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Introducción
Brosimum alicastrum Sw. (ramón) es un árbol de la familia Moraceae, con amplia distribución en Mesoamérica, de donde se considera endémico, que crece de manera silvestre en selvas perennifolias y caducifolias (Vergara et al., 2014). La especie produce frutos de noviembre a febrero, y de julio a septiembre, los cuales son bayas de 2 a 2.5 cm de diámetro, globosas con pericarpio carnoso, y coloración verde cuando son inmaduras y de verde-amarillento a anaranjado-rojizo al madurar; contienen una semilla de 1.5 a 2 cm de diámetro, cubierta por una testa papirácea amarillenta, con dos cotiledones montados uno sobre el otro; son semillas recalcitrantes con porcentajes de germinación inferiores a 50 % (Morales y Herrera, 2009).
En México, B. alicastrum se distribuye desde el sur de Tamaulipas hasta Quintana Roo, y de Sinaloa a Chiapas (Pennington y Sarukhán, 2005). Es muy apreciado en la Península de Yucatán donde sus semillas llegaron a ser consideradas el maíz de los mayas (Espinosa-Grande et al., 2023). En esta región, actualmente, la especie se distribuye de manera natural, y la recolección de semillas, frutos y forraje se destina a la alimentación animal (Rojas-Schroeder et al., 2017). El taxón también tiene potencial para la alimentación humana y en la industria. El fruto es rico en compuestos fenólicos con actividad antioxidante; su almidón tiene propiedades espesantes y gelificantes adecuadas para alimentos procesados y la industria farmacéutica (Moo-Huchin et al., 2019).
En 2019, por su capacidad para la restauración de suelos degradados, B. alicastrum se incluyó como una especie prioritaria en el Programa Federal Sembrando Vida de la Secretaría de Bienestar, cuyo objetivo es propagarla con fines de reforestación (Secretaría de Bienestar, 2020). Además, ante un contexto de cambio climático y seguridad alimentaria, se ha convertido en un recurso local de amplio uso para la alimentación animal y humana (Ramírez-Sánchez et al., 2017). En virtud de ello, la demanda por ejemplares (planta, semilla y fruto) de B. alicastrum se ha incrementado, y con ello la necesidad de generar investigación respecto a su propagación (Santillán-Fernández et al., 2021a).
En la literatura existen investigaciones para B. alicastrum en aspectos de botánica y ecología (Espinosa-Grande et al., 2023), propiedades nutricionales en la alimentación animal y humana (Rojas-Schroeder et al., 2017; Subiria-Cueto et al., 2019) y recientemente, por su alto potencial económico, se han incorporado temas referentes a plantaciones forestales (Hernández-González et al., 2015). Sin embargo, hay poco conocimiento sobre las condiciones de almacenamiento y sus efectos sobre la viabilidad (capacidad para germinar) de sus semillas, debido al incipiente manejo forestal de la especie (Mendoza-Arroyo et al., 2020).
En la propagación sexual de las especies forestales, un problema recurrente del manejo en vivero es la determinación del tiempo óptimo de almacenamiento sin que se afecte la viabilidad de las semillas (Mejenes-López et al., 2019). Durante el periodo de almacenamiento, factores como la humedad, temperatura, luz y cantidad de oxígeno, afectan el deterioro de la semilla y condicionan, directamente, su viabilidad (Valverde-Rodríguez et al., 2019). En las semillas que no toleran la deshidratación, denominadas recalcitrantes, el almacenaje se complica; estas, principalmente corresponden a taxa tropicales, pueden almacenarse por largos periodos si se les deshidrata ligeramente y tienen oxígeno disponible (De Vitis et al., 2020). Valverde-Rodríguez et al. (2019) determinaron que, en el almacenamiento, la temperatura es el factor en el cual se puede incidir más rápido para prolongar la viabilidad de semillas recalcitrantes.
Para determinar la viabilidad de las semillas de manera rápida, la prueba de tetrazolio es la más apropiada por la simplicidad de su aplicación y la confiabilidad de sus resultados (Salazar et al., 2020). Se ha utilizado con éxito en especies forestales como Pinus caribaea Morelet var. caribaea Barret y Golfari (Dorta, 2020), Jatropha mollissima (Pohl) Baill. (Siqueira et al., 2020); Coffea arabica L. (Calla et al., 2019), Guaiacum sanctum L. (Flores et al., 2019), Cedrela odorata L. y Cariniana pyriformis Miers (Espitia-Camacho et al., 2017).
En este contexto, los objetivos de la presente investigación fueron caracterizar la morfometría de semillas de poblaciones silvestres de B. alicastrum en Campeche, y determinar el efecto de la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad y germinación de las semillas bajo condiciones controladas mediante la prueba de tetrazolio, con la finalidad de determinar la temperatura y el tiempo máximo de almacenamiento que garanticen altos porcentajes de germinación. La hipótesis planteada es que existe una variación natural en la morfometría de las semillas y que la temperatura de almacenamiento es un factor que impacta directamente sobre la viabilidad de las semillas.
Materiales y Métodos
Recolecta de frutos
La primera semana de septiembre de 2019 se recolectaron frutos de B. alicastrum en cuatro localidades del norte de Campeche (Figura 1). Las procedencias de recolecta se caracterizan por una cobertura de selva media subperenifolia y selva alta perennifolia, con suelos arcillosos, precipitaciones de 600 a 4 000 mm, con épocas de estiaje de tres a siete meses, temperatura media anual de 18 a 27 ºC y altitudes de 20 a 1 000 m (Inegi, 2021). Esta región ha sido descrita previamente por Santillán-Fernández et al. (2021b) como una región con alta distribución natural de B. alicastrum, homogénea en sus parámetros edafoclimáticos.
Figura 1 Ubicación espacial de las procedencias de recolecta de frutos de Brosimum alicastrum Sw. en el estado de Campeche.
La recolecta de frutos en X-Mabén y Hopelchén se realizó en zonas perturbadas por actividades antrópicas, a diferencia de Sahcabchén y Calakmul cuya recolecta fue en áreas menos perturbadas e incluso en la reserva de la biosfera, para el caso de Calakmul. La recolecta de los frutos se hizo con base en la metodología descrita por Vallejos et al. (2010); se seleccionaron 10 árboles por procedencia con las mejores características fenotípicas (dasométricas: mayor altura, mayor diametro a la altura del pecho y fuste recto), con una distancia mínima entre árboles seleccionados de 100 m; de cada individuo se obtuvo un promedio de 50 frutos, los cuales se almacenaron en bolsas esterilizadas de plástico para su traslado a las instalaciones del Colegio de Postgraduados, campus Campeche (Champotón, Campeche, México). El fruto se despulpó dejando al descubierto la semilla, que se lavó con agua para retirar los residuos del pericarpio.
Morfometría de las semillas de B. alicastrum
Para el análisis morfométrico de las semillas, se eliminaron aquellas que estuvieran rotas, vanas, o con síntomas de daño por plagas y enfermedades. Se seleccionaron, aleatoriamente, cuatro muestras de 30 semillas por procedencia (480 semillas en total). Las variables cuantificadas fueron: largo (cm), ancho (cm) y la relación largo/ancho, medidas con ayuda de un vernier (Mitutoyo 530-312CALTM); peso (g), calculado mediante una balanza analítica (Wellish TM); volumen (cm3) y densidad (g cm-3), con el método de desplazamiento de agua (Rashidi et al., 2007), que consiste en colocar cada semilla dentro de una probeta de vidrio (Cylinder-250mL-2PK-GlassTM) con un volumen conocido de agua (100 mL) y se registra el volumen desplazado.
Las diferencias estadísticas entre las variables morfométricas por lugar de procedencia, se determinaron con el software R (Venables y Smith, 2023) mediante una prueba de medias por Tukey, con una confiabilidad de 95 % (α=0.05).
Análisis de viabilidad de las semillas
La viabilidad de las semillas se determinó con la técnica de cloruro de tetrazolio, la cual se utiliza para diferenciar tejidos metabólicamente activos de los inactivos (Berridge, 2005). Para ello, se empleó un diseño experimental completamente al azar, con cuatro réplicas de 30 semillas para cada sitio de recolecta (480 semillas). Debido a que no se encontraron trabajos previos para B. alicastrum en los que se analice la viabilidad de sus semillas con tetrazolio, la preparación de la solución y la evaluación de los patrones de tinción se hizo considerando lo que se ha citado para especies similares.
Se utilizó una solución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (CTT) (Sigma T8877-10G) al 1 % en agua tridestilada estéril (Espitia-Camacho et al., 2017). Las semillas se cortaron siguiendo el eje ecuatorial y se colocaron en 20 mL de solución de CTT en una caja Petri e incubadas (Labnet ® modelo 222DS) en oscuridad a 28 °C durante 4 h. El tiempo de incubación fue previamente determinado a partir de una cinética de tinción de 24 h con intervalos de muestreo de 4 h.
De acuerdo a la metodología descrita por Rodríguez et al. (2008) y Orantes-García et al. (2013), cuando las células vivas del embrión de la semilla respiran activamente (tienen mayor probabilidad de germinación), la prueba de CTT las tiñe de color rojo, y en el caso de las células muertas conservan el color original del embrión. Para este análisis se consideraron tres categorías, conforme el sistema de clasificación de Pérez-Mendoza (2018): semillas totalmente teñidas (embriones viables y vigorosos), semillas parcialmente teñidas (embriones viables con medio vigor) y semillas no teñidas (embriones no viables); en todos los casos se contabilizaron y se expresaron en porcentaje por replica y lugar de procedencia. Las diferencias estadísticas de la proporción de semillas que presentó una categoría de tinción por procedencia se determinaron con el software R (Venables y Smith, 2023) mediante una prueba de medias por Tukey con una confiabilidad de 95 % (α=0.05).
Efecto del tiempo y la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de las semillas
Para analizar el efecto del tiempo y la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de las semillas de B. alicastrum, se estableció un diseño experimental completamente al azar con 24 réplicas de cinco semillas para cada temperatura de almacenamiento. Los gradientes de temperatura fueron definidos en función de estudios preliminares para árboles tropicales como B. alicastrum; al respecto, la temperatura de 4 °C es una de las más evaluadas en estudios sobre el efecto de la temperatura en almacenamiento, mientras que la de 28 °C se considera una temperatura ambiente dentro del intervalo de 23 a 28 °C (Campbell-Martínez et al., 2022; Park et al., 2022). Para este experimento, se seleccionaron las semillas del lugar de procedencia que obtuvo los porcentajes más bajos en la prueba de CTT, con la finalidad de estudiar el efecto en los peores escenarios.
Las semillas se almacenaron a una temperatura de 4 °C en un refrigerador (Samsung side by side ®) y 28 °C (cuarto de cultivo) por un periodo de 92 días. Cada 15 días se seleccionaron de manera aleatoria y sin reemplazo cuatro réplicas por gradiente de temperatura, a las que se les aplicó la prueba de CTT para determinar el porcentaje de semillas totalmente teñidas, semillas parcialmente teñidas y semillas no teñidas. Por el número de réplicas (24) y periodo de análisis (15 días), la prueba de CTT se efectuó seis veces. Además, se efectuó una prueba de germinación a 80 semillas (de la procedencia que tuvo los porcentajes más bajos en la prueba de CTT) almacenadas durante 30 días a 4 °C y 28 °C, se hicieron cuatro réplicas de 10 semillas para cada gradiente de temperatura, en cada una se obtuvo el porcentaje de germinación. Las diferencias estadísticas de la proporción de semillas que presentó una categoría de tinción por periodo de análisis, y el porcentaje de germinación por gradiente de temperatura se determinaron en el software R (Venables y Smith, 2023) mediante una prueba de medias por Tukey con una confiabilidad de 95 % (α=0.05).
Resultados y Discusión
Morfometría de las semillas de B. alicastrum
Un análisis exploratorio de las semillas recolectadas mostró que tienen una forma esférica o aplanada, cubiertas de una testa papirácea de color café-blanquecino que al secarse se desprende sola, con una semilla de dos cotiledones asimétricos de coloración verdosa (Brechú-Franco et al., 2021) (Figura 2). Al analizar la morfometría de las semillas de las cuatro procedencias, los promedios más altos para el largo (cm) y ancho (cm) correspondieron al material de Hopelchén y los más bajos a Calakmul (Cuadro 1). Sin embargo, las semillas de Calakmul presentaron los mejores promedios en volumen (cm3) y peso (g).
A) Testa exterior de color café-gris que cubre a la semilla, B) Semilla sin testa mostrando el endocarpio, cotiledones y radícula del embrión, y C) Semilla con germinación inducida por alta humedad relativa.
Figura 2 Morfología de las semillas de Brosimum alicastrum Sw. Se ilustran semillas con diferentes grados del desarrollo de la radícula.
Cuadro 1 Diferencias estadísticas entre las variables morfométricas de semillas de Brosimum alicastrum Sw. por procedencia de recolecta en Campeche.
| Procedencia de recolecta | Variables morfométricas | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Largo
(cm) |
Ancho
(cm) |
Largo/Ancho (cm) |
Volumen
(cm3) |
Peso
(g) |
Densidad
(g cm-3) |
|
| Sahcabchén | 1.65 B | 1.64 B | 1.01 B | 2.27 B | 2.70 B | 1.32 A |
| X-Mabén | 1.61 BC | 1.63 B | 0.99 B | 2.08 B | 1.84 C | 1.02 B |
| Hopelchén | 1.92 A | 1.98 A | 0.97 B | 2.82 A | 3.32 A | 1.28 AB |
| Calakmul | 1.50 C | 1.38 C | 1.10 A | 3.03 A | 3.16 A | 1.15 AB |
Medias con la misma letra por columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, α=0.05).
La proporción Largo (L)/Ancho (A) es uno de los factores que definen la forma de una semilla: L/A<1 corresponde a una semilla aplanada, L/A=1 a una redonda, y L/A>1 a una oblonga (Bezerra et al., 2015). En el presente estudio, aunque los análisis estadísticos mostraron diferencias significativas entre las procedencias, todos los valores de L/A son cercanos a 1 (Cuadro 1), es decir, corresponden a semillas redondas, como previamente se ha citado (Brechú-Franco et al., 2021).
Las semillas de mayor volumen fueron las de Hopelchén y Calakmul, las cuales también registraron los pesos y densidades más altos (Cuadro 1). Estos datos morfométricos son ligeramente distintos a los registrados por Morales y Herrera (2009), quienes evaluaron semillas de árboles de ramón ubicados en Yucatán, con largos inferiores a 1.4 cm, anchos superiores a 1.8 cm, y pesos promedios de 2.8 g. La diferencia en tamaños de semillas puede deberse a factores genéticos y ambientales inherentes a las regiones donde se ubican las poblaciones de la especie (Vergara et al., 2014).
Prueba de tinción con cloruro de tetrazolio (CTT)
Se observaron embriones totalmente teñidos, y embriones parcialmente teñidos (Figura 3). De acuerdo con Mancipe-Murillo et al. (2018), la intensidad en la tinción indica mayor probabilidad de germinación. Sin embargo, se debe considerar que por la propiedad recalcitrante de las semillas de B. alicastrum son más propensas a perder viabilidad en los primeros 30 días (Magnitskiy y Plaza, 2007).
Tinción de semillas de Brosimum alicastrum Sw. mediante la prueba de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (CTT).
Figura 3
La prueba de medias por Tukey (α=0.05) evidenció que las procedencias de X-Mabén y Hopelchén tuvieron las semillas con los porcentajes de tinción completa más altos y se diferenciaron estadísticamente de las procedencias de Sahcabchén y Calakmul (Figura 4). La recolecta en las procedencias de X-Mabén y Hopelchén se realizó en zonas perturbadas por actividades antropogénicas. De acuerdo con Romero-Saritama (2018), la viabilidad de una semilla es afectada por diversos factores, entre ellos la edad del árbol y las condiciones fisiográficas del área de recolecta. Sin embargo, las especies forestales tienden a desarrollar mayor resiliencia en condiciones desfavorables, lo que ayuda a explicar por qué en sitios perturbados se registraron mayores porcentajes de viabilidad.
Efecto del tiempo y la temperatura de almacenamiento sobre la viabilidad de las semillas
En condiciones de temperatura ambiente (28 °C) alrededor de los 30 días, el porcentaje de semillas parcialmente teñidas fue superior al de semillas totalmente teñidas, por lo que se consideró que a partir de los 30 días la viabilidad de las semillas se reduce considerablemente. Para el caso de las almacenadas a 4 °C, el porcentaje de semillas parcialmente teñidas superó al valor de aquellas totalmente teñidas después de los 70 días (Figura 5).
Figura 5 Efecto de la temperatura y tiempo de almacenamiento sobre la viabilidad de semillas de ramón (Brosimum alicastrum Sw.).
A partir del día 77, las semillas almacenadas a diferentes temperaturas registraron los porcentajes de tinción más bajos. Por la propiedad recalcitrante de las semillas de ramón, se esperaba un incremento gradual en los porcentajes de aquellas parcialmente teñidas y de semillas no teñidas para ambas temperaturas de almacenamiento a lo largo del periodo de evaluación.
El efecto de la temperatura y tiempo de almacenamiento sobre la viabilidad de las semillas recalcitrantes lo han descrito Magnitskiy y Plaza (2007), quienes postularon que la temperatura es el factor que incide más rápido en el incremento de la viabilidad de las semillas recalcitrantes. Al respecto, Valverde-Rodríguez et al. (2019) señalaron que la longevidad en la viabilidad de semillas recalcitrantes es mayor con temperaturas de almacenamiento inferiores a 10 °C. Sin embargo, dado el nulo manejo forestal aplicado a B. alicastrum, existe poca información sobre el efecto de la temperatura en la viabilidad de sus semillas (Vergara et al., 2014).
Finalmente, la prueba de germinación de semillas almacenadas durante 30 días a 4 °C y 28 °C reveló 90 % de germinación en las almacenadas a 4 °C, y 60 % para las almacenadas a 28 °C (Cuadro 2). El sistema radicular de las semillas almacenadas a 4 °C fue mayor que el de las semillas a 28 °C (Figura 6). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Del Amo et al. (2002), quienes documentaron porcentajes de germinación superiores a 75 % para la especie. Aunque, a diferencia del estudio que aquí se describe (ambiente controlado), dicho trabajo se llevó a cabo en vivero, con semillas sin un periodo previo de almacenamiento.
Cuadro 2 Diferencias estadísticas del efecto de la temperatura a los 30 días de almacenamiento en la germinación de semillas de Brosimum alicastrum Sw.
| Temperatura | Germinadas (%) | No germinadas (%) |
|---|---|---|
| 4 °C | 90 A | 10 B |
| 28 °C | 60 B | 40 A |
Medias con la misma letra por columna no son estadísticamente diferentes (Tukey, α=0.05).
Conclusiones
En el norte de Campeche existe variabilidad morfométrica entre las semillas de Brosimum alicastrum, cuya viabilidad se puede prolongar hasta 70 días cuando la temperatura de almacenamiento es de 4 °C. A pesar de que la prueba de germinación estuvo condicionada con muestras de semillas con los valores más bajos de viabilidad, se logró un porcentaje de germinación de 90 % cuando la temperatura de almacenamiento fue de 4 °C, la cual corresponde, probablemente, a la temperatura óptima para mantener la viabilidad de las semillas de esta especie forestal y garantizar altos porcentajes de germinación en la etapa de vivero. Sin embargo, se debe considerar que en este estudio el factor humedad no se analizó. La información generada es valiosa para el manejo forestal de B. alicastrum dada la alta demanda de sus ejemplares, semillas y frutos, y a su escaso manejo silvícola.
