia a productos quimioterapéuticos. Asimismo, se encontró que la mayoría de los serotipos de M. haemolytica pertenecían al tipo A1 y los de P. multocida al tipo A77,78,79; concretamente se detectó resistencia a la penicilina, ampicilina y estreptomicina80,81. Posteriormente, se evidenciaron factores de virulencia como la leucotoxina en M. haemolytica82 y la formación de biopelícula en P. multocida, M. haemolytica y H. somni83. Además se observó que P. multocida produce vesículas en la membrana externa84.
De los aislados se generaron cepas con las que se logró formular una bacterina-toxoide para la prevención de la ERB, el cual fue evaluado en ovinos como modelo85,86,87. El biológico generado es actualmente producido en el INIFAP y se usa en algunos programas sanitarios de ovinos.
Perspectivas. La prioridad será desarrollar biológicos con cepas nacionales de virus IBR, VRSB y PI3, y combinarlas con cepas vivas atenuadas o subunidades de M. haemolytica, P. multocida y H. somni para conferir protección efectiva contra la ERB. Para mejorar el diagnóstico será necesario iniciar estudios de metabolómica, así se podrá monitorear los metabolitos durante el curso de la enfermedad. También sería deseable crear una línea de investigación sobre la resistencia genética de los bovinos a la ERB. Colateralmente, la transcritómica sería una herramienta muy útil para tratar de hacer una selección genética y conformar hatos resistentes a la ERB.
Leptospirosis
La leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial, es causada por bacterias del género Leptospira. Con base en el análisis de ADN éste género incluye a 22 especies 10 patógenas, 5 intermedias y 7 saprófitas88. Por serología se reconocen más de 300 serovariedades89. A nivel mundial hardjo es la serovariedad más comúnmente detectada en bovinos90. Los pequeños mamíferos son los reservorios más importantes de la bacteria, los grandes herbívoros son fuente de infección, el humano puede ser hospedador accidental91.
Los bovinos son portadores renales de la Leptospira spp. por lo que eliminan a la bacteria por la orina y contaminan el medio ambiente92. La leptospirosis ocasiona trastornos reproductivos tales como abortos, mortinatos, becerros prematuros débiles y una reducción de la producción láctea; lo que implica pérdidas económicas considerables93. En México las primeras descripciones de leptospirosis se hicieron en 1928 y 1930 en humanos y en bovinos, respectivamente94.
Aportes del INIFAP
En un trabajo colaborativo entre INIFAP, UAM y UAEM se reportó la situación de la leptospirosis bovina en México. Se determinaron tasas de prevalencia en diferentes zonas ecológicas del país; en la árida y semiárida la prevalencia fue 37.8 %; en el trópico seco 45.9 %; en trópico húmedo 63.8 % y en la zona templada 39.4 %. En todas las regiones se demostró la presencia de las serovariedades hardjo, wolffi y tarassovi. En la región templada se detectaron las serovariedades icterohaemorrhagiae, portland-Vere, bratislava, pyrogenes, canicola y pomona95. Se aislaron las serovariedades grippotyphosa, mini y tarassovi, lo que no se había realizado en México96,97. En otros estudios epidemiológicos fueron identificadas las mismas serovariedades, pero las prevalencias tuvieron una amplia variación de 31 a 91 %98-103.
Para el diagnóstico, en el INIFAP se instrumentó la técnica de la PCR que permitió la detección de bacterias en la orina recolectada de bovinos con antecedentes de problemas reproductivos100.
Para la prevención de la enfermedad se generaron bacterinas, una adicionada con adyuvante usando vitaminas liposolubles, con la que se obtuvieron resultados satisfactorios104. Otra bacterina se elaboró con serovariedades aisladas en el estado de Chiapas, las cuales no estaban contenidas en las bacterinas comerciales; con ese biológico homólogo se observó excelente nivel de protección en bovinos susceptibles. Actualmente en el INIFAP se dispone de una bacterina que ha sido validada en hatos de animales de lechería familiar105.
Perspectivas. Es evidente la endemicidad y alta prevalencia de la leptospirosis en México, por lo que es un verdadero reto masificar el uso de la microaglutinación que es la prueba de referencia. Para determinar las serovariedades de Leptospira presentes en las diferentes regiones, y entonces elaborar bacterinas homólogas que prevengan efectivamente la leptospirosis. Se debe generar una línea de investigación sobre el desarrollo de vacunas de tipo molecular que se puedan usar en cualquier región ecológica. También, sería recomendable instrumentar alguna metodología precisa con alta sensibilidad y especificidad, rápida en su ejecución y de bajo costo. Lo cual puede redundar en un mejor diagnostico que incrementará parámetros reproductivos y productivos del ganado bovino.
Garrapatas
Las garrapatas son ectoparásitos hematófagos capaces inyectar toxinas y de transmitir diferentes patógenos como A. marginale y Babesia spp. con altas tasas de morbilidad y mortalidad en el ganado. De la diversidad de garrapatas identificadas en México la más importante es Rhipicephalus microplus. Actualmente son un problema global por su gran adaptabilidad a diferentes nichos ecológicos, se considera que el 65 % del territorio nacional está infestado con esa garrapata.
Aportes del INIFAP
Epidemiología. En un estudio epidemiológico que comprendió diferentes estados del país, se corroboró que la distribución de R. microplus se asoció esencialmente a la temperatura ambiental, lluvia y vapor de agua106. En otra investigación se observó mayor eficiencia y aptitud reproductiva de garrapatas de una cepa nativa recolectada en campo en Sinaloa, comparada con una cepa de referencia del CENID-SAI107.
Control biológico. Para el control de garrapatas esta estrategia ha sido bien documentada en estudios realizados en el INIFAP. De la evaluación de técnicas para la recolección de larvas de garrapatas R. microplus, la de bandera con doble recorrido fue seleccionada para diferentes estudios. Se evaluó el efecto de la recuperación de larvas R. microplus usando leguminosas tropicales en el estado de Morelos108. En otro estudio se evaluó el efecto anti-larvas usando los pastos Stylosanthes humilis, S. hamata, Cenchurus ciliaris y Andropogon gayanus en parcelas infestadas artificialmente. Del cual se observó efecto favorable en las parcelas de S. humilis en las que se recuperó solo 3 % de larvas vivas109. En otra investigación usando plantas maduras de S. humilis y S. hamata no hubo ningún efecto anti-garrapata110. Por otra parte, al evaluar a las leguminosas Leucaena leucocephala, Macroptilium artropurpureum, S. humilis y S. hamata se notó importante reducción de larvas de R. microplus111. Con base en estos hallazgos, se identificaron algunos compuestos químicos en S. humilis y S. hamata como posibles causantes del efecto repelente112. Asimismo, en otro estudio usando el pasto gordura M. minutiflora también se observó reducción en la recuperación de larvas113.
Otras estrategias han involucrado el uso de hongos o bacterias para el control de las garrapatas; así al utilizar al hongo entomopatógeno Metarhizium anisopliae se demostró su capacidad para infectar a las garrapatas y de inducir hasta 100 % de mortalidad, lo que permitió inferir que puede ser un acaricida potencial para el control biológico de R. microplus114. Por otra parte, en garrapatas adultas ingurgitadas que se infectaron experimentalmente con la bacteria Staphylococcus saprophyticus, se logró inducir mortalidad de las garrapatas115.
Se reportó por primera vez que el hongo Aspergillus flavus es capaz de infectar al 80 % de garrapatas adultas ingurgitadas, a las masas ovígeras y a las larvas que emergen después de la incubación, en condiciones controladas116.
Resistencia. Este es uno de los tópicos más estudiados en el INIFAP; en uno de los primeros estudios se demostró que en poblaciones de garrapatas R. microplus resistentes a organofosforados, hay una elevada expresión de enzimas carboxilesterasas117. Posteriormente, se caracterizaron algunos genes que codifican para esterasas, cuya utilidad era disponer de marcadores moleculares para discriminar cepas de garrapatas susceptibles y resistentes a ixodicidas118. Se analizaron genes que codifican para carboxilesterasas B mediante ensayos de la PCR en larvas individuales de R. microplus, con lo que se detectaron polimorfismos al hacer la traducción a proteína119,120, además se identificó una esterasa en la cepa “Coatzacoalcos” (Cz EST9)121.
En otra investigación se trató de identificar la asociación de mutaciones de genes con resistencia a los piretroides. Notándose que la presencia de la mutación no se asocia con la resistencia en la forma dosis-respuesta122. En estudios referentes a la resistencia a piretroides, trataron de correlacionar diferentes pruebas diagnósticas, y se concluyó que la resistencia está mediada por una mutación en el gen blanco kdr123. Adicionalmente se ha estudiado sobre la participación del citocromo P450, y se ha observado que se expresa en altos niveles en cepas resistentes a piretroides124. Pero se ha evidenciado un proceso multifactorial en la resistencia de R. microplus a los organofosforados y a los piretroides125. Se reportó el primer caso de resistencia al amitraz126 y se describió que la presión de selección con amitraz incrementaba el nivel de resistencia en poblaciones de campo127. Adicionalmente se instrumentó la metodología de la RT-PCR para medir la expresión de colinesterasa y carboxilesterasa en garrapatas resistentes a acaricidas128.
Control inmunológico. Para el control de garrapatas, se han identificado proteínas inmunogénicas derivadas de extractos de los ovarios de R. microplus obtenidas de bovinos después de su inmunización129. En otros estudios se ha caracterizado y evaluado la homología de las proteínas vitelogenina130 y ATAQ, ambos como posibles candidatos vacunales contra R. microplus131,132. Algunos experimentos de inmunización contra garrapatas R. microplus y R. annulatus han mostrado resultados no concluyentes. No obstante, se han continuado estudios similares; tales como el uso de la proteína subolesina, que se describió como un blanco potencial para desarrollar una vacuna contra las garrapatas133,134.
Perspectivas. Es innegable la necesidad de hacer mayor énfasis en la investigación de la epidemiología de las garrapatas; especialmente el cambio climático es un factor que está favoreciendo su mayor distribución espacial y, por ende la infestación de ganado no previamente expuesto. También es imperativo desarrollar técnicas moleculares para el diagnóstico rápido de resistencia a los diferentes principios químicos de los ixodicidas. Colateralmente se debe mantener una línea de investigación del control biológico que involucre la identificación y caracterización de plantas. Debe ser prioritaria una línea de investigación sobre el desarrollo de inmunógenos a partir de proteínas conservadas, asociadas a funciones vitales de las garrapatas. El reto mayor será instrumentar un programa de control integrado para el control de R. microplus.
Babesiosis
La babesiosis bovina o piroplasmosis es una enfermedad parasitaria causada por protozoarios del genero Babesia que invaden a los eritrocitos del hospedador bovino. En México las especies reconocidas son Babesia bovis y B. bigemina, ambas son transmitidas por garrapatas R. microplus y R. annulatus135. Del inventario ganadero de país que es de 35’224,960 cabezas136, aproximadamente el 70 % se mantiene con exposición permanente a la infestación por garrapatas. Por lo que la prevalencia de Babesia spp. varía entre 50 y 96 %, lo que a su vez explica el alto riesgo de la ocurrencia de brotes137.
Se ha señalado que la babesiosis es la enfermedad más importante transmitida por artrópodos al ganado bovino138. En nuestro país se estiman pérdidas por 573.61 millones de dólares anuales por las garrapatas y enfermedades que transmiten139. No obstante, no existe ninguna vacuna comercial, ni la producción de reactivos diagnósticos nacionales. Aunado a lo antes citado, la amplia distribución de resistencia a los ixodicidas y el cambio climático, son factores preponderantes que contribuyen a la abundancia de vectores y a la facilitación en la transmisión de patógenos140.
Aportes del INIFAP
Diagnóstico y epidemiología. En el INIFAP se han instrumentado métodos directos para el diagnóstico confirmatorio de babesiosis. Están disponibles rutinariamente técnicas para la identificación de los estadios intraeritrocíticos. El más común es el frotis de sangre periférica con el que se hace la identificación de B. bovis y B. bigemina mediante la observación microscópica; igualmente se elaboran improntas de tejido cerebral particularmente para la detección de B. bovis141,142. También se puede hacer el análisis histopatológico de tejidos recolectados a la necropsia143,144,145. Se han desarrollado métodos indirectos cuyo fundamento es inmunológico, con los que se detectan anticuerpos circulantes anti-B. bovis o anti-B. bigemina143,146,147. Para estos procedimientos se han obtenido antígenos parasitarios que han sido definidos y caracterizados148,149. Se han observado ventajas al compararlos con antígenos crudos con los que regularmente se obtiene una baja especificidad en las pruebas diagnósticas, esto ocurre por la similitud de epitopos presentes entre diferentes especies de Babesia146,150,151; además de que puede generar reacciones cruzadas con otras especies148,151,152.
En nuestro grupo de investigación también se ha mejorado la especificidad de las pruebas serológicas. Para lo cual se han clonado genes que codifican por péptidos inmunodominantes y específicos de especie; además se han usado anticuerpos monoclonales148,149,153.
En otros estudios se han identificado los antígenos más conservados para B. bovis154-158, los cuales se utilizaron para desarrollar pruebas de ELISA indirecta para ambas especies159,160, que a su vez fueron herramientas para el seguimiento serológico de animales experimentalmente inmunizados161,162,163. Esas pruebas también se incorporaron en estudios seroepidemiológicos de hatos de bovinos localizados en diferentes zonas ganaderas del país160,164.
Por otra parte, hubo un notorio avance en el diagnóstico directo; se reportaron procedimientos moleculares que detectan material genético de los parásitos. Estos han incluido el uso de sondas de ácidos nucleicos o técnicas de amplificación del ácido nucleíco165,166, las cuales se han usado en estudios epidemiológicos en diferentes regiones ganaderas del país167. Usando el ADN genómico de B. bigemina se desarrolló una PCR con alta sensibilidad analítica, para lo cual se hacía la hibridación del producto amplificado con una sonda de ADN no radiactiva168,169. También se instrumentó un formato múltiple para la detección simultánea de B. bovis y B. bigemina; a lo que se agregó el diagnóstico de A. marginale166,170,171. Las sondas de ADN fueron utilizadas en estudios epidemiológicos en Yucatán, Tabasco y Campeche172,173. De igual forma se usaron para el monitoreo de bovinos inoculados con cepas vacunales de B. bovis y B. bigemina149,174; así como en el monitoreo de animales susceptibles introducidos a zonas endémicas175,176. Esta misma metodología demostró su utilidad para la detección del ADN de patógeno en las garrapatas177; así como para la identificación específica de B. bovis y B. bigemina en la garrapata R. microplus178,179.
Prevención. Hasta ahora la mejor estrategia de prevención de babesiosis en regiones endémicas es la inmunización con vacunas vivas atenuadas, las cuales pueden ser derivadas de subinoculación en becerros esplenectomizados, o del cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina180. Con la aplicación de vacunas atenuadas en bovinos susceptibles, se ha demostrado la inducción de una respuesta inmune sólida ante confrontaciones con parásitos de alta virulencia181,182.
Investigadores del INIFAP han participado en el desarrollo y adaptación del cultivo in vitro y actualmente se dispone de cepas atenuadas de B. bovis y B. bigemina en México183,184. El desarrollo en México de la vacuna atenuada a partir del cultivo in vitro se puede reseñar mediante diferentes estudios. Entre los que se incluye la demostración de la baja virulencia de las clonas de parásitos cultivados in vitro que fueron inoculados en bovinos susceptibles185. Al usar el material como inmunógeno fresco, se determinó que la dosis adecuada son 1 x 107 eritrocitos infectados para B. bovis o B. bigemina186,187. En otro estudio se evidenció la necesidad de incluir ambas especies de Babesia para inducir protección exitosa contra la enfermedad188. Resultados similares se obtuvieron con la vacunación de bovinos ante un desafío natural en el trópico189. Posteriormente, se determinó que el material derivado del cultivo in vitro que se retiraba de la criopreservación en nitrógeno liquido (-196 °C), requería incrementar la dosis a 1 x 108 eritrocitos infectados de cada especie, para así proteger a bovinos ante el desafío con parásitos virulentos190. También se evaluó el uso de la vacuna en ganado nativo mantenido en explotaciones de alta endemicidad e inestabilidad enzoótica, en donde también se demostró un excelente nivel de protección contra la babesiosis191. En otro estudio, la vacuna fue adicionada con Lactobacillus casei y fue evaluada ante un desafío natural; se observaron mayores niveles de IgG1 específicos contra B. bovis y B. bigemina; sin embargo, el nivel de protección fue análogo al de la vacuna sin la bacteria192.
El cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina es aparentemente una metodología sencilla; sin embargo, pocos los laboratorios en el mundo lo hacen exitosamente. Después de más de 30 años de haberse establecido en México, existía una baja eficiencia en la producción de biomasa. En los últimos años, el INIFAP se ha posicionado como institución líder a nivel internacional por innovaciones que se han integrado al cultivo in vitro de B. bovis y B. bigemina. Se ha logrado eliminar el suero de bovino del medio de cultivo, que se sustituyó por componentes vitales como la insulina, transferrina, selenito y putrescina. Por primera vez, se logró transferir el proceso a un biorreactor de perfusión, de esa manera se incrementó 300 % el número de eritrocitos infectados. Lo cual, implicó la obtención de un elevado número de dosis vacunales comparado con el procedimiento tradicional193,194,195. El material derivado del biorreactor al ser evaluado como inmunógeno confirió en bovinos un nivel de protección superior al 80 % en un desafío de campo196. Ese inmunógeno sin la presencia de proteínas del suero, se ha propuesto que puede inducir una respuesta con mayor especificidad inmunológica197. Al mismo tiempo, la incorporación del biorreactor ha generado una línea de investigación sobre el uso de antígenos solubles derivados del sobrenadante del cultivo. Recientemente, el laboratorio del INIFAP se ha logrado por primera vez la proliferación de B. bigemina en medio de cultivo libre de componentes de origen animal, y también se transfirió exitosamente al biorreactor. Esto último representa un escalamiento del proceso para la producción de vacuna198. Esos cambios facilitarán la continuidad al desarrollo de vacunas subunitarias199. Las innovaciones antes descritas por su grado de invención han generado dos patentes otorgadas a favor del INIFAP y una más en trámite. Una denominada "Composición del cultivo in vitro libre de suero para la obtención de eritrocitos parasitados con Babesia spp." (Patente 347729). La otra denominada "Proceso para la elaboración de reactivo vacunal de eritrocitos parasitados con Babesia bovis o Babesia bigemina" (Patente 337161).
Perspectivas. Se requiere generar pruebas diagnósticas altamente sensibles con capacidad para identificar cepas de Babesia resistentes o susceptibles a los compuestos antibabesiales. También sería relevante instrumentar un procedimiento para discriminar cepas atenuadas (vacunales, convencionales, genéticamente modificadas) o virulentas de campo. Es indispensable un mapeo dinámico de la distribución y frecuencia para hacer la aplicación oportuna de procedimientos de prevención o control de la babesiosis. Las vacunas vivas ahora son la única forma de prevenir a la enfermedad, pero es imprescindible mantener a las ciencias ómicas para generar mayor conocimiento de las interacciones entre los parásitos y los bovinos. Ese conocimiento facilitará la conducción de vacunas subunitarias que pueden resultar más seguras y más fácilmente escalables.
Conclusiones
En el INIFAP se han desarrollado y adaptado herramientas diagnósticas de tipo serológico y molecular, que han contribuido en programas de prevención y control de las enfermedades del ganado bovino. También se han instrumentado técnicas para la detección de resistencia a los ixodicidas. Se ha determinado la distribución y frecuencia de algunas de las enfermedades más importantes que afectan la ganadería bovina en México. Los biológicos desarrollados comprenden vacunas contra la rabia, anaplasmosis y babesiosis; también una bacterina contra leptospirosis y una bacterina-toxoide contra neumonías. Además, ha se estudiado una vacuna con BCG contra tuberculosis y una vacuna de nueva generación contra la brucelosis. La perspectiva de la salud animal en enfermedades zoonóticas como la tuberculosis y la brucelosis sugieren dirigir esfuerzos científicos y técnicos a su eliminación. Se deberán desarrollar investigaciones sobre el efecto del cambio climático especialmente en enfermedades transmitidas por vectores. En futuros estudios de los investigadores del INIFAP sobre las enfermedades de los bovinos se deberán inevitablemente abarcar estudios moleculares. A través de protocolos y métodos de las ciencias ómicas, como la genómica, epigenómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica y otras ómicas derivadas. Actualmente es la forma más apropiada para comprender los mecanismos de enfermedad, de esa manera se logrará generar vacunas más efectivas y se podrán diseñar herramientas diagnósticas más precisas; mismas que serán fundamentales en programas de control integral. Probablemente el reto mayor será que la investigación en salud animal que se realice en el INIFAP, se incorpore al concepto de "Una Salud". La que se ha definido como un proceso colaborativo multisectorial y transdiciplinario a nivel local, regional, nacional y global, basado en la vinculación entre humanos, animales, plantas y medio ambiente200.
