Localización del estudio

El estudio se realizó en un hato lechero del Campo Experimental Las Margaritas, perteneciente al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), ubicado en la región oriente del estado de Puebla a 20° 00' 07.86'' N y 97° 18' 19.08'' O, a 545 msnm, con temperatura media anual de 21°C y precipitación pluvial anual de 2,500 mm.

Grupos experimentales

Se utilizaron 100 hembras bovinas de las razas Suizo Americano y Holstein en pastoreo rotacional de zacate Estrella de África (Cynodon plectostachyus), que nunca se habían vacunado contra RIB y DVB. Las hembras se dividieron en dos grupos experimentales con 50 individuos cada uno. A un grupo se le aplicó una vacuna comercial; el otro grupo consistió de hembras testigo no vacunadas. La conformación de los dos grupos experimentales fue similar, de tal forma que el grupo vacunado tuvo 33 vacas en lactancia (7 gestantes y 26 vacías), 10 vacas secas gestantes y 7 vaquillas, mientras que el grupo no vacunado estuvo formado de 34 vacas en lactancia (7 gestantes y 27 vacías), 9 vacas secas gestantes y 7 vaquillas. Además, para homogenizar los dos grupos en cuanto a prevalencia de anticuerpos séricos, se les realizó un primer diagnóstico serológico de anticuerpos contra los virus de la RIB y la DVB, antes de la vacunación. Se cuidó que la condición corporal (1=emaciada; 5=obesa) no descendiera de 2.5 unidades.

Protocolo de vacunación

El grupo experimental vacunado se inmunizó por primera vez el día 0; posteriormente se inmunizó el día 30 con una vacuna de refuerzo, aplicando por vía subcutánea 2 ml de una vacuna polivalente comercial en cada inmunización. Sin embargo, el protocolo de vacunación recomendado por el laboratorio consiste en dos aplicaciones subcutáneas de 2 ml cada una con un intervalo de 21 días. La vacuna utilizada en las dos inmunizaciones fue del mismo lote. Ésta consistió de dos fracciones independientes; una preparación liofilizada de cepas activas modificadas químicamente de los virus de la RIB, parainfluenza 3 y síndrome respiratorio sincitial bovino, y una preparación líquida (diluyente) de virus inactivado de DVB tipos 1 y 2 (cepas citopáticas y no citopáticas). Los antígenos virales se propagaron en una línea celular establecida por el laboratorio. Además, la vacuna contenía una combinación de adyuvantes, no descritos por el fabricante, incluido el Amphigen como mejorador de la respuesta inmune. Desde su adquisición, la vacuna se conservó a 4 °C hasta el momento de su aplicación. Durante la vacunación, ésta se mantuvo a la sombra en una hielera con abundantes refrigerantes (5 a 7 °C), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Durante el desarrollo del experimento, ningún animal mostró signos clínicos atribuibles a las enfermedades relacionadas con la vacuna o cualquier otra enfermedad.

Muestreo sanguíneo y obtención de suero post-vacunación

Treinta (30) días después de cada inmunización, se tomaron muestras de sangre a los dos grupos experimentales, para determinar la producción de anticuerpos en respuesta a la primera vacunación y a la vacuna de refuerzo. Las muestras de sangre se recolectaron en tubos al vacío de 6 ml que contenían gel separador de coágulo. Las muestras se centrifugaron a 4,000 rpm durante 10 min, para la obtención de suero sanguíneo. Los sueros recolectados se depositaron en viales de polipropileno de 6 ml y posteriormente se congelaron a -20 °C hasta el análisis de laboratorio.

Análisis de laboratorio

El diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos contra los virus de la RIB y de la DVB se realizó con los kits CIVTEST BOVIS IBR y CIVTEST BOVIS BVD/BD P80 (Laboratorios Hipra, S.A., México), basados en la prueba de ELISA, cuya sensibilidad y especificidad es 96.3 y 99.5 %, respectivamente. En ambos diagnósticos serológicos, la lectura se realizó a una densidad óptica de 450 nanómetros, en un espectrofotómetro ELx800, marca BioTek (BioTek Instruments, Inc., EUA).

Variables de respuesta y análisis estadísticos

Para cada enfermedad, se analizaron tres variables de respuesta: 1) prevalencia de anticuerpos séricos antes de la vacunación (día 0); 2) prevalencia de anticuerpos séricos 30 días después de la primera vacunación (día 30), que se consideró como la producción de anticuerpos en respuesta a la primera vacunación; y 3) prevalencia de anticuerpos séricos 30 días después de la segunda vacunación (día 60), que se consideró como la producción de anticuerpos en respuesta a la vacuna de refuerzo. Las variables de respuesta se trataron como variables binarias, por lo que la prevalencia de anticuerpos se registró como 1 cuando una hembra tuvo anticuerpos séricos en el día 0 antes de la vacunación, 30 días después de la primera vacunación o 30 días después de la vacuna de refuerzo; en caso contrario, la prevalencia de anticuerpos séricos se registró como 0. La información se analizó con el procedimiento GENMOD (PROC GENMOD) del programa SAS, ajustando un modelo de regresión logística que incluyó el efecto fijo de la vacunación o tratamiento (grupo experimental vacunado, grupo experimental no vacunado), en una distribución binomial y aplicando una función liga logit. El criterio de convergencia fue 10^-8 en los seis análisis estadísticos. En análisis preliminares se determinó que el estatus de la hembra (en lactancia, seca, vaquilla) no afectó ninguna de las variables de respuesta analizadas (P>0.05), por lo que no se incluyó en el modelo definitivo.

Rinotraqueitis infecciosa bovina

En el presente estudio, la prevalencia promedio de anticuerpos séricos contra el virus de la RIB fue 16.0 %, la cual es de consideración para un hato sin antecedentes de vacunación; por lo tanto, los animales deberían ser incluidos en un programa de vacunación para protegerlos de la enfermedad y evitar problemas reproductivos. La prevalencia de anticuerpos séricos contra el virus de la RIB observada en este estudio resultó ser menor que las observadas en bovinos en pastoreo en el estado de Veracruz, con valores de 58.6¹⁶ y 76.3 %¹⁷; sin embargo, es superior a la observada (5.3 %) en ganado Cebú, Suizo Pardo y Holstein en Tizimín, Yucatán¹⁸. Estas prevalencias identificadas en bovinos mantenidos en clima tropical, al igual que las observadas en el altiplano mexicano, particularmente la del estado de Hidalgo, que fue de 35.2 %¹⁹, ponen de manifiesto la circulación del virus en el hato con el riesgo de que los animales se enfermen y la necesidad de su control en México. En una revisión de literatura que resumió información de estudios mexicanos publicados de 1975 a 2016, se estimó una prevalencia de anticuerpos contra el virus de la RIB de 56.4 %²⁰.

Fuera de México, en hatos lecheros de Toca-Boyacá y Caquetá, Colombia, se encontraron prevalencias de 35.7²¹ y 90.0 %²², respectivamente; en Valle de Cauca, en bovinos de carne, se encontró una prevalencia de 69.8 %²³. En Perú y Chile se han encontrado prevalencias con valores de 29.0²⁴, 67.6²⁵, 36.0²⁶ y 76.0 %²⁷. Debido a su detección en estos y muchos otros países, el virus de la RIB (HVB-1) es considerado como uno de los agentes patógenos de mayor distribución en el mundo²⁸. Sin embargo, a pesar de que existen múltiples productos biológicos para la inmunización de los animales²⁹, se piensa que es uno de los mayores generadores de pérdidas económicas en la producción pecuaria, tanto de carne, como de leche. Los bovinos asintomáticos constituyen el reservorio más importante, porque pueden excretar el virus de forma intermitente y transmitirlo a bovinos sanos³⁰.

Con la primera vacunación, la prevalencia de anticuerpos en las vacas vacunadas (58 %) fue mayor (P<0.05) que la prevalencia de anticuerpos observada en las no vacunadas (22 %). Esto permite interpretar que hubo producción de anticuerpos en respuesta a la primera vacunación contra el virus de la RIB, pero relativamente leve. Sin embargo, con la vacuna de refuerzo, la prevalencia de anticuerpos en las vacas vacunadas aumentó considerablemente hasta llegar a 94 %, prevalencia que fue mucho mayor (P<0.05) que la encontrada en las vacas no vacunadas (28 %), por lo que el incremento sustancial de anticuerpos refuerza la interpretación de una producción de anticuerpos favorable con la segunda inmunización; por lo tanto, se puede inferir que el virus activo modificado de la vacuna comercial sí produjo protección inmunológica contra el virus de la RIB. Con este protocolo de vacunación (vacuna inicial + vacuna de refuerzo), se considera que es factible proteger a los bovinos contra el virus de la RIB, en particular hembras, que son las que por efecto de la enfermedad padecen infecciones en el tracto genital, como vulvovaginitis pustular infecciosa, metritis⁸, mastitis, abortos, repetición de servicios, infección fetal y anestro^31,32.

La magnitud de la producción de anticuerpos observada en el presente estudio no se logró en un estudio donde se utilizó, en dosis única, una vacuna intranasal de virus atenuados de RIB y PI3 (TSV-2), la cual resultó poco inmunogénica, pues solo 33.3 % de los animales produjeron anticuerpos 28 días después de la vacunación³³; es probable que con la vía intranasal se requiera una segunda inmunización, o más, para lograr una mejor respuesta inmunológica. En otra investigación donde se utilizó vacuna con virus activo modificado, el porcentaje de abortos en hembras vacunadas fue 5 % y en no vacunadas 73 %³⁴, por lo que se puede inferir que la vacuna previno sustancialmente el aborto. Algo similar sucedió en el presente estudio, pues no se observó ningún aborto; sin embargo, en la investigación citada³⁴ no se determinó si el bajo porcentaje de abortos (5 %) se debió al efecto de la vacunación, por lo que se pudo deber a otros factores. En consecuencia, parece mejor utilizar vacuna de virus activo modificado para proteger contra el virus de la RIB, en especial a hembras en edad reproductiva, ya que al replicarse el virus dentro de las células del hospedador, aumenta la inmunidad protectora³⁵.

En Argentina se hizo un estudio donde se utilizaron dos tipos de vacunas intradérmicas elaboradas con BHV-1 inactivado que contenía la secuencia de la versión secretada de la glicoproteína D, una elaborada con adyuvante y la otra no, las cuales se aplicaron con un refuerzo a los 20 y 33 días, asumiendo que ambas incrementaban la respuesta inmune humoral; sin embargo, solo la que tuvo adyuvante mejoró la respuesta inmune celular³⁶.

Diarrea viral bovina

La prevalencia promedio de anticuerpos séricos contra el virus de la DVB obtenida en el presente estudio (8 %) resultó ser menor que las reportadas (69.0 y 60.3 %) por otros autores^37,38 para bovinos en pastoreo en el estado de Veracruz. En estudios realizados en México con vacas lecheras en los estados de Hidalgo y Aguascalientes, se encontraron prevalencias de 32.8⁷ y 48.6 %¹⁹. En una revisión de literatura que resumió información de estudios mexicanos publicados de 1975 a 2016, se estimó una prevalencia de anticuerpos contra el virus de la DVB de 59.3 %³⁹.

Contrario a lo esperado, en el presente estudio fue evidente que las hembras vacunadas no produjeron anticuerpos de manera satisfactoria contra el virus inactivado de la DVB, ya que se esperaba como respuesta humoral una prevalencia de anticuerpos séricos no menor a 94 %, como en la inmunización contra el virus de la RIB, por lo que con la vacuna comercial evaluada no es posible asegurar la protección inmunológica en bovinos, en particular en vacas, que son las que por efecto de la enfermedad padecen infecciones que afectan la reproducción^6,10, y vaquillas de reemplazo, que pueden infectarse desde el nacimiento, padeciendo neumonía, conjuntivitis y úlceras en nariz y boca^6,11,12, incluso pueden llegar a morir debido a la infección, la cual muy frecuentemente no es detectada ni diagnosticada. Por lo tanto, aunque en los últimos años las vacunas con virus inactivado se han mejorado al agregar adyuvantes potentes, la escasa producción de anticuerpos en este estudio en respuesta a la vacunación con virus inactivado obliga a probar otras opciones de control, pues se ha sugerido que una buena estrategia para superar la débil producción de anticuerpos en respuesta a la vacunación con virus inactivado, es la alternancia de inmunizaciones repetidas con vacunas de virus inactivado y vacunas de virus activo modificado, o viceversa⁴⁰, como se demostró en un experimento donde se utilizó un protocolo de vacunación para vaquillas, que consistió en inmunizar inicialmente con virus inactivado, cuatro semanas después con virus activo modificado, y posteriormente se revacunó anualmente con virus inactivado, mejorándose la respuesta inmune considerablemente⁴¹.

Por otro lado, se ha reportado que la vacunación contra DVB como única medida de control no es suficiente para prevenir la circulación del virus de campo en hatos bovinos^42,43,44, pues se debe incluir como acción importante la eliminación de animales persistentemente infectados (PI) y usar estrategias de vacunación eficaces para la reducción de este tipo de animales, y así controlar la DVB con mayor eficiencia⁴⁵ después de un programa de detección de animales PI desde el nacimiento⁴⁶, ya que estos animales son inmunotolerantes a los virus no citopatogénicos homólogos⁴⁷. Por lo tanto, el no haber observado una producción de anticuerpos adecuada en los animales vacunados se pudo deber a que el hato experimental utilizado presentaba una proporción importante de animales PI, los cuales no desarrollan anticuerpos, ya que el sistema inmune no considera al virus como un agente ajeno al organismo⁴⁷. Otra razón podría ser que la vacuna de virus inactivado indujo una producción de anticuerpos de corta duración, ya que ésta no promueve una memoria inmunológica en comparación con las vacunas de virus activo⁴⁸; en consecuencia, es muy probable que los anticuerpos inducidos por la vacuna de virus inactivado de DVB se hayan encontrado en niveles indetectables en el momento en que se realizó la prueba de ELISA, considerando que en un estudio en el que se inmunizó con dos vacunas de virus inactivado a dos grupos de animales, se obtuvo una prevalencia de anticuerpos séricos de 0 y 12.5 %, después de utilizar un kit de ELISA para detectar anticuerpos contra la proteína p80 del virus (como en el presente estudio); por el contrario, cuando se utilizó un kit de ELISA para anticuerpos contra el virus completo, se detectaron anticuerpos en el 80 y 100 % de los animales⁴⁹. Sin embargo, los autores del estudio⁴⁹ comentaron que existe discrepancia en los resultados obtenidos, ya que hay estudios previos en los que sí se logró la detección de anticuerpos con dicho kit de ELISA, argumentando que la proteína p80 se expresa mayormente durante la replicación viral, pero la replicación no sucede si se aplica vacuna de virus inactivado. Por lo tanto, si la prueba de ELISA detecta adecuadamente anticuerpos específicos contra la proteína p80 del virus de la DVB, y sabiendo que la mayor proporción de anticuerpos presentes en el suero son de clase IgG, los cuales son los que aumentan de forma significativa después de una infección natural o vacunación, sin importar si se trata de una vacuna de virus activo o inactivo, se considera que la prueba de ELISA utilizada en el presente estudio fue eficaz en la detección de anticuerpos contra el virus de la DVB inducidos por la vacuna con virus inactivado.

Adicionalmente, se ha mencionado que la seguridad y eficacia de las vacunas inactivadas pueden ser atribuibles a varios factores, entre los que se encuentran el tipo de cepa, la técnica de inactivación, el título viral y el adyuvante utilizado⁵⁰, por lo que quizás alguno de estos factores también pudo haber influido en la producción de anticuerpos observada. Finalmente, en este trabajo se esperaba que con la inmunización se indujera la formación de anticuerpos en los animales para establecer una “inmunidad de hato”, que evitara que el virus circulara en los animales y, así, prevenir la presentación de signos clínicos de las enfermedades, ya que se conocía la proporción de animales infectados antes de aplicar los tratamientos.