Materiales y métodos

Trabajo de campo. Las plantas fértiles de Goniopteris y Meniscium fueron recolectadas en las siguientes localidades: M. falcatum (A. Mendoza R. 1777, UAMIZ), Chiapas, municipio de Maravilla Tenejapa, a 201 m snm; G. mollis (B. Pérez García 1239, UAMIZ), Chiapas, municipio de Ocozocoautla, desviación a Ocuilapa, a 707 m snm; G. liebmannii (A. Mendoza R. 1725, UAMIZ), Oaxaca, municipio Valle Nacional, 6 km después de Valle Nacional rumbo a la Esperanza, a 200 m snm y G. minor (A. Mendoza R. 1812, UAMIZ), Tabasco, municipio Macuspana, en el Balneario Agua Blanca, a 227 m snm.

Trabajo de laboratorio. Las esporas obtenidas de hojas fértiles, fueron secadas de forma natural dentro de sobres de papel. El contenido de los sobres se tamizó con una malla metálica Mont Inox con poros de 0.074 mm de diámetro para eliminar residuos de esporangios y detritus. Las esporas obtenidas se guardaron en viales de vidrio a temperatura ambiente (25 °C) con el fin de reducir su metabolismo y por ende mantener su viabilidad y su integridad genética.

Siembra. Sin recibir ningún tratamiento de esterilización, las esporas se sembraron en cajas de Petri de 5 cm de diámetro con medio de cultivo Thompson (^{Klekowski 1969}). Éstas se espolvorearon sobre la superficie del medio con un pincel de unas cuantas cerdas; las cajas se almacenaron en bolsas de plástico transparente en condiciones de laboratorio y se colocaron en una cámara de crecimiento de plantas Lumistell MR Modelo ICP-19, con un fotoperíodo de 12 horas luz/obscuridad y una temperatura promedio de 20-25 °C. Se realizaron cinco réplicas para cada especie. Para determinar el fotoblastismo, una caja sembrada de cada especie se mantuvo en la oscuridad durante 100 días.

Fijación y procesamiento de muestras. Para determinar las características micromorfológicas de las esporas, éstas se montaron, sin ningún tratamiento previo, en porta-muestras de aluminio usando cinta conductiva de carbón de doble cara y posteriormente se metalizaron con oro en una ionizadora Denton Vacuum Desk II. Las observaciones y toma de imágenes se realizaron con un Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) Jeol JSM5310-LV.

Para describir con detalle las características morfológicas de las diferentes etapas de desarrollo del gametofito y el esporofito joven, se fijaron gametofitos en distintos estados de desarrollo en FAA con sacarosa al 0.8 %; posteriormente fueron deshidratadas en alcoholes graduales. Una vez deshidratados, se desecaron a punto crítico (Leica EM CPD030), se montaron en portamuestras de aluminio con cinta conductiva de carbón de doble cara y se metalizaron con oro, en el equipo previamente descrito. Las observaciones y toma de imágenes se llevaron a cabo usando un MEB (Jeol JSM5310-LV).

Resultados

Esporas. Las esporas de las cuatro especies incluidas en este estudio son homospóricas, monoletes, perinadas, con forma ecuatorial irregular a elipsoidal; no clorofílicas, desde pardo-amarillento a pardo-obscuro y son fotoblásticas positivas.

Las esporas más pequeñas corresponden a las de G. minor, miden en el eje polar (EP): 10(21)25 µm ± 3.5 µm, eje ecuatorial (EE): 17(30)35 µm ± 3.63 µm, son perinadas, con pliegues equinulados, con algunas equínulas y proyecciones en la superficie y entre los pliegues (Figura 1A); en M. falcatum, miden en EP: 24(28)34 µm ± 3.2 µm, EE: 34(40)49 µm ± 3.8 µm, son perinadas, irregulares a elipsoidales, con pliegues equinulados de 10-17 µm de ancho, con fimbrias y foliolos dispersos, alas micropapiladas-equinuladas, papilas dispersas (Figura 1B). G. liebmannii, miden en EP: 24(28)33 µm ± 2.36 µm, EE: 36(42)54 µm ± 3.57 µm (Figura 1D), son aladas, con pliegues, a veces reticulado con lumen mayor a 10 µm y con escasas equinas, estas dos últimas especies tienen tamaños intermedios. Mientras que las esporas más grandes corresponden a G. mollis, miden en EP: 27(31)40 µm ± 2.5 µm, EE: 39(43)50 µm ± 3.3 µm, son perinadas, con pliegues vermiculados, alados, con crestas y con equinas en la superficie entre los pliegues (Figura 1C; Tabla 1).

Inicios de germinación. Se siguió el criterio universal de germinación de esporas, la emergencia de la primera célula rizoidal y protálica o ambas. En las cuatro especies de este estudio se obtuvo una tasa de germinación del 90 % la cual inició entre los 10-17 días. Se observó una germinación tipo Vittaria (^{Nayar & Kaur 1971}), que se caracteriza por la formación del rizoide inicial en sentido perpendicular al eje polar de la espora gracias a la primera división mitótica, posteriormente la célula protálica inicial experimenta una segunda división mitótica perpendicular a la primera, dando origen al filamento inicial que se mantiene en el mismo plano que el rizoide pero con orientación en sentido opuesto (Figuras 1E-G; Tabla 2).

Después de 100 días, ninguna de las esporas de las cuatro especies sembradas en la oscuridad germinó, por lo que se consideran fotoblásticas positivas.

Fase filamentosa. Las continuas divisiones mitóticas transversales de la célula protálica inicial, resultan en la formación de un filamento uniseriado de 2-10 células, cilíndricas y con abundantes cloroplastos discoidales, en su base se desarrollan 1-2 rizoides hialinos de mayor longitud que el filamento, como lo observado en G. liebmannii (Figura 2A) y G. minor (Figura 2B).

Gametofito laminar. Las cuatro especies presentan un desarrollo protálico de tipo Aspidium (^{Nayar & Kaur 1969}, ¹⁹⁷¹), que se caracteriza por las secuencias de divisiones celulares variables, además de que en etapas tempranas de su desarrollo protálico (gametofitos jóvenes), desarrollan pelos capitados-glandulares, simples y unicelulares, marginales y superficiales. Las divisiones mitóticas que experimentan las células intercalares del filamento germinativo dan origen a la formación de la fase laminar del gametofito y entre los 20-35 días se observan formas vegetativas cordiformes y/o espatuladas.

En los gametofitos bidimensionales de M. falcatum (Figura 2E), G. mollis (Figura 2C), G. liebmannii (Figura 2D) y G. minor (Figura 2F) tienen formas cordiformes, con meristemo apical, alas isodiamétricas cortas o amplias, con pelos capitados-glandulares, simples, unicelulares, en el margen y ambas caras dorsal y ventral del gametofito (Figuras 2G, 3A-B).

Gametofito adulto. Entre los 60 y 90 días después de la germinación de las esporas, se observan gametofitos adultos con estructuras reproductoras, así como gametofitos inmaduros, pero estructuralmente bien conformados. Estos son de forma cordiforme a espatulada; con alas isodiamétricas bien desarrolladas y un cojinete poco conspicuo en donde se diferencian los gametangios. En M. falcatum (Figura 2G), G. liebmannii (Figura 3B) y G. minor, los gametofitos desarrollan pelos capitados glandulares, simples, unicelulares, tanto en el margen, como en la cara dorsal y ventral entre los arquegonios, mientras que en G. mollis (Figura 3A), los pelos son similares a las otras especies, pero se encuentran localizados entre los anteridios.

Anteridios. En los gametofitos protándricos, los anteridios se desarrollan entre los 50-70 días, en la parte media basal entremezclados con abundantes rizoides. La morfología y estructura de los anteridios es muy homogénea; son globosos, con una célula basal, una anular y una opercular, como se observa en G. liebmannii (Figura 3C) y G. minor (Figura 3D). El mecanismo de liberación de los anterozoides se lleva a cabo por desprendimiento de la célula opercular (Figura 3C).

Arquegonios. Los arquegonios presentan una morfología estandarizada, estos se desarrollan sobre el cojinete y cerca de la zona meristemática, sus cuellos están orientados hacia la región basal del gametofito, sugiriendo autofecundación. Los cuellos tienen de 4 a 10 células de largo, son cortos a largos, la boca está compuesta por las típicas cuatro células triangulares (Figura 3E-G).

A los 90 días de germinación se observan gametofitos bisexuales en los cuales las estructuras reproductivas corresponden a las típicas presentes en la mayoría de los helechos leptosporangiados.

Esporofitos jóvenes. El desarrollo del esporofito se observó entre los 110-125 días en G. mollis (Figura 4B), G. liebmannii (Figura 4C), G. minor (Figura 4A). Las primeras hojas embrionarias (1-3) son lobuladas con una pequeña muesca, y con venación dicotómica abierta (Figura 4A). Presentan dos tipos de pelos capitados-glandulares simples, unicelulares y pelos unicelulares, aciculares tanto en el pecíolo como en la lámina en su cara dorsal y ventral (Figura 4A-D).

Los estomas son hipostomáticos del tipo polocítico, caracterizados por la unión del estoma al lado distal (marginopolar) de la célula subsidiaria única, por lo tanto esta célula tiene forma de U o de herradura como en G. mollis (Figuras 4D, 4F), G. liebmannii (Figura 4E) y G. minor (Figura 4G), en estas especies las paredes anticlinales de la célula subsidiaria presenta los márgenes ligeramente rectos a ondulados. Por otro lado, las células epidérmicas tienen las paredes anticlinales onduladas. No observamos el desarrollo del esporofito en M. falcatum.

Los resultados tanto de las esporas como de las diversas fases de desarrollo de las especies en estudio se muestran resumidos en las Tablas 1 y 2.

Discusión

Existe una variación morfológica en las esporas de las Thelypteridaceae y este carácter puede ser útil para determinar el género y sus especies (^{Wood 1973}), como lo ejemplifica el estudio reciente de ^{Patel et al. (2019)} sobre morfología y evolución de la perina. Este último estudio demuestra que la macroestructura reticular y perforada es característica de Goniopteris y establece que la presencia de microestructuras es un carácter diagnóstico para Meniscium. La morfología de las esporas de las cuatro especies estudiadas, concuerda con las descripciones previamente señaladas para G. mollis por ^{Wood (1973)} y para M. falcatum por ^{Tryon & Tryon (1982)}.

^{Patel et al. (2019)} mencionan que la perina de las esporas del género Goniopteris se caracteriza por crestas alargadas, reticuladas y delgadas, las cuales podrían estar relacionadas con características ancestrales del género, mientras que el género Meniscium no presenta ninguna característica en común que lo distinga y para M. falcatum no observaron perforaciones. Nuestro estudio encontró que las esporas de M. falcatum presentan perforaciones (Figura 1B); por lo que consideramos que esta característica apoya la monofília del grupo M. longifolium y M. hostmanni (Klotzsch) R. S. Fernandes & Salino [= M. salzmanii, = M. arborescens] mencionado por ^{Patel et al. (2019)}. En las especies de la presente investigación, se observaron diferencias morfológicas en el tamaño de las esporas, tipo de reticulado, altura de los pliegues alados y el tamaño de las espinas de los márgenes de las alas. M. falcatum difiere por la presencia de perforaciones y el perisporio plegado, mientras Goniopteris presenta perisporio plegado a crestado, sin perforaciones.

El tiempo de germinación para G. liebmannii y G. minor fue de 10 días, para G. mollis 13 días y para M. falcatum 17 días, lo que concuerda con las observaciones de las Thelypteridaceaes estudiadas por ^{Huckaby & Raghavan (1981a)} para (T. acuminata (Houtt.) C. V. Morton [= Christella acuminata (Houtt.) H. Lév.], T. atrospinosa C.F. Reed, T. cruciata (Willd.) Tardieu, T. decursive-pinnata (H. C. Hall) Ching [= Phegopteris decursive-pinnata], T. dentata (Forssk.) E. P. St. John [= Christella dentata (Forssk.) Brownsey & Jermy], T. erubescens (Wall. ex Hook.) Ching, T. kunthii (Desv.) C. V. Morton, T. noveboracensis (L.) Nieuwl [= Parathelypteris noveboracensis], T. opulenta (Kaulf.) Fosberg [= Amblovenatum opulentum], T. palustris Schott, T. resinífera (Dev.) Proctor, T. rubrinervis K. Iwats, T. serra (Sw.) R. P. St. John y T. torresiana (Gaudich.) Alston) [= Macrothelypteris torresiana (Gaudich.) Ching.].

El patrón de germinación observado en las cuatro especies fue de tipo Vittaria, lo cual coincide con las descripciones para T. ciliata (Wall. ex. Benth) [= Cyclosorus ciliatus], T. biolleyi (Christ) Proctor [=Goniopteris biolleyi] realizadas por ^{Nayar & Kaur (1971)}, ^{Reyes-Jaramillo & Pérez-García, (1991)} para T. patens (Sw) Small [= Christella patens (Sw.) Holttum)] y T. puberula (Baker) C. V. Morton var. puberula [= Christella puberula (Baker) A. Löve & D. Löve] y ^{Pérez-García & Mendoza-Ruiz (2004)} para T. dissimulans (Maxon & C. Chr. ex C. Chr.) C. F. Reed [= Goniopteris dissimulans], T. piedrensis (C. Chr.) Morton [= Amauropelta piedrensis (C. Chr.) Salino & T.E. Almeida] T. reptans (J. F. Gmel) Morton var. reptans [= Goniopteris reptans], T. tetragona (Sw.) Small [= Goniopteris tetragona] y T. oviedoae C. Sánchez & Zavaro [= Amauropelta oviedoae (C. Sánchez & Zavaro) Salino & T.E. Almeida].

En las cuatro especies estudiadas, la fase filamentosa es corta de 1-8 células cilíndricas con numerosos cloroplastos discoidales y es muy similar a la ya citada para otras especies (^{Ramos-Giacosa et al. 2014}, ^{Pérez-García & Mendoza-Ruiz 2004}, ^{Muñiz-Díaz de León et al. 2008}). Se observó que el desarrollo protálico es de tipo Aspidium lo cual concuerda con lo señalado por ^{Nayar & Kaur (1969}, ¹⁹⁷¹⁾ donde describen el desarrollo de gametofitos para helechos homospóricos. Nuestros datos coinciden con los resultados de ^{Pérez-García & Mendoza-Ruiz (2004)} que trabajaron con T. dissimulans [= Goniopteris dissimulans], T. piedrensis [= Amauropelta piedrensis (C. Chr.) Salino & T.E. Almeida], T. reptans var. reptans [= Goniopteris reptans], T. tetragona [= Goniopteris tetragona] y T. oviedoae [= Amauropelta oviedoae (C. Sánchez & Zavaro) Salino & T.E. Almeida], y con los de ^{Muñiz-Díaz de León et al. (2008)} quienes trabajaron con siete especies de Thelypteridaceae del género Cyclosorus, en estos trabajos se menciona que el desarrollo protálico es de tipo Aspidium que se caracteriza porque en etapas tempranas del desarrollo protálico se produce la formación de pelos, sin embargo nuestros datos no coinciden con los de ^{Pérez-García et al. (1994)} para T. rhachiflexuosa [= Gonioperis rhachiflexuosa] que mencionan que corresponde al tipo Drynaria, que se caracteriza porque el establecimiento de la célula meristemática es muy retardado y los gametofitos generalmente en la etapa adulta desarrollan pelos marginales y superficiales escasos. Sería interesante estudiar otras especies del género para confirmar estas observaciones.

Se ha señalado que los gametofitos de los helechos thelypteridaceos se caracterizan por presentar en el margen y en ambas caras un solo tipo de pelos, los capitados-glandulares, simples, unicelulares que persisten hasta la madurez, mientras que en el pecíolo y la lámina del joven esporofito se presentan dos tipos de pelos capitados-glandulares, simples, unicelulares y pelos aciculares, citados por ^{Iwatsuki (1962)}, ^{Atkinson & Stokey (1964)}, ^{Reyes-Jaramillo & Pérez-García (1991)} y ^{Pérez-García & Mendoza-Ruiz (2004)}.

Una característica del género Goniopteris es la presencia de pelos estrellados en los esporofitos adultos, los cuales pueden o no estar presentes en los gametofitos (^{Smith 1981}, ^{Stolze 1981}, ^{Tryon & Tryon 1982}, ^{Mickel & Beitel 1988}, ^{Moran & Riba 1995}). Tanto en los estados de desarrollo de los gametofitos, así como en los esporofitos jóvenes de las especies en estudio, estos pelos estrellados no fueron observados, siendo G. mollis la única especie mexicana que carece por completo de estos tricomas en ambas fases (característica que comparte con G. macrostis (Hook.) Pic. Serm, G. semihastata (Kunze) Salino & T.E. Almeida, G. holodictya (K.U. Kramer) Salino & T.E. Almeida, y G. clypeata [^{Salino et al. 2015}]). Otros autores han reportado que G. minor presenta escasos pelos estrellados en el esporofito (^{Mickel & Smith 2004}). La ausencia de pelos estrellados en gametofitos y esporofitos jóvenes se ha reportado previamente en G. abbiattii (^{Ramos-Giacosa et al. 2014}).

^{Atkinson (1975)} menciona que los gametofitos en las Thelypteridaceae son espatulados a cordiformes con alas amplias y un meristemo apical, caracteres observados en este estudio y que son consistentes con lo señalado por ^{Atkinson & Stokey (1964}, ¹⁹⁷³⁾, ^{Atkinson (1971)}, ^{Nayar & Kaur (1971)}, ^{Reyes-Jaramillo & Pérez-García (1991)} y ^{Pérez-García & Mendoza-Ruiz (2004)}.

Los caracteres morfológicos observados de los anteridios en las cuatro especies son propios de los helechos leptosporangiados. Ellos se desarrollan sobre el cojinete en los gametofitos adultos. ^{Atkinson & Stokey (1964)} mencionan que los anteridios siempre aparecen antes que los arquegonios, es decir son protándricos, este hecho coincide con los resultados aquí presentados. Los anteridios observados tienen una célula opercular, una célula anular y una célula apical, lo cual concuerda con ^{Tigerschiöld (1990)} quien trabajó con 12 especies de Thelypteris de Sri Lanka en las cuales destaca T. confluens (Thunb.) Morton.

De acuerdo con los mecanismos de apertura de los anteridios y en consecuencia la liberación de los anterozoides, las cuatro especies comparten el mecanismo de liberación de los anterozoides por desprendimiento total de la célula opercular, coincidiendo con lo reportado para T. confluens (^{Tigerschiöld 1989a}).

Los arquegonios tienen la forma típica de los helechos leptosporangiados, éstos se desarrollan muy cerca del meristemo apical. El cuello es corto de 2 a 10 células concordando con las descripciones de ^{Atkinson (1975)} para cinco especies de Thelypteris. En las cuatro especies aquí estudiadas los cuellos de los arquegonios están conformados por cuatro hileras de células, marcadamente curveados y orientados hacia la parte basal de los gametofitos, debido a que los anteridios se desarrollan en la región media basal de los gametofitos, podría ocurrir autofecundación intragametofítica (^{Testo et al. 2015}, ^{Haufler et al. 2016}).

Los caracteres morfológicos y de desarrollo de los rizoides observados y descritos en este estudio son consistentes con las descripciones presentadas por ^{Atkinson & Stokey (1964)}, ^{Reyes-Jaramillo & Pérez-García (1991)}, en todos los casos, los rizoides se diferencian en la parte ventral del cojinete del gametofito, en las primeras etapas son hialinos y con escasos cloroplastos, con la madurez comienzan a tornarse pardos. Son de longitud variable, aunque generalmente son más largos que el cuerpo del gametofito.

La primera hoja del esporofito se desarrolla entre 100-120 días después de la germinación de la espora. ^{Iwatsuki (1962)} menciona que el pecíolo y lámina de los esporofitos de las Thelypteridaceae tienen pelos unicelulares aciculares y pelos capitados-glandulares, simples. Estos caracteres diagnósticos de tipo morfológico se observaron en esta investigación. Los estomas observados corresponden al tipo polocítico que ya han sido reportados en estudios previos (^{Van Cotthem 1970}, ^{Sen & De 1992}). Este tipo de estomas son de amplia distribución en algunas familias de helechos.

Las características morfológicas observadas durante el desarrollo del gametofito y esporofito y descritas en detalle en las cuatro especies, son típicas de la familia Thelypetridaceae. Estas características son esporas monoletes, perisporio prominente, germinación tipo Vittaria, desarrollo protálico tipo Aspidium, presencia de pelos capitados-glandulares, simples, unicelulares en el gametofito, gametofitos adultos cordiformes a espatulados, gametangios típicos de helechos leptosporangiados, liberación de los anterozoides por desprendimiento del opérculo y la presencia de pelos glandulares-capitados unicelulares y aciculares en los esporofitos jóvenes. Este estudio demuestra que con imágenes de buena calidad tomadas con el MEB, se aportan datos morfológicos que pueden ser útiles pare entender mejor los géneros reconocidos dentro de la familia Thelypteridaceae de acuerdo a las nuevas evidencias filogenéticas moleculares.