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Introducción
Cedrela odorata L. es la segunda especie de madera preciosa con mayor importancia comercial en las regiones tropicales y subtropicales de México y de América Latina (Pennington y Sarukhán, 2005), por lo que se considera prioritaria para los programas de reforestación y plantaciones forestales comerciales. Sin embargo, debido a la destrucción de su hábitat por la deforestación y el aprovechamiento desmedido, está incluida en el Apéndice III de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres-2013 (CITES, por sus siglas en inglés) para reglamentar su comercio y evitar su explotación insostenible; además, forma parte de la lista roja de la International Union for Conservation of Nature (IUCN, por sus siglas en inglés) como especie vulnerable (Mark y Rivers, 2017); y en México, está catalogada en la NOM-059-SEMARNAT-2019 como especie sujeta a protección especial (Semarnat, 2019). Establecer estrategias para el manejo y conservación de semillas resulta fundamental para preservar este recurso genético en bancos de germoplasma, así como para abastecer la creciente demanda de semillas para los programas de plantaciones y reforestación.
De acuerdo con sus características de almacenamiento, las semillas de C. odorata se clasifican como intermedias, ya que son relativamente tolerantes a la deshidratación, aunque sensibles al enfriamiento (Andrés et al., 2011). No obstante, su viabilidad se reduce a los pocos meses después de recolectada, lo que limita la posibilidad de mantenerlas a mediano y largo plazo en condiciones ex situ (García y Abdelnour, 2013) y refuerza la necesidad de buscar alternativas para su preservación.
La crioconservación, o almacenamiento de células, tejidos u organismos a temperaturas ultra bajas, en nitrógeno líquido (N2L, por debajo de -150 °C), se ha implementado con éxito para la conservación de especies agrícolas (Hor et al., 2005; Acosta et al., 2020), ornamentales (Hirano et al., 2009) y forestales (Pita et al., 1998; Michalak et al., 2015). Además, representa una opción para especies en peligro de extinción, así como tropicales con semillas intermedias o recalcitrantes, en particular de aquellas que pueden soportar una deshidratación parcial (Hor et al., 2005), como el cedro rojo. La técnica tiene como finalidad detener los procesos metabólicos y la división celular, lo cual evita el deterioro (Engelmann y Dussert, 2013).
No obstante, el proceso de congelación tiene consecuencias ya que puede inducir formación de cristales y choque osmótico, lo que resulta letal para el tejido; por lo que, el éxito depende del manejo adecuado del contenido de humedad celular (Dussert et al., 2001; Hor et al., 2005). Debido a que el contenido de agua y macromoléculas difiere en las semillas de las distintas especies, se requiere estandarizar protocolos que limiten el daño durante la congelación y la posterior descongelación. Por otra parte, es necesario evaluar la efectividad del proceso, tanto para conservar la viabilidad y germinabilidad de las semillas, así como su potencial para producir plantas de buena calidad.
La investigación en torno a la crioconservación de tejidos en el género Cedrela son escasos, pero prometedores. Estudios con C. fissilis Vell. (Da Costa et al., 2003) muestran que las semillas toleran el congelamiento con N2L y se recuperan para producir plántulas vigorosas, siempre y cuando el contenido de humedad se mantenga entre 6 y 7 %. De manera similar, en C. odorata la vitrificación y congelamiento de ápices y semillas, así como la posterior recuperación en condiciones in vitro promueve una alta sobrevivencia, además de una germinación eficiente, incluso después de varios meses de congelamiento (García y Abdelnour, 2013). Sin embargo, aún se desconoce el impacto de diferentes estrategias de manejo de las semillas previo al tratamiento con N2L sobre la germinación, sobrevivencia, enraizamiento y calidad en general de las plántulas obtenidas. Por lo anterior, los objetivos del presente trabajo fueron: 1) determinar la eficiencia de distintas estrategias de crioconservación sobre la tolerancia a la congelación en semillas de C. odorata; y 2) comprobar la capacidad de enraizamiento, supervivencia y crecimiento de plántulas después de 16 semanas de su transplante al vivero.
Materiales y Métodos
Material vegetal
Se utilizó una mezcla compuesta de semillas de C. odorata recolectadas en 2018, procedentes de los estados de Chiapas, Tabasco y Veracruz, México. A partir de dicha mezcla, se obtuvo una muestra de trabajo de 1 100 semillas sin daños físicos, ni evidencia de contaminación por plagas o enfermedades. El contenido de humedad (CH) del lote fue de 8 % y se determinó previo al desarrollo de los experimentos de acuerdo a los lineamientos del ISTA (2016).
Pretratamiento de semilla y ultracongelación
Se comparó el efecto del congelamiento en N2L en semillas intactas que no recibieron ningún manejo (desnudas - T0), con semillas sometidas a distintos pretratamientos (Cuadro 1), en las que se probó el efecto de la deshidratación (T1) y encapsulación/deshidratación (T2 y T3); así como la aplicación adicional de distintos osmoprotectores, solos (T4, T5 y T6) o en combinación (T7 y T8). En cada tratamiento se utilizaron cinco repeticiones de 20 semillas, para un total de 100 semillas. Como control de germinación, se utilizó semilla sin tratar ni congelar (TP).
Cuadro 1 Tratamientos de crioconservación de semillas de Cedrela odorata L.
| Preacondicionamiento | Exposición en N2L |
|||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Tratamiento | Deshidratación (%) |
Encapsulación | Vitrificación | |||
| LS | PVS2 | PVS3 | ||||
| TP | No | No | No | No | No | No |
| T0 | No | No | No | No | No | Si |
| T1 | 5 | No | No | No | No | Si |
| T2 | No | Si | No | No | No | Si |
| T3 | 5 | Si | No | No | No | Si |
| T4 | 5 | Si | Si | No | No | Si |
| T5 | 5 | Si | No | Si | No | Si |
| T6 | 5 | Si | No | No | Si | Si |
| T7 | 5 | Si | Si | Si | No | Si |
| T8 | 5 | Si | Si | No | Si | Si |
Para los tratamientos que incluyeron encapsulación/deshidratación, estos se colocaron en solución de alginato de sodio 2 % (Sigma); posteriormente, se transfirieron, de manera individual, a una solución de polimerización de cloruro de calcio 0.1 M (Sigma) durante 15 minutos. Por último, se colocaron en una cámara de desecación con sílica gel activada hasta alcanzar peso constante (5.13 % CH después de 2.5 horas en la semilla sin encapsular y 5.24 % en la semilla encapsulada). Se repitió este procedimiento con el resto de los tratamientos.
En los tratamientos con osmoprotectores, las semillas encapsuladas/deshidratadas se sumergieron durante 10 minutos en LS (Loading solution -solución de carga: medio Murashige y Skoog (1962), glicerol 2.0 M y sacarosa 0.4 M) (Nishizawa et al., 1993); enseguida se dejaron 20 minutos, en PVS2 (glicerol 30 %, etilenglicol 15 %, dimetil sulfóxido 15 %, sacarosa 0.4 M) (Sakai et al., 1990), o en PVS3 (glicerol 50 %, sacarosa 1.5 M) (Nishizawa et al., 1993).
Las semillas de los distintos tratamientos se sumergieron en N2L durante 20 minutos. El descongelamiento se hizo a temperatura ambiente.
Germinación y emergencia de plántulas
Después de aplicar los distintos tratamientos, las semillas se colocaron en cajas germinadoras (Seedburo TM ) sobre papel filtro humedecido con agua bidestilada estéril. La incubación se realizó en una cámara climática Memmert HPP750 (Memmert GmbH + Co.Kg, Alemania), a 28 °C (día/noche) y humedad relativa ambiental. Las semillas se revisaron diariamente durante 22 días y se consideraron como germinadas, cuando la raíz sobresalió de la testa con 3 mm de longitud, aproximadamente. Se evaluaron: la capacidad germinativa (CG), como el porcentaje de germinación al final de la prueba; la energía germinativa (EG), como el número de días en el que se logra 50 % de la germinación (valores mayores indicaron menor EG) (Juárez-Agis et al., 2006); el valor germinativo (VG), que se obtuvo con la ecuación de Czabator (1962):
Donde: GMD (germinación media diaria) resultó de dividir el porcentaje final de semillas germinadas entre el número de días de prueba (Viveros-Viveros et al., 2015); y el valor pico (VP) corresponde al porcentaje acumulado en el punto de inflexión de la curva de germinación (González-Zertuche y Orozco-Segovia, 1996).
Una vez germinadas, las semillas se depositaron sobre sustrato húmedo esterilizado (35 % de Peat Moss, 35 % de perlita y 30 % de vermiculita) bajo condiciones de invernadero. El diseño fue completamente aleatorio acorde con los diez tratamientos y con cuatro repeticiones. Después de 15 días se contabilizó el porcentaje de semillas con crecimiento de la raíz principal, la generación de raíces secundarias, crecimiento del hipocótilo y aparición de hojas verdaderas.
Supervivencia, crecimiento y biomasa de plántulas
De cada uno de los tratamientos, se seleccionaron aleatoriamente 15 plántulas enraizadas y se trasplantaron en tubetes de 250 mL con sustrato esterilizado (35 % de Peat Moss, 35 % de perlita y 30 % de vermiculita) y 4.2 g L-1 de Multicote Ⓡ para su crecimiento en vivero durante 16 semanas. El diseño experimental fue en bloques completos al azar, con 10 tratamientos, cinco repeticiones (bloques) y tres plantas por unidad experimental. Se evaluó la supervivencia (%), altura del hipocótilo (mm), altura total (mm), diámetro basal (cuello de raíz) (mm), diámetro de copa (mm), longitud de raíz principal (cm), con el apoyo de un vernier digital Truper®; además se obtuvieron el peso fresco de raíz (PFR) (g), peso fresco de follaje (PFF) (g), peso seco aéreo (PSA) (g) y peso seco radicular (PSR) (g); los cuales se determinaron con una báscula analítica (OHANUS, modelo GalaxyⓇ 200), previa deshidratación de las plantas en un horno eléctrico (Riossa, modelo OHF-125) a 96 °C, hasta obtener peso constante; también, se obtuvo el peso seco total (PST) (g); relación PSA/PSR (Ruano , 2003).
Análisis de datos
Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianzas de los datos de todas las variables (germinación, enraizamiento, supervivencia y crecimiento) se verificaron con la prueba de Shapiro-Wilk y Levene, respectivamente. Únicamente, el porcentaje de plántulas establecidas cumplió con los supuestos (p ≥ 0.0893), para el cual se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias de Tukey (p ≤ 0.05). El resto de las variables no cumplieron con los supuestos (p ≤ 0.0433); por lo tanto, se analizaron mediante pruebas no paramétricas de varianza y comparaciones múltiples de rangos (Kruskal y Wallis, 1952; Conover, 2012). Para la supervivencia, las variables de crecimiento y relación PSA/PSR (p ≤ 0.0335) se realizaron análisis de varianza y comparaciones de medias no paramétricas RT-3 (Conover, 2012), mientras que para los datos de longitud de raíz (p ≥ 0.2479) se hizo un análisis de varianza paramétrica y comparación de medias de Tukey. Finalmente, se determinaron las diferencias entre tratamientos; para ello se consideró el efecto conjunto de las variables de germinación y de crecimiento (supervivencia, crecimiento y relación PSA/PSR); por separado, se efectuaron dos análisis de componentes principales y se obtuvo la comparación de medias del componente principal uno (CP1). Todos los análisis se llevaron a cabo con el programa de análisis estadístico SAS V. 9.3.1 (http://support.sas.com/software/93/).
Resultados
Efecto de la ultracongelación sobre la germinación
El congelamiento de las semillas en N2L redujo el porcentaje de germinación final (CG) entre 15 y 60 % respecto al control sin congelar (TP), dependiendo del tratamiento. Los mejores resultados para esta etapa se obtuvieron para las semillas que se congelaron sin encapsular (desnudas), sin deshidratar (T0) o deshidratadas (T1), las cuales alcanzaron valores similares entre sí y respecto al control para la germinación final (CG), vigor germinativo (VG) y energía germinativa (EG) (Figura 1, Cuadro 2). Por su parte, la encapsulación de semillas (T2 y T3) provocó la disminución significativa de todos los parámetros germinativos evaluados (p < 0.0001).
Cada punto representa el porcentaje (%) promedio de semillas germinadas de cinco repeticiones y las barras verticales representan el error estándar.
Figura 1 Curva de germinación de semillas de Cedrela odorata L. sometidas a distintos pretratamientos y congelación en nitrógeno líquido.
Cuadro 2 Parámetros germinativos. Se muestran valores promedios y comparación de medias de los diez tratamientos de crioconservación de semillas de Cedrela odorata L.
| Tratamiento | Capacidad germinativa (CG) (%) |
Valor germinativo (VG) |
Energía germinativa (EG) | Componente Principal uno | Emergencia de plántulas (%) |
|---|---|---|---|---|---|
| TP | 92.00 a | 200.59 a | 4.00 a | 2.527 a | 76.84 a |
| T0 | 74.00 ab | 67.42 a | 5.00 ab | 1.683 ab | 38.86 b |
| T1 | 75.00 ab | 62.12 a | 6.40 bc | 1.400 b | 34.93 b |
| T3 | 34.00 de | 7.45 bcd | 8.00 c | -0.881 cd | 30.00 b |
| T4 | 44.00 cd | 10.56 bc | 8.40 d | -0.589 cd | 33.33 b |
| T7 | 47.00 cd | 11.54 b | 9.20 d | -0.443 cd | 60.56 ab |
| T5 | 55.00 bc | 15.50 b | 9.80 de | -0.390 cd | 46.00 ab |
| T8 | 26.00 e | 3.17 d | 11.80 e | -2.060 e | 42.87 b |
| T2 | 29.00 e | 12.19 bc | 4.60 a | -0.134 c | 50.03 ab |
| T6 | 27.00 e | 6.01 cd | 7.80 c | -1.113 de | 33.33 b |
Valores con diferente letra en la columna son estadísticamente diferentes Tukey (p ≤ 0.05).
La adición de los agentes osmoprotectores LS, PVS2 y PVS3 al material encapsulado/deshidratado, solos (T4, T5 y T6) o en combinación (T7 y T8) no revirtió de manera significativa el efecto perjudicial de la encapsulación; únicamente, el tratamiento con solo PVS2 (T5) aumentó significativamente la CG; aunque el inicio de la germinación fue tardío, lo que provocó que los valores de EG y VG se mantuvieran bajos. En general los valores más bajos para todos los parámetros se obtuvieron cuando se incorporó PVS3 (T6 y T8). Una característica importante en esta etapa fue que el congelamiento, en cualquiera de los tratamientos, incrementó, notoriamente, la varianza de la capacidad germinativa (TP = 15.8, resto de los tratamientos = 76.5 - 309.2).
En el análisis de componentes principales, el componente principal uno (CP1) de los parámetros germinativos explicó 76.82 % de la varianza. La CG y VG contribuyeron con valores similares (0.608 y 0.655, respectivamente) para explicar la variabilidad; mientras que, la EG tuvo menor contribución (-0.449). El CP1 de los parámetros germinativos presentó diferencias estadísticas (p < 0.0001) entre los tratamientos, con valores de -2.03 (T8) a 3.56 (TP). El CP1 mostró tres grupos de tratamientos: el primer grupo, lo conformaron los tratamientos T0, T1 y el tratamiento control (TP); el segundo grupo, lo integraron T2, T3, T4, T5 y T7; mientras que T6 y T8 formaron el tercer grupo (Cuadro 2).
Efecto de la ultracongelación y el pretratamiento de semillas sobre la emergencia de las plántulas
La capacidad de las semillas germinadas para formar plántulas completas susceptibles de ser trasplantadas fue estadísticamente diferente entre los tratamientos de crioconservación (p < 0.049). En contraste a lo observado durante la etapa de germinación sensu stricto, el congelamiento de semillas sin encapsular (T0 y T1) afectó negativamente el desarrollo ulterior, ya que se redujo de manera significativa el número de plántulas emergidas. La encapsulación permitió una recuperación parcial de la respuesta cuando se usó en combinación con la deshidratación (T2), o si se aplicó el agente osmoprotector PVS2, solo (T7) o en combinación con LS (T5); con ello se lograron resultados estadísticamente similares al control sin congelar (TP) (Cuadro 2).
Supervivencia, crecimiento y biomasa de plántulas en invernadero
La supervivencia de las plántulas después de 16 semanas de crecimiento en invernadero, así como la relación peso seco aéreo/peso seco radicular (PSA/PSR) y todas las variables de crecimiento registraron diferencias estadísticas (p < 0.05) entre los tratamientos de crioconservación, a excepción del diámetro basal (cuello de raíz) (p = 0.2094) (Cuadro 3).
Cuadro 3 Supervivencia y variables de crecimiento de plántulas de semillas bajo tratamientos de crioconservación de Cedrela odorata L.
| Tratamiento | Supervivencia (%) |
Altura del hipocótilo (mm) |
Diámetro basal (mm) |
Altura total (mm) |
Diámetro de copa (mm) |
Longitud de raíz (mm) |
Relación PSA/PSR |
Componente principal 1 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TP | 73.33 b | 36.31 a | 3.80 a | 113.81 abc | 169.29 a | 11.32 a | 3.83 c | 1.139 a |
| T0 | 46.67 b | 38.14 a | 5.08 a | 103.49 abc | 156.22 a | 8.47 bc | 2.84 ab | 0.768 ab |
| T1 | 66.67 ab | 39.79 a | 4.94 a | 116.04 a | 139.64 abcd | 10.11 ab | 4.25 c | 0.714 ab |
| T3 | 80.00 ab | 28.99 b | 3.67 a | 85.83 c | 113.65 d | 6.79 c | 3.06 abc | -0.987 c |
| T4 | 86.67 ab | 28.54 b | 4.05 a | 112.50 a | 132.85 abcd | 8.42 bc | 2.24 a | 0.008 abc |
| T7 | 100.00 a | 24.53 b | 3.63 a | 91.52 bc | 120.27 bcd | 7.39 c | 3.40 bc | -1.060 c |
| T5 | 100.00 a | 27.55 b | 4.83 a | 99.93 abc | 133.80 abcd | 8.06 bc | 3.71 c | -0.208 abc |
| T8 | 91.67 ab | 27.00 b | 3.56 a | 85.20 c | 116.37 cd | 8.42 bc | 3.56 bc | -0.853 bc |
| T2 | 80.00 ab | 29.34 b | 3.96 a | 111.78 ab | 150.54 abc | 9.75 ab | 3.96 bc | 0.406 abc |
| T6 | 72.73 ab | 28.51 b | 4.48 a | 126.69 a | 154.21 ab | 9.30 bc | 5.04 c | 0.739 ab |
Valores promedios y comparación de medias (letras distintas en la misma columna indican diferencias significativas, p menor o igual a 0.05).
Las plántulas procedentes de semillas sin encapsular (T0 y T1) tuvieron una supervivencia similar a las semillas sin congelar (TP), así como para prácticamente todas las variables de crecimiento, excepto la longitud de raíz y en la relación PSA/PSR en las cuales las plántulas de semillas sin deshidratar (T0) presentaron los valores significativamente más bajos; lo anterior indica un efecto positivo de la deshidratación de semillas en esta etapa, y en particular sobre la calidad de la raíz, que pudo impactar en la supervivencia. Al igual que en la etapa de establecimiento, la encapsulación, en ausencia (T2 y T3) o en presencia (T4 a T8) de agentes osmoprotectantes, promovió la supervivencia, particularmente, en los tratamientos que incluyen PVS2 (T5 y T7), los cuales alcanzaron 100 % y superaron incluso a las semillas sin congelar (TP). No obstante, la longitud de hipocótilo de las plántulas de semillas encapsuladas fue significativamente menor a lo obtenido para semillas sin encapsular.
El CP1 de la supervivencia, variables de crecimiento y relación PSA/PSR explicó 41.82 % de la varianza. El diámetro basal, longitud de raíz, altura total y diámetro de copa tuvieron mayor contribución a la varianza total (0.4103 a 0.5267), seguido de altura de hipocótilo (0.2830); en cambio, la supervivencia y la relación PSA/PSR registraron menor contribución a la varianza total (0.007 y 0.0374). El CP1 presentó diferencias estadísticas entre los tratamientos (p = 0.0111), con valores de -1.060 (T7) a 1.139 (TP). En general, el CP1 determinó tres grupos de tratamientos, el primero lo conformaron tratamientos (TP, T0, T1, T6) con valores altos, el segundo con intermedios (T2, T4, T5) y el tercero (T3, T7, T8) con registros bajos (Cuadro 3).
Discusión
La implementación de la crioconservación de semillas de C. odorata ofrece una alternativa para su manejo a largo plazo en bancos de germoplasma. Asociar la ultracongelación con pretratamientos osmoprotectores representa una estrategia ampliamente utilizada para mantener la viabilidad de las semillas durante el congelamiento/descongelamiento. Sin embargo, el impacto de estos manejos, en su conjunto, sobre el desarrollo de la futura planta debe ser explorada en sus distintas etapas: desde la germinación, el establecimiento hasta su posterior crecimiento a fin de valorar su factibilidad como estrategia de conservación.
Bajo las condiciones propuestas en los ensayos que se documentan, se determinó que el efecto de los diferentes pretratamientos varió en las distintas etapas de desarrollo. Se evidenció que entre 20 y 70 % del germoplasma se pierde durante la germinación sensu stricto y las etapas tempranas de la emergencia de la plántula, en función del pretratamiento; por lo que representan las etapas más sensibles al congelamiento. En particular, se observó que la mejor respuesta germinativa se obtuvo en los tratamientos de deshidratación y congelamiento de semillas desnudas, con o sin desecar (T0 y T1), respecto a las semillas encapsuladas/deshidratadas, sin (T2 y T3) o con soluciones (T4 a T8) osmoprotectoras. Se esperaba que incorporar, previo al congelamiento, un paso de encapsulación/deshidratación y vitrificación con agentes osmoprotectores permitiera mantener la capacidad germinativa y la viabilidad general de las semillas. Sin embargo, no fue así y esas manipulaciones tuvieron un impacto nulo (deshidratación) o incluso perjudicial (encapsulación/deshidratación/vitrificación), ya que disminuyó tanto el porcentaje final, como la velocidad y energía de germinación. Estas estrategias son ampliamente utilizadas, porque favorecen el control hídrico de las células al limitar la formación de cristales de hielo que pueden dañar las membranas durante el congelamiento y descongelamiento (Gantait et al., 2017).
Por ejemplo, el glicerol se comporta como un anticongelante que reemplaza al agua intracelular, por lo que es muy útil como crioprotector; no obstante, es altamente tóxico; por ello, su uso debe ajustarse cuidadosamente (Kim et al., 2009). Es posible que las semillas de C. odorata sean sensibles a la toxicidad química del glicerol, razón por la cual su empleo resultó contraproducente. Aunado a lo anterior, las formulaciones de PVS2 y PVS3, aunque son muy recomendadas (Sakai et al., 1990; Nishizawa et al., 1993), tienen altas concentraciones de sacarosa, en especial PVS3 (tratamientos T6 y T8), lo que puede generar un choque osmótico.
Esto refleja las limitaciones de los tratamientos probados, que deben ser atendidas a fin de lograr utilizar la ultracongelación como una herramienta para la conservación a largo plazo de las semillas de C. odorata. No obstante, el que se mantuviera la respuesta germinativa sugiere que, a pesar de su citada sensibilidad al frío, es posible adaptar una estrategia de crioconservación para sus semillas, lo cual contrasta con lo observado para las semillas de otras especies arbóreas tropicales como Pithecellobium saman (Jacq.) Benth. y Gliridicidia sepium (Jacq.) Kunth ex Walp (Abdelnour et al., 2007).
Un aspecto por considerar es que la viabilidad de las semillas y el desarrollo posterior de la plántula posiblemente se afectaron por el descongelamiento a temperatura ambiente utilizado en el presente estudio, ya que trabajos con el mismo taxón (García y Abdelnour, 2013) y para C. fissilis (Da Costa et al., 2003) indicaron que semillas almacenadas directamente en N2L mantienen 100 % de su capacidad germinativa, cuando el descongelamiento ocurre a 40 ºC. Si bien el descongelamiento a temperatura ambiente es ampliamente utilizado, la incubación corta en calor puede ser favorable para algunas especies, sobre todo de aquellas con alto contenido lipídico, ya que al parecer promueve el descongelamiento de los triacilgliceroles antes de que interaccionen con el agua durante la imbibición, lo cual limita el daño estructural intracelular (Volk et al., 2006).
A diferencia de lo observado durante la germinación sensu stricto, en el establecimiento inicial de la plántula, así como en su desarrollo ulterior, se observó un efecto positivo en las plantas originadas de semillas tratadas por encapsulación/deshidratación, en particular con el uso de PVS2 como osmoprotector (T5 y T7). Ello contrasta con las plantas cuya semilla no tuvo tratamiento (T0 y T1), o fue encapsulada sin osmoprotectores (T2 y T3), o en semillas tratadas con PVS3, en las cuales menos de 50 % prosiguieron su desarrollo, lo que indica que los componentes como el etilen-glicol o el DMSO presentes en PVS2 pudiesen ejercer un efecto protector (Kim et al., 2009); y por tanto, deben optimizarse para la especie.
Finalmente, el efecto negativo del congelamiento con N2L disminuyó con el progreso del desarrollo de la plántula, lo cual probablemente indique una gradual recuperación del estrés provocado, como se ha observado en sorgo, frijol, maíz y tomate (Cejas et al., 2012; Arguedas et al., 2018; Acosta et al., 2020). En particular, el manejo de las semillas mediante algún pretratamiento (T2 a T8) favoreció la supervivencia de plántulas una vez trasplantadas en el vivero. Es posible que esto sea un reflejo de la presión de selección ejercida por los tratamientos en etapas previas, que resulta en que, únicamente, las semillas más vigorosas son capaces de producir plántulas con potencial para establecerse (ver por ejemplo T6). No obstante, plántulas de semillas encapsuladas/deshidratadas y tratadas con PVS2 (T5 y T7) alcanzaron valores superiores, incluso al control sin congelar (TP), lo que sugiere que la combinación de compuestos presentes en esta solución efectivamente provee de un beneficio que se expresa posterior a la germinación. Al analizar las variables de crecimiento de la parte aérea, los tratamientos con semillas desnudas sin deshidratar (T0) y deshidratadas (T1) fueron similares al control sin congelar (TP), lo que contrasta con los tratamientos con PVS2 (T5 y T7) que presentaron la máxima sobrevivencia, aunque un lento crecimiento. Si bien, la altura se relaciona con la capacidad fotosintética de las plántulas y superficie de transpiración, así como mayor posibilidad de competir por recursos, se requiere de un sistema radicular adecuado para soportar el crecimiento (Rodríguez, 2008; Prieto y Sáenz, 2011).
El desarrollo de la raíz se afectó en todos los tratamientos de congelación, más que la parte aérea, e incidió sobre los altos valores de la relación PSA/PSR observados, cuyo valor óptimo se espera dentro del intervalo 1.5 y 2.5 (Rodríguez, 2008). El menor tamaño aéreo observado en T5 y T7 generó una relación PSA/PSR más equilibrada, lo cual beneficiaría su crecimiento en sitios restrictivos, debido a que se ha demostrado que plantas con menor medida en altura y diámetro mantienen un mejor estado hídrico, con un consumo moderado de agua en situaciones de deficiencia hídrica (Leiva y Fernández, 1998).
Dados los resultados de este trabajo, un protocolo de ultracongelación para semillas de cedro rojo requerirá explorar a mayor profundidad alternativas de descongelamiento, condiciones de germinación, así como la incorporación de PVS2 a fin de que la supervivencia y vigor de las distintas etapas de desarrollo se potencien.
Conclusiones
Las semillas de C. odorata sometidas al congelamiento rápido tienen el potencial de sobrevivir, germinar y producir plántulas vigorosas para su trasplante en vivero. Las fases críticas para el éxito de un protocolo de crioconservación son la germinación sensu stricto y la emergencia temprana de la plántula. La evaluación de distintos pretratamientos de encapsulación, deshidratación, así como el uso de osmoprotectores evidenció que congelar semillas directamente, sin la aplicación de ningún pretratamiento es el protocolo más adecuado para mantener la capacidad germinativa, aunque es necesario optimizar las condiciones de descongelamiento para obtener un mejor rendimiento. El uso de la solución osmoprotectora PVS2 tiene un efecto benéfico en la emergencia temprana y supervivencia de las plántulas en vivero. Esto sugiere una ruta a seguir para optimizar un protocolo que contemple combinar dichos factores, y que provea de una alternativa viable para la conservación a largo plazo de semillas de C. odorata.
