Materiales y métodos

Área de estudio, poblaciones y muestreo. Los ejemplares depositados en los herbarios IBUG, IEB, MEXU, ZEA (^{Thiers 2019}) y bases de datos digitales (GBIF; www.gbif.org, IBdata; www.ibdata.ib.unam.mx) fueron revisados para conocer la distribución de Tigridia durangensis. Los ejemplares sin coordenadas fueron georreferenciados siguiendo el flujo de trabajo propuesto por ^{Jin & Yang (2020)}. Tres poblaciones en la FVT (Michoacán) y siete en la SMOc (Durango; Tabla 1) fueron muestreadas. Cada población incluyó a 10 individuos. La regionalización utilizada fue la de ^{Morrone et al. (2017)}. Elaboramos ejemplares de herbario y preservamos hojas en sílica gel para su desecación y posterior extracción de ADN (^{Funk et al. 2017}).

Extracción, amplificación y secuenciación de ADN. La extracción, amplificación y secuenciación de ADN fueron llevadas a cabo en el Laboratorio Nacional de Identificación y Caracterización Vegetal (LaniVeg) de la Universidad de Guadalajara. La extracción de ADN fue realizada con el protocolo de ^{Doyle & Doyle (1987)}. Los espaciadores intergénicos ndhF-rpL32, rpL32-trnL y 3´trnV-ndhC de ADN de cloroplasto (^{Shaw et al. 2007}, ²⁰¹⁴) fueron amplificados mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La Tabla S1 muestra la secuencia de los cebadores para cada región. Los componentes para una reacción de 25 µL fueron: 1 µL de ADN (~100 ng/ µL), 2.5 µL Buffer 10x, 0.5 µL dNTP [10 mM], 0.5 µL BSA [2 %], 0.25 µL de cada cebador [10 mM], 1.5 µL de MgCl₂ [10 mM], 0.25 µL Invitrogen Taq DNA polimerasa recombinante [5 U/µL] y 18.25 µL de agua libre de nucleasas.

Los parámetros de amplificación para el espaciador rpL32-trnL y 3´trnV-ndhC fueron: 1) 80 °C por 5:00 min para una desnaturalización inicial, 2) 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 1 min, primer alineamiento a 50 °C, seguida de una rampa de 0.3 °C hasta 65 °C por 1 min y la extensión a 65 °C por 4 min, 3) una extensión final a 65 °C por 5 min. Las condiciones de los ciclos de PCR para el espaciador ndhF-rpL32 fueron: 1) 80 °C por 5 min para una desnaturalización inicial, 2) 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C por 1 min, un alineamiento a 45 °C por 1 min, una extensión de 65 °C por 4 min, 3) una extensión final a 65 °C por 5 min. Los productos PCR fueron verificados en geles de agarosa al 1 % antes de purificarse. Los volúmenes utilizados para la purificación de las muestras fueron: 5 µL producto de PCR y 1 µL ExoSAP-IT^TM (PCR Product Clean-up Reagent). Un ciclo de purificación fue ejecutado con las siguientes condiciones en el termociclador: 37 °C por 15 min y 80 °C por 15 min. Los productos purificados fueron preservados a 4 °C. El volumen final para la reacción de secuenciación fue de 4.5 µL. La mezcla contuvo 0.5 µL BigDye^TM Terminator v. 3.1 (Ready Reaction Mix), 1 µL BigDye Terminator v. 1.1 5x Sequencing Buffer, 1 µL de cebador (F/R) [10 mM], 1 µL de producto PCR purificado, 1 µL de agua libre de nucleasas. Por último, los productos de la reacción de secuenciación fueron purificados con Ilustra MicroSpin G-50 Columns.

Diversidad genética, estructura genética y estructura filogeográfica. La herramienta BLAST (^{Boratyn et al. 2013}) del NCBI (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) corroboró la identidad de las secuencias. La edición y el ensamble fueron realizados con el programa Sequencher v. 4.8 (www.genecodes.com). El algoritmo MUSCLE (^{Edgar 2004}), implementado en el programa PHYDE (^{Müller et al. 2020}), realizó un alineamiento automático inicial, seguido de un alineamiento manual. Los indels contiguos (ndhF: 277-285, 323-328; rpL32-trnL: 836-840) y las reversiones (rpL32-trnL: 288-290, 351-360) fueron consideradas como cinco mutaciones. La matriz concatenada incluyó las secuencias ndhF-rpl32 + rpL32-trnL + 3´trnV-ndhC. El fragmento rpL32 de la región ndhF-rpL32 fue excluido, debido a que la mayoría de las secuencias no tuvieron buena calidad.

El número de sitios polimórficos (S), el número de haplotipos totales (H), el número de haplotipos por población (h), la diversidad haplotípica (Hd) y la diversidad nucleotídica (π) fueron estimados con el programa de cómputo DnaSP v. 6 (^{Rozas et al. 2017}). La diferenciación genética dentro y entre poblaciones, así como entre provincias biogeográficas fue estimada con un análisis de varianza molecular (AMOVA) en Arlequin v. 3.5 (^{Excoffier & Lischer 2010}). Las diferencias genéticas entre poblaciones fueron evaluadas con dos criterios: 1) las poblaciones fueron consideradas un solo grupo (AMOVA no jerárquico) y 2) las poblaciones fueron separadas en FVT y SMOc (AMOVA jerárquico). Las distancias entre los haplotipos fueron estimadas con el criterio de diferencia de pares de base y 10,000 permutaciones. El programa SAMOVA (^{Dunpaloup et al. 2002}) identificó grupos geográficamente homogéneos. El número más probable de grupos (K) fue estimado con las 10 poblaciones y la diferencia de pares de bases fue utilizada como distancia molecular. Permut CpSRR v. 2.0 (^{Pons & Petit 1996}) calculó con 10,000 permutaciones el valor para los haplotipos no ordenados (h_S, h_T), los haplotipos ordenados (v_S, v_T) y los parámetros de diferenciación (G_ST, N_ST).

Relaciones genealógicas e hipótesis filogenéticas. POPART (^{Leigh & Bryant 2015}) infirió las relaciones genealógicas de Tigridia durangensis con el método de parsimonia estadística. Las relaciones de parentesco de los haplotipos fueron inferidas con la matriz concatenada. Tigridia estelae López-Ferr. & Espejo, T. flammea (Lindl.) Ravenna y Cobana guatemalensis (Standl.) Ravenna fueron el grupo externo (^{Munguía-Lino 2016}). jModelTest v. 2.1.10 estimó los modelos de evolución molecular. Los resultados del AICc (Akaike Information Criterion; ^{Posada 2008}) fueron utilizados para elegir el modelo evolutivo. Las hipótesis filogenéticas fueron evaluadas con Inferencia bayesiana (IB) y Máxima verosimilitud (MV). La herramienta MrBayes v. 3.2 (^{Ronquist et al. 2012}) implementada en el portal CIPRES Science Gateway v. 3 (www.phylo.org) realizó los análisis de IB. La corrida fue configurada con 10 × 10⁶ generaciones, cuatro cadenas de Markov y un muestreo cada 1,000 generaciones. El 25 % de los primeros árboles fue descartado. Los nodos con probabilidades posteriores (PP) ≥ 0.95 fueron considerados bien soportados. GARLI v. 0.96 (^{Zwickl 2006}) realizó el análisis de MV con 10 búsquedas y 500 réplicas bootstrap. El soporte para los clados fue determinado con la regla de consenso de mayoría. El 50 % de los árboles fueron retenidos después del quemado. Los nodos con un porcentaje de bootstrap (PB) ≥ 85 % fueron considerados con buen soporte.

Demografía histórica. La demografía histórica fue evaluada con tres estrategias. Primero, los índices D (^{Tajima 1989}) y F_S (^{Fu 1997}) fueron estimados para identificar desviaciones en un tamaño de población constante bajo el modelo de mutación neutral. Arlequin v. 3.5 (^{Excoffier & Lischer 2010}) estimó los índices con 10,000 permutaciones. Segundo, DnaSP v. 6 (^{Rozas et al. 2017}) realizó un análisis de distribución de diferencias pareadas (ADDP) con un modelo de población en expansión. El ajuste de las distribuciones esperadas y observadas fue evaluado con la suma de distancias cuadradas (SSD) y el índice de irregularidad de ^{Harpending (r; Harpending 1994}). Arlequin v. 3.5 (^{Excoffier & Lischer 2010}) estimó los parámetros de expansión demográfica con 10,000 réplicas bootstrap. Tercero, BEAST v. 1.10.4 (^{Suchard et al. 2018}) ejecutó el análisis de graficas de líneas de cielo bayesianas, para inferir cambios en el tamaño efectivo de la población (Ne) a través del tiempo. El análisis fue realizado con modelos de sustitución independientes para cada región, un reloj molecular relajado no correlacionado y un modelo coalescente.

No existe una tasa de sustitución de nucleótidos de cloroplasto para Tigridia. Sin embargo, ^{Wolfe et al. (1987)} estimaron estos valores en maíz y trigo (1.1 × 10^-9 y 1.6 ×10^-9 sustituciones/nucleótido/año), mismos que fueron empleados para estimar el Ne. Los análisis fueron configurados con 30 × 10⁶ y 20 × 10⁶ generaciones, respectivamente para cada tasa de sustitución y un muestreo cada 1,000 generaciones. TRACER v. 1.5 corroboró el tamaño efectivo de la muestra (ESS > 200) y reconstruyó el gráfico de líneas de cielo bayesianas. Todas las pruebas fueron realizadas a nivel de especie y grupos de poblaciones (FVT y SMOc).

Paleodistribución. Modelos de nicho ecológico (MNE) fueron construidos para estimar el efecto de las oscilaciones climáticas del Cuaternario sobre el área de distribución de Tigridia durangensis. Los MNE fueron construidos con las coordenadas geográficas de 52 registros (Tabla S2). Las 19 variables bioclimáticas de WorldClim-Global Climate Data (^{Fick & Hijmans 2017}) fueron obtenidas a una resolución de 2.5 arco-minutos. El análisis de componentes principales (ACP) identificó las variables correlacionadas (^{Cruz-Cárdenas et al. 2014}, ^{Flores-Tolentino et al. 2019}). Después y para reducir el sesgo por colinearidad, las dos variables con el valor de contribución más alto para cada componente fueron elegidas (^{Cruz-Cárdenas et al. 2014}, ^{Flores-Tolentino et al. 2019}). Seis variables fueron seleccionadas para construir los modelos (Tabla S3). MaxEnt v. 3.2 (^{Phillips et al. 2006}) construyó los MNE de T. durangensis con 10 réplicas y un modelo de validación cruzada. El área bajo la curva (AUC) > 0.9 fue utilizada para evaluar los modelos. El modelo con el AUC más alto fue elegido. ArcMap v. 10.0 (^{Esri 2010}) reclasificó los valores de idoneidad del modelo con base en el parámetro Maximum training sensitivity plus specificity.

El MNE fue proyectado a tres escenarios climáticos pasados, para identificar cambios en su distribución histórica. Estos fueron, Holoceno Medio (HM ~ 6 Ka), Último Máximo Glacial (UMG ~ 22 Ka) y Último Interglacial (UI ~ 120-140 Ka). Los modelos de circulación global empleados fueron HadCM3, MIROC-ESM y CCSM4 para el HM y el UMG. Mientras que, para el UI se utilizó MIROC-ESM (www.worldclim.com/paleo-climate1, www.paleoclim.org). La resolución de cada modelo fue 2.5 arco-minutos. Todas las variables fueron cortadas con el polígono de México en ArcMap v. 10.0 (^{Esri 2010}). Por último, calculamos, en km², el área de distribución estimada para la SMOc, la FVT y la suma de ambas en cada escenario y para cada modelo.

Resultados

Diversidad genética, estructura genética y estructura filogeográfica. El muestreo genético final incluyó secuencias de 55 individuos agrupados en 10 poblaciones. La matriz concatenada de ndhF + rpL32-trnL + 3´trnV-ndhC tuvo una longitud de 2,155 pb (Tabla S1). Los sitios polimórficos (S) y haplotipos totales (H) identificados fueron 32 y nueve, respectivamente. La Hd de Tigridia durangensis fue 0.82, mientras que la π fue 0.00554 (Tabla 1). En las poblaciones de la SMOc, Hd = 0.81 y π = 0.00063. En contraste, las tres poblaciones de la FVT tuvieron un haplotipo (H1) y Hd y π fueron igual a cero. Las poblaciones de la SMOc tuvieron ocho haplotipos (H2-H9). H1 tuvo la frecuencia más alta (16 individuos, 29.1 % del total), seguido de los haplotipos H3 (14 individuos, 25.5 % del total) y H5 (8 individuos, 14.5 % del total). H2 y H6 fueron observados en cuatro individuos, que representaron el 7.3 % del total. A su vez, H8-H9 estuvieron presentes en tres individuos o 5.5 % del total. Por último, un individuo tuvo el haplotipo H7 (1.7 %).

El AMOVA no jerárquico mostró valores significativos de estructura poblacional en Tigridia durangensis (Tabla 2). Las diferencias entre las poblaciones explicaron el 96.69 % de la variación genética. El 3.31 % de la variación fue explicada por las diferencias dentro de las poblaciones. Por su parte, el AMOVA jerárquico demostró que las diferencias entre los grupos fueron la principal fuente de variación (F_CT = 0.959, p < 0.01). La diferencia entre poblaciones dentro de los grupos (F_SC = 0.602, p < 0.01) explicó el 2.43 % de la variación. Los resultados de SAMOVA evidenciaron estructura genética y geográfica significativa para dos grupos de poblaciones (K = 2), con un valor F_CT= 0.959 (p < 0.05; Tabla 2).

El G_ST (0.746, se = 0.0986) señaló que Tigridia durangensis está subdividida y F_ST (0.966, p < 0.01) corroboró la estructura poblacional. La diversidad genética total (h_T = 0.870, se = 0.0639; v_T = 0.889, se = 0.2035) fue más alta que la diversidad promedio dentro de las poblaciones (h_S = 0.221, se = 0.0944; v_S = 0.024, se = 0.0106). Al final, los resultados de la prueba de permutación mostraron evidencia significativa de estructura filogeográfica en las poblaciones (N_ST = 0.973, se = 0.0162 > G_ST = 0.746, se = 0.0986, p < 0.05).

Relaciones genealógicas e hipótesis filogenéticas. La red de haplotipos mostró una relación entre nueve haplotipos distribuidos en la SMOc y la FVT (Figuras 2, 3A). H3 fue el más frecuente y estuvo relacionado con H2, H4-H9 por una mutación. Por el contrario, H1 tuvo una diferencia de 26 pasos mutacionales con H3. La topología generada por IB fue más robusta y se muestra en la figura 3B. Los haplotipos de Tigridia durangensis fueron agrupados en dos ramas (PP = 0.96, PB = 50; Figura 3B). En otras palabras, hubo una divergencia entre el haplotipo H1 y el clado formado por los haplotipos H2-H9.

Figura 2 Distribución geográfica de las poblaciones y de los haplotipos de Tigridia durangensis. SMOc) Sierra Madre Occidental; FVT) Faja Volcánica Transmexicana. El número junto al gráfico circular corresponde a la población señalada en la Tabla 1. 

Figura 3 Red y cladograma de haplotipos de Tigridia durangensis con base en las regiones ndhF + rpL32-trnL + 3´trnV-ndhC de ADN de cloroplasto. A) Red de haplotipos, el tamaño de los círculos representa la frecuencia, las líneas entre los haplotipos señalan el número de mutaciones; B) cladograma basado en Inferencia bayesiana, los números sobre los nodos representan las probabilidades posteriores y los porcentajes de bootstrap, respectivamente. H1-H9) haplotipos. 

Demografía histórica. A nivel de especie, los índices D y F _S mostraron valores positivos, pero no significativos (Tabla 3). En contraste, D y F _S fueron negativos y no significativos para las poblaciones de la SMOc. Mientras que los valores D y F _S fueron nulos en la FVT (Tabla 3). Para Tigridia durangensis, el ADDP mostró una distribución observada bimodal (Figura 4A) y unimodal para las poblaciones de la SMOc (Figura 4B). A nivel de especie, el valor de SSD fue significativo, pero r no fue significativo (Tabla 3). Por otro lado, a nivel de grupos de poblaciones, estos fueron significativos para la SMOc (Tabla 3). Los gráficos de líneas de cielo bayesianas de T. durangensis con tasas de sustitución 1.1 × 10^-9 y 1.6 × 10^-9 sustituciones/nucleótido/año tuvieron tendencias similares y mostraron un periodo de estabilidad ~2.5-0.5 Ma, seguido de un cuello de botella ~ 0.1 Ma (Figura 5A, B). A nivel de grupos de poblaciones, el Ne en la SMOc fue estable en ~ 0.08 Ma (Figura 5C, D). Por el contrario, el ADDP y el Ne en la FVT mostraron valores nulos.

Figura 4 Gráfico de distribución de diferencias pareadas de Tigridia durangensis. A) Todas las poblaciones; B) poblaciones de la Sierra Madre Occidental. La línea gris representa el crecimiento poblacional esperado, la línea negra representa el crecimiento poblacional observado. 

Figura 5 Gráficos de líneas de cielo bayesianas de Tigridia durangensis. A) Todas las poblaciones con tasa de sustitución 1.1 × 10^-9 sustituciones/nucleótido/año; B) todas las poblaciones con tasa de sustitución 1.6 × 10^-9 sustituciones/nucleótido/año; C) poblaciones de la Sierra Madre Occidental con tasa de sustitución 1.1 × 10^-9 sustituciones/nucleótido/año; D) poblaciones de la Sierra Madre Occidental con tasa de sustitución 1.6 × 10^-9 sustituciones/nucleótido/año. La línea azul en el centro representa el valor medio del tamaño efectivo de la población a través del tiempo, las áreas sombreadas representan el intervalo de confianza del 95 %. 

Paleodistribución. El MNE fue estimado con 52 registros (Tabla S2). Con base en el ACP, los primeros tres componentes explicaron el 95 % de la variación. Las variables bioclimáticas BIO05, BIO06, BIO09, BIO11, BIO12 y BIO18 fueron utilizadas para construir el MNE (Tabla S3). El MNE mostró cambios en el área de distribución de Tigridia durangensis. Contracciones y expansiones del área predicha fueron observadas en los diferentes escenarios climáticos (Figuras 6, 7; Tabla 4). El área de distribución estimada en el UI fue mayor que en los otros periodos (Figura 7B). Durante el UMG hubo una disminución del área estimada con respecto al UI (Figura 7B; Tabla 4). Mientras que, durante el HM ocurrió un incremento en el área estimada a lo largo de la FVT, así como en la parte sur de la SMOc (Figura 7B; Tabla 4). En el Presente, el área de distribución estimada fue menor que en cualquier otro escenario (Figura 7B; Tabla 4).

Figura 6 Modelos de nicho ecológico de Tigridia durangensis. A) Provincias biogeográficas de la Zona de Transición Mexicana, FVT-Faja Volcánica Transmexicana, SMOc-Sierra Madre Occidental, SMOr-Sierra Madre Oriental, SMS-Sierra Madre del Sur, TACh-Tierras altas de Chiapas; B) área estimada para el presente; C-E) Holoceno Medio (~ 6 Ka); F-H) Último Máximo Glacial (~ 21 Ka); I) Último Interglacial (~ 120-140 Ka). Los puntos amarillos representan los sitios de registro, los puntos azules representan los sitios de colecta. 

Figura 7 Área de distribución estimada de Tigridia durangensis en los diferentes escenarios climáticos. A) Área de congruencia entre modelos. B) Tendencias del área en los diferentes escenarios. P) Presente, HM) Holoceno Medio (~ 6 Ka), UMG) Último Máximo Glacial (~ 21 Ka), UI) Último Interglacial (~ 120-140 Ka), C) Área de congruencia en los cuatro escenarios. 

Discusión

En Tigridia durangensis el valor de π (0.00554) fue bajo. Las hipótesis filogenéticas generadas por ^{Goldblatt et al. (2008)} sugieren una radiación adaptativa del grupo hace 15 Ma. En otras palabras, el grupo experimentó una especiación rápida. La irregularidad topográfica y la variación climática en la ZTM facilitaron el proceso. En contraste, el valor de Hd (0.826) fue alto y puede explicarse por el aislamiento y ausencia de flujo génico entre las poblaciones de la SMOc y la FVT. En T. durangensis, los valores de π y Hd son comparables con los observados en Iris dichotoma Pall e I. loczyi Kanitz (^{Zhang et al. 2020}, ²⁰²¹). En general, la diversidad genética en T. durangensis fue baja.

Por otro lado, los resultados del AMOVA, bajo un modelo jerárquico y no jerárquico, evidenciaron diferenciación genética significativa entre las poblaciones de la FVT y SMOc (Tabla 2). Los resultados del AMOVA y del SAMOVA fueron congruentes e indicaron la presencia de dos grupos (Tabla 2). El AMOVA reflejó la correlación de la diversidad haplotípica a diferentes niveles de subdivisión jerárquica (^{Excoffier et al. 1992}). Cuando una especie muestra estructura, la diversidad haplotípica y el número de sitios segregantes aumentará dentro de las poblaciones muestreadas (^{Slatkin 1987}). La evidencia sugirió que las poblaciones de la FVT y SMOc son grupos genéticos distintos. Más aún, el valor de F_ST (0.966) mostró ausencia de flujo de genes entre ambas (Tabla 2). En Tigridia durangensis, las corrientes de agua dispersan las semillas. Considerando que la herencia del plastoma es maternal y Tigridia es alogama, se puede interpretar que no existe flujo de semillas entre las poblaciones de la FVT y la SMOc.

Los valores de G_ST (0.746) y F_ST (0.966) en Tigridia durangensis indicaron estructura poblacional (Tabla 2). Así mismo, la prueba de permutación [N_ST (0.973) > G_ST (0.746)] fue estadísticamente significativa. De acuerdo con ^{Pons & Petit (1996)}, cuando N_ST > G_ST existe estructura filogeográfica. Los resultados apoyan la hipótesis que la complejidad topográfica de la ZTM ha influido en la estructura genética y filogeográfica de las poblaciones de T. durangensis. En Iridaceae, ^{Zhang et al. (2020)} encontraron estructura poblacional y filogeográfica en Iris dichotoma. Los autores proponen que su diversidad y estructura genética fueron ocasionadas por la orogenia de las zonas de contacto entre montañas. Un patrón similar, donde la formación de montañas ocasionó estructura genética entre poblaciones se presenta en Pinus strobiformis Engelm. (^{Moreno-Letelier & Piñero 2009}), Hunnemannia fumariifolia (^{Sosa et al. 2009}), Nolina parviflora (^{Ruiz-Sanchez & Specht 2013}) y Lycianthes moziniana (^{Anguiano-Constante et al. 2021}).

Los haplotipos en la red de Tigridia durangensis y el cladograma formaron dos grupos (Figura 3). El primero, distribuido en la SMOc incluyó a H2-H9 (Figuras 2, 3). H3 fue el más frecuente y por lo tanto el ancestral, y fue relacionado con el resto por una mutación. El segundo grupo incluyó a H1, localizado en la FVT (Figura 2). H1 conectó a H3 por 26 pasos mutacionales (Figura 3A). Esto es apoyado por el valor de F_ST (0.966), el cual refleja la ausencia de haplotipos compartidos entre los grupos. Asimismo, los múltiples pasos que separaron al haplotipo de la FVT de los de la SMOc sugieren que estas poblaciones fueron aisladas por un evento de separación histórico (^{Avise 2000}). Al respecto, ^{Ruiz-Sanchez & Specht (2013)} mencionan que el surgimiento de la FVT separó a los linajes de Nolina parviflora.

Los resultados de las pruebas de neutralidad en Tigridia durangensis fueron contrastantes a nivel de especie y sus poblaciones en la SMOc. A nivel de especie, los valores de D y Fs fueron positivos y sugieren un cuello de botella. Sin embargo, no fueron estadísticamente significativos y se infiere un Ne constante. Por otro lado, los mismos índices para las poblaciones de la SMOc tuvieron valores negativos, pero no significativos. Esto sugiere estabilidad del tamaño poblacional (Tabla 3). De forma similar, el índice SSD fue estadísticamente significativo en T. durangensis y SMOc. En consecuencia, no hubo crecimiento. Caso contrario, en la SMOc, el valor de r fue significativo y se puede interpretar como un crecimiento poblacional reciente. Por último, a nivel de especie los valores positivos y no significativos para r sugieren una estabilidad poblacional.

El ADDP generó un gráfico bimodal en Tigridia durangensis (Figura 4A). Esto refleja la estructura de la red de haplotipos. La primera curva indica dos diferencias pareadas entre los haplotipos del haplogrupo en la SMOc. En contraste, la segunda curva representa 26 diferencias entre los haplotipos de la SMOc y el haplotipo de la FVT. De acuerdo con ^{Avise (2000)}, el ADDP bimodal sugiere que las poblaciones de la SMOc y de la FVT fueron separadas por un evento histórico. Los resultados son similares a los observados por ^{Hoffmann et al. (2003)}, ^{Miller et al. (2006)} y ^{Horne et al. (2008)}, quienes sugieren que la separación de las poblaciones ocasionada por barreras geográficas conduce a la formación de linajes independientes. Por el contrario, el ADDP de las poblaciones de la SMOc generó una distribución unimodal a la izquierda, lo que indica expansión poblacional reciente (Figura 4B). En conclusión, los índices D, F_S y SSD sugieren equilibrio poblacional en T. durangensis.

Los gráficos de líneas de cielo bayesianas mostraron que el Ne de Tigridia durangensis fue estable durante la mayor parte del Pleistoceno y experimentó un cuello de botella en el pasado reciente (Figura 5A-B). En contraste, el Ne de las poblaciones de la SMOc fue estable (Figura 5C-D). Los resultados fueron congruentes con las pruebas de neutralidad a nivel de especie y con las poblaciones de la SMOc. Esto indica equilibrio poblacional.

En los MNE se encontró que dos variables están relacionadas con precipitación (BIO12 y BIO18), dos con temperaturas cálidas (BIO5 y BIO9) y dos con temperaturas frías (BIO6, BIO11). Tigridia durangensis es una geófita y se ha documentado que las plantas con este hábito tienen rangos térmicos amplios y son resistentes a precipitaciones bajas (^{Sosa & Loera 2017}, ^{Howard et al. 2020}). Tigridia durangensis crece en sitios con temperaturas templadas y semifrías y precipitaciones que oscilan entre 600-1,200 mm. El periodo de lluvias favorece su crecimiento vegetativo, pero está adaptada a condiciones de sequía a lo largo del año ya que tiene bulbos que le permiten tolerar la época de estiaje.

El MNE mostró que Tigridia durangensis tiene una distribución disyunta en la ZTM (Figura 6b). Los resultados sugieren que la distribución disyunta de T. durangensis resultó de la formación de la FVT. La SMOc concentró la mayor diversidad genética, lo que representa un área de estabilidad medioambiental en los distintos escenarios climáticos (Figura 7). Las áreas geográficas con diversidad genética alta forman refugios y son caracterizados por la presencia de condiciones ecológicas estables durante las fluctuaciones climáticas (^{Gong et al. 2008}).

Los distintos escenarios climáticos mostraron expansiones y contracciones (Figura 6, Tabla 4). Tigridia durangensis crece en llanos estacionalmente inundables dentro del bosque de coníferas. Este tipo de vegetación es favorecido por suelos ácidos de origen volcánico, está ampliamente distribuido en climas secos a subhúmedos con temperaturas anuales que varían entre 6-28 °C (^{Lozano-García et al. 2019}). En el centro de México, las variaciones de humedad y temperatura previas al UMG provocaron fluctuaciones en los bosques de Pinus L. De acuerdo con el registro palinológico, estos aumentaron su cobertura cuando las condiciones fueron frías y secas, la disminuyeron cuando fueron más húmedas (~ 21 Ka) y la aumentaron cuando el clima fue templado y seco (~ 19 Ka; ^{Metcalfe et al. 2000}). En el UMG las condiciones húmedas y frías provocaron fluctuaciones del área de distribución de Alnus Mill., Quercus L. y Pinus (^{Metcalfe et al. 2000}). Durante el Holoceno, la temperatura aumentó y el Holoceno Temprano fue húmedo (Lozano-García et al. 2019). En contraste, el HM tuvo periodos de sequía que favorecieron el incremento del bosque de Quercus. Finalmente, los intervalos de sequía y la actividad humana y agrícola en el Holoceno Tardío (~ 3 Ka) han reducido el bosque de Pinus. Por otra parte, el norte de México tuvo condiciones frías y húmedas en el Pleistoceno Tardío y el Holoceno Temprano. Mientras que, el HM fue cálido y húmedo (^{Metcalfe et al. 2000}). Las poblaciones de T. durangensis de la FVT crecen en la Cuenca del Lago de Cuitzeo. De acuerdo con ^{Caballero et al. (2010)}, en esta zona hubo descenso de temperatura y condiciones de sequía durante el UMG, lo que provocó la disminución del área de distribución de T. durangensis.

Tigridia durangensis tiene una distribución disyunta en la ZTM, la cual fue constante en los escenarios climáticos pasados. El AMOVA, SAMOVA, la red de haplotipos, el cladograma y el ADDP indicaron que las poblaciones de la FVT y la SMOc son linajes distintos. Por lo anterior, se sugiere que los procesos orogénicos y el volcanismo de la FVT causaron el cuello botella y la interrupción del flujo genético entre los haplogrupos.

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