Área de estudio

El estudio se realizó en los laboratorios Multidisciplinario, Nutrición Animal y Análisis Especiales, del Instituto de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo (UAEH), en Tulancingo de Bravo, Hidalgo, México.

Obtención y preparación de las muestras

Frutos de xoconostle (Opuntia matudae Scheinvar cv. Rosa) en estado de madurez comercial cosechados en el estado de Hidalgo, México (Figura 1), se cortaron en rodajas y se deshidrataron durante 72 h en estufa con flujo de aire (Felisa 242 A, México) a 60°C. Posteriormente se molió (Pulverizador Weg, México) y pasó a través de una malla de 2 mm de diámetro. El rastrojo de maíz se obtuvo del Rancho Universitario de la Universidad Autónoma del Estado de Hidalgo y se deshidrató y pulverizó de la misma manera al xoconostle.

Figura 1 Frutos de xoconostle (Opuntia matudae Scheinvar cv. Rosa) 

El líquido ruminal se obtuvo de dos ovinos (Hampshire, 54 kg peso vivo ± 2.4) vía cánula en rumen. Todos los procedimientos quirúrgicos se llevaron a cabo con base en el protocolo del Comité Institucional de Ética para el Cuidado y uso de Animales de Laboratorio de la UAEH y en apego a los lineamientos de la Ley de protección y trato digno para los animales del gobierno del estado de Hidalgo, México¹⁰. Los ovinos recibieron antiparasitario comercial (Ivermectina, Bayer. 200 mcg/ kg peso vivo), vitaminas ADE (Vigantol ADE fuerte 2 ml) y se alimentaron ad libitum con rastrojo de maíz y premezcla mineral (Multi-Brick Triple, Malta-Cleyton) durante 15 días previos a la toma del líquido ruminal.

Caracterización fisicoquímica

La caracterización fisicoquímica de los sustratos (rastrojo de maíz y xoconostle) y de los tratamientos establecidos: 100 % maíz-0% xoconostle (0%Xoco); 98 % maíz-2% xoconostle (2%Xoco); 96 % maíz-4% xoconostle (4%Xoco) y 94 % maíz-6% xoconostle (6%Xoco) se llevó a cabo mediante análisis proximal, determinando: contenido de humedad; contenido de minerales (Mi); extracto etéreo (EE); proteína cruda (PC); fibra cruda (FC)¹¹. La proporción de fibra detergente neutro (FDN) y fibra detergente ácido (FDA) se determinó de acuerdo con lo descrito por Van Soest¹², las digestiones se llevaron a cabo utilizando bolsas filtro (Ankon F57 USA). En ambos casos se usó una bolsa sin sustrato como blanco para efectuar los cálculos.

Determinación de fenoles totales

El contenido de fenoles totales se determinó utilizando el método de Folin-Ciocalteu¹³, la curva de calibración se construyó a partir de una solución estándar de ácido gálico (1 g/L H₂O) y se obtuvieron diluciones 0-20 ppm. A 250 µl de cada dilución se agregaron 5 ml de Folin-Ciocalteu 1/10 en recipiente estanco a la luz y se dejó reposar por 8 min. Posteriormente se agregaron 4 ml de Na₂CO₃ 7.5 % y se mantuvo 2 h en oscuridad. Se leyó la absorbancia a 765 nm (A₇₆₅) (Spectronic-Genesys 5, USA) utilizando agua destilada como blanco. Aproximadamente 150 mg de muestra, rastrojo de maíz o xoconostle, se colocaron en viales de 2 ml adicionando 1.5 ml de metanol y 100 µl de NaF 2 mM con objeto de inhibir la polifenol-oxidasa (PPO). Se colocaron en recipiente estanco a la luz y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se centrifugaron a 10,510 xg (Hermle Z36 HK, Alemania) por 20 min a 4 °C. Alícuotas de 250 µl de sobrenadante se trataron de la misma manera que las diluciones para construir la curva de calibración, se leyó absorbancia a 765 nm (A₇₆₅) y se realizaron los cálculos correspondientes.

Determinación de la capacidad antioxidante

Método ABTS (2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico))

El radical ABTS^•+se obtuvo después de la reacción de 10 ml de solución ABTS (7 mM) con 10 ml de solución de persulfato potásico (2.45 mM). La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente y en la oscuridad con agitación constante durante 16 h¹⁴. Una vez formado el radical ABTS^•+se diluyó con etanol (20 %) hasta ajustar la absorbancia 0.7(±0.1) a 754 nm (A₇₅₄) utilizando etanol (20 %) como blanco. Como antioxidante de referencia se utilizó diluciones de ácido ascórbico 0-100 ppm y ácido gálico 0-10 ppm para obtener las curvas de calibración. Aproximadamente 1 g de muestra se suspendió en 9 ml de etanol (50 %) en tubos de centrífuga estancos a la luz y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se centrifugó a 10,510 xg a 4 °C por 20 min; 200 µl de sobrenadante, dilución de ácido ascórbico o gálico se adicionaron con 2 ml de ABTS^•+estandarizado, se dejó reposar 6 min y se determinó A₇₅₄ utilizando etanol (20 %) como blanco. Las curvas de calibración se utilizaron para convertir las absorbancias obtenidas en las muestras, a equivalentes de ácido ascórbico (EAA) o equivalentes de ácido gálico (EAG) respectivamente.

Método DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo)

Se usó el método desarrollado por Brand-Williams¹⁵ con algunas modificaciones al descrito por Kim¹⁶ donde la absorbancia del radical DPPH^• 200 µM en metanol (80 %) agitado durante 2 h en recipiente estanco a la luz y ajustada su absorbancia a 515 nm (A₅₁₅) a 0.7±0.1 con metanol (80 %) fue medida después de la reacción con un antioxidante de referencia. Como antioxidante de referencia se utilizó diluciones de ácido ascórbico 0-50 ppm y ácido gálico 0-5 ppm para obtener las curvas de calibración. Aproximadamente 1 g de muestra se suspendió en 9 ml de etanol (50 %) en tubos de centrífuga estancos a la luz y se agitaron a temperatura ambiente durante 30 min. Se centrifugó a 10,510 xg a 4 °C por 20 min; 0.5 ml de sobrenadante o de dilución de ácido ascórbico se adicionaron con 2.5 ml de DPPH^• estandarizado, se dejó reposar 1 h y se determinó A₅₁₅ utilizando metanol (80) como blanco.

pH y degradación in vitro de la materia seca (DIVMS)

El pH fue medido (HANNA, HI2211, Rumania) al terminar el tiempo de incubación y el contenido de cada frasco fue transferido a tubos de polisulfona de 50 ml, los cuales se centrifugaron (HERMLE, Z326K, Alemania) a 15,130 xg durante 15 min. El sobrenadante se retiró por decantación y el material sólido se secó a 65 °C por 48 h. La DIVMS se calculó como la diferencia entre el peso de la materia seca inicial y el peso de la materia seca residual y se expresó como g/100 g MS.

Determinación de ácidos grasos volátiles (AGV)

Al final de la fermentación, 1.6 ml de la fracción líquida de los frascos de fermentación se colocaron en viales de 2.5 ml que contenían 0.4 ml de HPO₃ 25% p/v, se almacenaron a 5°C. Posteriormente se centrifugaron a 15,130 xg 15 min. La concentración, milimoles/litro (mM L^-1) de AGV se determinó en un cromatógrafo de gases Claurus 500, Perkin Elmer, USA, provisto con automuestreador, columna capilar (ELITE-FFAP, Perkin Elmer, USA) de 15 m, y detector de ionización de flama (FID). El gas acarreador fue N₂ a 60 psi, se usó H₂ y aire extra seco para generar la flama. Las temperaturas del horno, inyector y columna fueron 120, 250 y 250 °C, respectivamente. El tiempo de retención fue de 1.22, 1.55 y 2.02 min para acético, propiónico y butírico, respectivamente. Previamente fue construida una curva de calibración con soluciones estándar de ácido acético, propiónico y butírico¹⁷.

Fermentación y producción de gas

En frascos de vidrio con capacidad de 125 ml se depositaron 0.5 g de sustrato correspondiente a cada tratamiento rastrojo de maíz-xoconostle. El líquido ruminal se filtró a través de ocho capas de gasa y se almacenó a 39 °C en condiciones anaerobias hasta su uso. A cada frasco y bajo flujo continuo de CO₂, se agregaron 40 ml de medio de cultivo y 4 ml de líquido ruminal. Por litro de solución el medio de cultivo contiene: 1 g NH₄HCO₃; 8.74 g NaHCO₃; 1.43 g Na₂HPO₄; 1.55 g KH₂PO₄; 0.15 g MgSO₄.7H₂O; 0.017 g CaCl₂.2H₂O; 0.013 g MnCl.4H₂O; 0.0013 g CoCl.6H₂O; 0.01 g FeCl₃; 1.29 ml de solución rezasurina 0.1 % como indicador y 37 ml de solución reductora conteniendo 0.21 g Na₂SO₄ y 1.5 ml de solución 0.1N NaOH. Los frascos se cerraron herméticamente (Engargoladora manual, Wheaton, USA) mediante un tapón siliconado y una cápsula vial con centro desprendible. Recipientes similares con solamente inóculo ruminal se incluyeron como blancos. Los frascos se incubaron en baño maría a 39 °C. El volumen de gas producido (ml) dentro de cada frasco a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 22, 26, 30, 42, 54, 66, 78, 92 h de incubación, se registró mediante el desplazamiento de volumen de agua realizando una punción a través del tapón de silicón usando una aguja hipodérmica acoplada a una columna de vidrio graduada conteniendo agua. Después de cada medición se liberó el gas igualando la presión interna y externa de los frascos¹⁸.

La velocidad a que tiene lugar la producción de gas depende de las características de la microbiota ruminal presente¹⁹; asi como del tipo de sustrato, pH, potencial Redox²⁰ dando como resultado diferentes perfiles cinéticos. La descripción matématica de estos perfiles permite comparar características de los sustratos o del ambiente de fermentación. El ajuste de los datos experimentales al modelo Logístico mediante el software Sigma Plot 12^© permitió obtener la Ecuación 1; donde y (ml g^-1 MS) denota la cantidad de gas acumulado producido por gramo de materia seca (MS) al tiempo t (h) durante la incubación. A (ml g^-1MS) representa la máxima producción de gas a tiempo infinito. to (h) es el tiempo de incubación en el que se ha producido la mitad de A y b es una constante adimensional que determina el perfil característico y por lo tanto el punto de inflexión de la curva²¹.

El punto de inflexión indicador de la fase de retardo (L) o Ecuación 2 resultante de dy/dt es:

Considerando la desaparición de sustrato (P) como una cinética de primer orden, la tasa de digestión del sustrato (S) (Ecuación 3) para valores de b>1 aumenta hasta alcanzar un máximo (S_max) cuando el tamaño de la población microbiana ya no limita la fermentación del alimento. El tiempo en el que se alcanza S_max está dado por la resolución de dS/dt=0 (Ecuación 4)²¹.

Determinación de metano

El volumen de CH₄ se midió mediante la técnica descrita por Torres-Salado²² con las siguientes modificaciones: el frasco biodigestor se acopló mediante una manguera Taygon® (2.38 mm Ø interno y 30 cm de longitud) con agujas hipodérmicas (20 G x 32 mm) en los extremos a un vial invertido y totalmente lleno con NaOH 2 N. El gas originado por la fermentación del sustrato fluye a través del NaOH 2N, donde el CO₂ reacciona y forma carbonato de sodio. El gas residual es insoluble en la solución y corresponde a CH₄, donde la cantidad se cuantifica según los ml de NAOH 2N desplazados a través de otra aguja hipodérmica colocada en el tapón siliconado como válvula de salida y medidos con una probeta.

Análisis estadístico

Se utilizó un diseño completamente al azar, el modelo estadístico utilizado fue:

Donde:

Y_ij Variable respuesta de la ij-esima unidad experimental;

µ Efecto de la media general;

t i Efecto del i-esimo tratamiento;

ε_ij Efecto del error experimental asociado a la i-esima unidad experimental.

Cada tratamiento tuvo cinco repeticiones independientes siendo la unidad experimental un frasco con 500 mg de sustrato. El análisis de datos se hizo mediante ANOVA y la comparación de medias con la prueba de Tukey ajustada a un nivel de significancia α=0.05.

Caracterización fisicoquímica y capacidad antioxidante de los sustratos utilizados

La concentración de humedad, PC, EE y cenizas en el Xoconostle (Cuadro 1) es similar a lo reportado por Sánchez-González²³, donde la variación en estos nutrientes depende de la madurez y de las condiciones de cultivo. Información acerca de la proporción de FDN, FDA es de escasa a nula debido a que este fruto se utiliza principalmente en la alimentación humana, donde la relevancia se debe a sus propiedades benéficas y antioxidantes como lo reportaron Morales y Espinoza-Muñoz^24,25. No obstante, al ser un fruto del nopal, la concentración de FDN es similar a la tuna (52 % vs 40.74 %) con base en lo reportado en el NRC²⁶. El contenido de compuestos fenólicos y actividad antioxidante en el rastrojo de maíz utilizado en este estudio (Cuadro 1) es próximo a lo reportado por Vázquez-Olivo²⁷ para rastrojo de maíz con valores de 219 EAG/100 g muestra. Respecto al xoconostle, el contenido de fenoles totales es consistente con lo reportado por otras investigaciones^28,29.

La caracterización fisicoquímica de los tratamientos se muestra en el Cuadro 2, donde se observa que el contenido de MS disminuye al aumentar el contenido de xoconostle, esto se debe a que la humedad contenida en el fruto es mayor a la del rastrojo de maíz, por el contrario, la concentración de Mi y PC aumenta proporcionalmente en los tratamientos dado que al sustituir rastrojo por xoconostle, este último contiene mayor porcentaje de estos componentes como se muestra en el Cuadro 1. Respecto al EE al aumentar la cantidad sustituida de rastrojo por xoconostle, la proporción de esta fracción en los tratamientos aumenta de manera sustancial, pues la magnitud del extracto determinado en el xoconostle es 4.21 veces mayor que en la del rastrojo de maíz. Algunas variedades de xoconostle como Opuntia matudae Scheinvar cv. Rosa contiene ácidos grasos saturados como el palmítico y mirístico; y poliinsaturados como oléico y linoléico²⁴. No obstante el incremento de EE (Cuadro 2), la concentración de lípidos en los tratamientos de este estudio se considera no influye en la metanogénesis ya que su efecto se ha observado a partir de 50 g kg^-1 de materia seca en la dieta³⁰. El ELN incluye los carbohidratos asimilables y la fibra cruda, este parámetro disminuye al aumentar la cantidad sustituida de rastrojo de maíz por xoconostle ya que éste último a pesar de contener mayor cantidad de carbohidratos simples que el rastrojo de maíz, tiene una menor proporción de carbohidratos estructurales, 18 % menos de FDA. Esta disminución en la FDA da como resultado una mejor digestibilidad del alimento, ya que el suministro de carbohidratos no estructurales, hasta cierto límite, reduce la fase de retardo y mejora el contenido energético de la dieta siendo determinante en la producción de proteína bacteriana ruminal. El aumento en el porcentaje de xoconostle como sustituto incrementó también el contenido de FT y la actividad antioxidante. La presencia de compuestos fenólicos pudiese tener un efecto sobre algunos microorganismos del rumen; se ha demostrado que estos metabolitos secundarios de las plantas tienen un efecto inhibitorio, Diaz-Solares y otros, evaluaron el contenido de fenoles y flavonoides asi como la capacidad antimicrobiana de extractos de hojas de Morus alba encontrando presencia abundante con actividad frente a S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae y S. β hemolitico sugiriendo su uso en alimentación animal³¹. Hayek e Ibrahim⁷, reportan efecto inhibitorio de extractos acuosos de xoconostle sobre E.coli. Se ha demostrado que los compuestos fenólicos contenidos en algunos vegetales mejoran la fermentación ruminal y disminuyen la producción de metano^32,33,34.

pH y DIVMS

Los valores de pH del líquido ruminal de los tratamientos al final de la fermentación no mostraron diferencia significativa (P>0.5) (Cuadro 3). La utilización de una solución tampón a base de bicarbonato y fosfatos en el medio de cultivo probablemente mantuvo el pH con valores por encima de 6.0 durante el tiempo de fermentación favoreciendo la digestibilidad de la MS. Valores de pH por debajo de 6.0 inhiben el desarrollo de las bacterias celulólíticas (i.e. dietas con alto contenido de concentrados) y dan lugar a mayores tiempos en la fase de retardo (L) y a una disminución en la DIVMS^35,36. Uno de los parámetros de calidad de los forrajes es la DIVMS, ya que indica la eficiencia con que pueden ser metabolizados por los rumiantes. En este estudio, el tratamiento 6% Xoco tuvo una mayor DIVMS que el control (P<0.05). El tratamiento 4% Xoco no presentó diferencia estádistica respecto al testigo pero si una tendencia a incrementar, entre ambos tratamientos no hubo diferencia significativa (P>0.05), este incremento en la DIVMS debido posiblemente a la adición de carbohidratos no estructurales del xoconostle ocasionó una mejor fermentación dando como resultado una menor fase de retardo y una mayor tasa de digestión (Cuadro 3). La digestibilidad in vitro de la FDN (DIVFDN) no mostró diferencia entre los tratamientos (P>0.05) lo que podría indicar que los compuestos bioactivos del xoconostle no tienen actividad sobre las bacterias celulolíticas y que la degradación de los carbohidratos estructurales no se ve afectada. Respecto al nitrógeno total no se tuvo diferencia significativa entre los tratamientos (P>0.05) pero, la concentración al final del experimento se incrementó probablemente como resultado de la acción bacteriana sobre las proteínas solubilizando el nitrógeno.

Producción de ácidos grasos volátiles (AGV)

La concentración de AGV (mM L^-1) en el líquido ruminal como resultado de la fermentación se muestran en el Cuadro 4 donde se observa que el tratamiento 6% Xoco tiene diferencia en la cantidad de ácido propiónico generado (P<0.05) que sugiere que el xoconostle tiene un efecto en la microbiota ruminal direccionando la fermentación ruminal hacia una disminución de H⁺ disponible, necesario para la producción de CH₄³³, otra posibilidad es que el metabolismo de compuestos fenólicos contenidos en el xoconostle incremente la síntesis de ácido propiónico lo que también disminuye la producción de metano pero sin tener un efecto directo sobre los micoorganismos ruminales (Ku Vera, et al)³⁷.

Producción de gas

Los perfiles de producción de gas total acumulado y de gas metano (Figura 2a y 2b) muestran que los tratamientos tienen un comportamiento sigmoidal durante las 92 h de incubación siguiendo el comportamiento logístico³⁸, el modelo matemático utilizado²¹ permitió efectuar un buen ajuste de los datos (R² >0.99). Respecto al volumen acumulado de gas total, el tratamiento 2% Xoco fue diferente (P<0.05) observándose una mayor producción de gas respecto de los tratamientos 4 y 6% Xoco (Cuadro 5), probablemente al aumentar la cantidad de compuestos fenólicos contenidos en el xoconostle se tiene una consecuencia en la actividad de la microbiota ruminal, resultados similares fueron determinados en estudios previos³⁹. La incorporación de compuestos fenólicos como los taninos en una fermentación ruminal tienen efecto sobre la microbiota ya que pueden unirse a la pared celular de los microorganismos causando cambios morfológicos o secreción de enzimas extracelulares o pueden unirse a enzimas provocando cambios en su metabolismo⁴⁰. Los perfiles de producción de CH₄ (Figura 2b) muestran que el volumen producido tiende a disminuir en respuesta a la incorporación de xoconostle, siendo el tratamiento 6% Xoco donde el efecto es más evidente. Existen diversos estudios que abordan la reducción de metano entérico a partir de la incorporación de compuestos fenólicos, como por ejemplo el de Tiemann⁴¹, que evaluó el efecto de dos leguminosas ricas en taninos condensados sobre las emisiones de metano en corderos logrando una reducción de hasta 24 % pero reduciendo la digestibilidad de la materia seca. En este estudio, se logró una reducción del 8.5 % en el tratamiento 6% Xoco sin tener este efecto negativo.

Figura 2 Volumen de gas total (a) y metano (b) durante 92 h de fermentación in vitro 

Los parámetros cinéticos resultantes del ajuste al modelo Logístico se muestran en el Cuadro 3 y mediante la Ecuación 4, determinan ts_max para los tratamientos del estudio siendo de 5.3, 2.8, 0.9 y 1.1 h para 0% Xoco, 2% Xoco, 4% Xoco y 6% Xoco respectivamente (Figura 3). Una reducción en el tiempo para alcanzar la tasa máxima de digestión del sustrato representa una mejor digestibilidad y por lo tanto menor producción de metano.

Figura 3 Cambio en la tasa de digestión (S) durante las 92 h de fermentación