Producción de los extractos del alga Sargassum spp. (EAS)

El alga Sargassum spp. fue recolectada en el mar Caribe mexicano. Las muestras se transportaron al laboratorio en recipientes de plástico y se lavaron con agua de grifo para eliminar las sales superficiales, luego se dejaron secar al aire libre el tiempo necesario hasta una humedad menor al 20%. Después se procedió a la molienda hasta obtener un tamaño de partícula menor a 0.5 mm. Posteriormente se llevó a cabo la extracción en la planta piloto del laboratorio de Biorrefinería de la Universidad Autónoma de Coahuila en Saltillo, México, donde se utilizó una relación 1:20 (1 g de alga y 20 mL de agua: etanol) (^{Ramya et al. 2015}). La extracción se realizó en un reactor batch, siguiendo la metodología descrita por ^{Ferreira et al. (2019)} con modificaciones, considerando tres factores (temperatura, tiempo y porcentaje de etanol) y tres niveles por factor. Las condiciones de extracción se describen en la Tabla 1, las cuales, se llevaron a cabo mediante un diseño central compuesto. Los extractos se filtraron a través de un papel filtro y se almacenaron a -80 °C en un ultracongelador para su posterior análisis.

Caracterización de los EAS

A los 17 EAS producidos se les determinó la concentración de proteínas totales, aminoácidos y glutatión (Tabla 1). La cuantificación de proteínas totales se realizó mediante la técnica espectrofotométrica de ^{Bradford (1976)}. En tubos de ensayo se agregaron 0.1 mL del EAS y 1 mL del reactivo Bradford para después dejar en reposo 5 minutos y leer en espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis, Thermo Scientific) a 595 nm. Los aminoácidos se cuantificaron por la técnica propuesta por ^{Yemm y Cocking (1955)}. En tubos de ensayo se agregaron 0.250 mL del EAS, 2.25 mL de buffer de citratos a 0.09 M (pH 5) y 0.5 mL de ninhidrina al 0.35%, para luego agitarlos y colocarlos en baño María a temperatura de entre 80 y 100 °C durante 20 min. Terminada la reacción, las muestras se colocaron en un baño de hielo y se leyó en un espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis, Thermo Scientific) a 570 nm. El glutatión se cuantificó siguiendo la metodología espectrofotométrica establecida por ^{Xue et al. (2001)}, mediante la reacción del ácido 5,5 ditio-bis-2 nitro benzoico (DTNB). En tubos de ensayo se agregaron 0.48 mL del EAS, 2.2 mL de Na₂HPO₄ a 0.32 M y 0.32 mL del colorante DTNB a 1 mM. Para luego mezclar y dejar reposar por 15 minutos para después realizar la lectura en un espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis, Thermo Scientific) a 412 nm. Los datos se reportaron en miligramos por gramo de peso fresco (mg g^-1 PF).

Material vegetal y condiciones experimentales

Semillas de tomate hibrido el CID F1 de la compañía Harris Moran Seed Company, tipo saladette y crecimiento indeterminado, se sembraron en bandejas de poliestireno con una mezcla de sustrato de peat moss y perlita (1:1 v/v). El experimento se estableció en un invernadero cubierto de polietileno en el Departamento de Horticultura de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro en Saltillo, México. La temperatura promedio fue de 28 °C y 50 a 60% de humedad relativa. Las plántulas se cultivaron durante 30 días hasta que desarrollaron cuatro hojas verdaderas. Para luego trasplantarlas a contenedores de unicel de 0.5 L con la misma relación de sustrato utilizada en la siembra. El sistema de riego fue manual, dando un riego al día a capacidad de campo. La nutrición de las plantas se realizó con una solución nutritiva ^{Steiner (1961)} al 25%. Las dosis aplicadas de los EAS fueron del 1.5% de acuerdo con investigaciones realizadas por ^{Ramya et al. (2011)}, ^{Kasim et al. (2015)} y ^{Ramya et al. (2015)}. Los EAS se aplicaron vía foliar utilizando un aspersor hasta el punto de goteo, las aplicaciones se realizaron cada 10 días a partir del trasplante, acumulando cuatro aplicaciones durante la prueba que tuvo una duración de 30 días a partir del trasplante. Las aplicaciones se realizaron entre las 08:00 y 10:00 h con un aspersor manual. Para evitar la pulverización de tratamientos vecinos, se utilizó una barrera plástica flexible para aislar el espacio de aplicación.

Diseño experimental

Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con 19 tratamientos, los cuales fueron: 17 EAS y dos controles, un producto comercial de Ascophyllum nodosum y agua destilada como control absoluto. Cada tratamiento tuvo 10 réplicas, dando un total de 190 unidades experimentales.

Variables evaluadas

Se midieron las variables de crecimiento de altura de plántula, diámetro de tallo, número de hojas, peso fresco y peso seco total de las plántulas. Las variables bioquímicas evaluadas fueron: pigmentos fotosintéticos, proteínas totales, glutatión, fenoles totales, flavonoides y capacidad antioxidante hidrofílica (ABTS).

La altura de plántula se midió con un flexómetro desde la base de la superficie del suelo hasta el ápice de crecimiento. El diámetro del tallo con un vernier digital entre la primera y segunda hoja desde la base de la planta. También se contó el número de hojas y se tomó el peso freso y seco del vástago y raíz con una balanza digital.

Para determinar los compuestos bioquímicos en las plántulas de tomate, el material congelado se liofilizó. Para luego pulverizar la muestra en un mortero de porcelana. Para la extracción y cuantificación de proteínas, glutatión y capacidad antioxidante hidrofílica (ABTS) se colocaron 100 mg de tejido liofilizado en un tubo de 2 mL y se agregaron 10 mg de polivinilpirrolidona (PVP) para estabilizar los compuestos. Posteriormente se agregaron 2 mL de buffer de fosfatos 0.1 M (pH 7-7.2), se homogeneizó en vórtex durante 20 s, se sonicaron durante 5 min y se centrifugó a 12 500 rpm a 4 °C durante 10 minutos, para luego recolectar el sobrenadante para realizar el análisis. Con la extracción se realizó la cuantificación de proteínas y glutatión, con las metodologías descritas en al apartado de caracterización de EAS y los resultados se reportaron en miligramos por gramo de peso seco (mg g^-1 PS).

La capacidad antioxidante hidrofílica (ABTS), se determinó por el método descrito por ^{Re et al. (1999)}, que se basa en la decoloración del catión radical ABTS. El radical se obtuvo de la reacción del ABTS a 7 mM con persulfato de potasio a 2.45 mM (1:1 v/v) en la oscuridad durante 16 h, posteriormente se diluyó con etanol al 20% hasta obtener una absorbancia de 0.7 ± 0.01 a 754 nm. Luego, para determinar la capacidad antioxidante de los compuestos hidrofílicos, en un tubo de 2 mL se colocaron 20 pL del extracto y 980 pL de la dilución del radical ABTS, se agitaron durante 5 s y se dejaron reposar 7 min en oscuridad. La absorbancia se medió en un espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis, Thermo Scientific) a 754 nm. Los resultados se expresaron en miligramos equivalentes de ácido ascórbico por gramo de peso seco (mg EAA g^-1 PS).

Los pigmentos se determinaron con el método descrito por ^{Wellburn (1994)}, con ligeras modificaciones, para lo cual, se agregaron 60 mg de tejido liofilizado en un tubo de ensayo, para luego adicionar 5 mL de metanol puro e incubar a temperatura ambiente en oscuridad por 24 h para la extracción completa de los pigmentos. Pasadas las 24 h se procedió a medir la absorbancia en espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis, Thermo Scientific) a 666, 653 y 470 nm. La concentración de los pigmentos se expresa en miligramos por gramo de peso seco (mg g^-1 PS), usando las siguientes formulas:

Los fenoles se determinaron según la metodología de ^{Singleton et al. (1999)}. La muestra se extrajo colocando 100 mg de tejido liofilizado en un tubo de 2 mL y se agregaron 2 mL de solución de extracción (agua: acetona 1:1 v/v). La mezcla se agitó mediante un vórtex durante 20 s para después llevar a sonicación por 5 min. Finalmente, las muestras se centrifugaron a 12 000 rpm durante 10 min a 4 °C para obtener el sobrenadante y proceder a la cuantificación. La cuantificación se realizó en tubos de ensayo al agregar 50 µL de cada muestra, 200 µL del reactivo Folin Ciocalteu al 100%, 500 µL de carbonato de sodio al 20% y 5 mL de agua destilada. La mezcla se dejó reposar durante 30 minutos a 45 ^°C. Posteriormente la mezcla se leyó a una longitud de onda de 750 nm en un espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Los resultados de fenoles se expresan en miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de peso seco (mg EAG g^-1 PS).

Los flavonoides se cuantificaron siguiendo método de ^{Zhishen et al. (1999)}. Los compuestos fueron extraídos colocando 100 mg de tejido liofilizado en tubos de 2 mL y agregando 2 mL metanol al 80%. La mezcla se pasó por el vórtex durante 20 s, posteriormente se sónico por 5 minutos y se centrifugo a 4 000 rpm durante 10 min a 4 ^°C. Para la mezcla se colocaron 250 µL de la alícuota en un tubo de ensayo, seguido de la adición de 75 µL de NaNO₂ al 5% y se agitó mediante un vórtex. Después de 5 min se agregaron 150 µL de AlCl₃ al 10%; luego, se agregó un volumen de 500 µL de NaOH 1 M, más un volumen final de 2.025 mL de agua destilada. La absorbancia se midió a 510 nm en un espectrofotómetro Uv-Vis (Genesis 10s Uv-Vis). Los flavonoides se cuantificaron mediante una curva estándar de catequina, basados en peso seco (mg EC g^-1 PS).

Muestreo de plantas

Para las variables de crecimiento se seleccionaron cinco plantas al azar y de la misma manera para compuestos antioxidantes. Se muestreó la hoja más joven totalmente expandida, la cual, se colocó en aluminio, se congeló inmediatamente con nitrógeno líquido y se almacenó en un ultracongelador a -80 ^°C para su posterior análisis. El muestreo y evaluación de las plántulas se realizó 24 h después de la última aplicación de los EAS.

Análisis de datos

Se realizó un análisis de varianza y prueba de medias de la diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher (p ≤ 0.05). Todos los procedimientos estadísticos se realizaron utilizando el software Infostat (v2018).

Caracterización de los EAS

Los resultados indican que las diferentes condiciones de extracción causaron diferencias en la concentración de metabolitos nitrogenados en los EAS (Tabla 1). Se puede apreciar que el EAS que presentó mayores concentraciones de estos metabolitos es el EAS7 (160 °C/ 30 min/ 50% de etanol), el cual, muestra valores de 3.47, 0.43 y 3.35 mg g^-1 PF para proteínas, aminoácidos y glutatión, respectivamente. En cuanto al tratamiento que presentó los valores más bajos, fue el EAS2 (120 °C/ 0 min/ 50% etanol), dicho EAS muestra valores de 0.91, 0.18 y 1.61 mg g^-1 PF para proteínas, aminoácidos y glutatión, respectivamente. El resto de los EAS muestra valores entre los rangos del EAS2 y EAS7. De igual manera se puede apreciar que conforme aumenta la condición de extracción, la concentración de metabolitos en los EAS es mayor.

Parámetros de crecimiento de las plántulas

Los resultados señalan que las aplicaciones foliares de los EAS en las plántulas de tomate causaron cambios significativos (p ≤ 0.05) en los parámetros de crecimiento (Tabla 2 y 3). El EAS con mejores resultados fue el denominado EAS7, este EAS aumentó la altura de plántula, número de hojas, diámetro de tallo, materia fresca y seca total en un 8.67, 18.42, 32.32, 25.03 y 11.59%, respectivamente, en comparación con el control absoluto. En cuanto a la aplicación del producto comercial se observó un incremento en todas las variables en comparación al control absoluto, pero no superior que el de la mayoría de los EAS. Se puede apreciar que el control absoluto en todos los parámetros de crecimiento estadísticamente es de los más bajos, a excepción de la variable de altura de plántula, en donde el tratamiento más bajo es el EAS3 (120 °C/ 30 min/ 50% etanol), dicho tratamiento fue superado por el control absoluto en un 7.59%.

Pigmentos fotosintéticos

La concentración de pigmentos en las hojas de las plántulas de tomate se incrementó sustancialmente (p ≤ 0.05) con la adición foliar de los EAS. Se puede apreciar que el mejor tratamiento, fue el EAS12 (120 °C/ 15 min/ 25% etanol), el cual, incrementó la clorofila a, clorofila b, clorofila total y carotenoides en un 33.69, 25.91, 31.17 y 100%, respectivamente, en comparación con el control absoluto, el cual, fue el que presentó los valores más bajos (Tabla 4). En cuanto al producto comercial, muestra valores intermedios de concentración.

Proteínas y estado antioxidante de las plántulas

En cuanto a las proteínas y compuestos antioxidantes de las plántulas de tomate el análisis estadístico muestra que se presentaron cambios significativos (p ≤ 0.05) por la adición foliar de los EAS. En cuanto al mejor tratamiento, fue el denominado EAS7, ya que, aumentó las proteínas, glutatión, fenoles totales, flavonoides (Figura 1) y la capacidad antioxidante hidrofílica ABTS (Figura 2) de las hojas en un 386.48, 15.92, 22.05, 35.99 y 18.86%, respectivamente, en comparación al control absoluto, el cual, fue de los tratamientos que presentó los valores más bajos. En cuanto al producto comercial, presentó valores intermedios de concentración. En general el EAS7 fue superior al resto de los tratamientos ya que los superó estadísticamente en proteínas, glutatión, fenoles totales y flavonoides, pero no en capacidad antioxidante. En esta variable los mejores tratamientos fueron el EAS4 (120 °C/ 30 min/ 0% etanol) y EAS16 (140 °C/ 15 min/ 0% etanol), seguidos por el EAS7. Probablemente estos tratamientos son ricos en otros compuestos antioxidantes que no se determinaron, a lo cual, se debe su mayor capacidad antioxidante.

Figura 1: Proteínas y compuestos antioxidantes en hojas de plántulas de tomate tratadas con aplicaciones foliares de EAS. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (LSD, p ≤ 0.05). PS: Peso seco; PC: Producto comercial; T0: Control absoluto; EAG: Equivalentes de ácido gálico; EC: Equivalentes de catequina; EAS: Extracto de alga Sargassum spp. Los intervalos de las barras representan el error estándar. 

Figura 2: Capacidad antioxidante hidrofílica en hojas de plántulas de tomate tratadas con aplicaciones foliares de EAS. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (LSD, p ≤ 0.05). ABTS: 2,2’-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid); EAA: Equivalentes de ácido ascórbico; PS: Peso seco; PC: Producto comercial; T0: Control absoluto; EAS: Extracto de alga Sargassum spp. Los intervalos de las barras representan el error estándar. 

Caracterización de los EAS

Los extractos de algas pardas están ganando interés creciente, por su composición única de compuestos de interés en la agricultura. Recientemente se están utilizando diversas técnicas de extracción de compuestos biológicamente activos que son amables con el medio ambiente (^{Michalak y Chojnacka 2015}, ^{Shukla et al. 2019}). Cada técnica de extracción que se utilice mostrará resultados diferentes en cuanto a la concentración de los compuestos de interés, por lo cual, dichas técnicas se tienen que elegir de acuerdo a los objetivos del estudio y a los materiales disponibles (^{Michalak y Chojnacka 2014}). En este estudio la extracción se realizó mediante un reactor batch controlando temperaturas, tiempos y porcentaje de etanol. Por lo que los resultados obtenidos en la caracterización de los EAS se pueden atribuir las condiciones a las que fue sometida el alga, lo que nos indica que entre más severa fue la condición de extracción (160^oC/ 30 min/ 50% etanol), la obtención de metabolitos fue mayor. En este sentido al elevar la temperatura del solvente (agua: etanol) la extracción es mayor, ya que, se facilita la lisis celular, provocando una mayor liberación de compuestos bioactivos, y el mantener dichas condiciones por lapsos más prolongados aumenta el rendimiento de la extracción (^{Heffernan et al. 2016}, ^{Casagrande et al. 2018}). Es por eso que la mayor concentración de proteínas, aminoácidos y glutatión lo presentó el tratamiento EAS7, el cual, presenta las condiciones más elevadas de extracción (Tabla 1). Estos resultados son similares a los reportados por ^{Ferreira et al. (2019)} quienes muestran que en Fucus vesiculosus a temperaturas y tiempos más elevados (120 ^oC y 4 h, respectivamente) de extracción se obtienen las mejores concentraciones de compuestos bioactivos. De la misma manera ^{Fu et al. (2016)} muestran un aumento en la capacidad antioxidante de extractos de diferentes algas en la medida que aumenta el tiempo de extracción.

Hay estudios que indican que a mayores temperaturas y tiempos de extracción es posible obtener mayores concentraciones de compuestos, pero a su vez, las mismas condiciones pueden ocasionar la degradación de los mismos (^{Ferreira et al. 2019}). Lo cual, aparentemente no sucedió con los compuestos que se determinaron en este estudio, posiblemente porque se necesitan condiciones más severas para su degradación, ya que, los enlaces que presentan estos compuestos (proteínas, aminoácidos y glutatión) son covalentes, los cuales, son los más fuertes y difíciles de romper (^{Lin et al. 2020}).

Parámetros de crecimiento de las plántulas

La obtención de plántulas de calidad depende de su genética, fisiología y un ambiente favorable para el desarrollo de raíz y vástago (^{Giménez et al. 2008}). En la actualidad la producción y propagación de plántulas está afectada por diferentes estrés ambientales que deterioran su calidad, lo que, las hace propensas a infecciones por patógenos (^{Ruan et al. 2009}), lo que lleva a buscar alternativas. Los resultados obtenidos, posiblemente son atribuidos a la mayor concentración de metabolitos nitrogenados en el EAS7 (proteínas, aminoácidos y glutatión), los cuales, al ser fuentes de N y precursores hormonales modifican positivamente el metabolismo, lo que mejora el crecimiento y la acumulación de biomasa en los cultivos (^{Hernández et al. 2009}, ^{Hernández-Herrera et al. 2014}, ^{Teixeira et al. 2017}).

La producción de plántulas sanas y vigorosas favorecen su arraigo y buen desarrollo en campo (^{Preciado-Rangel et al. 2002}). Los resultados son consistentes con los reportados por ^{Kumari et al. (2011)} quienes demostraron que la aplicación foliar, en drench y combinada de extractos de Sargassum johnstonii mejoró la altura, longitud de los brotes, numero de hojas y la longitud de la raíz en plantas de tomate a dosis de 10%. Lo que se atribuye a la presencia de auxinas, citoquininas y nutrientes esenciales en los extractos utilizados. Sobre lo mismo ^{Kalaivanan y Venkatesalu (2012)} evaluaron el efecto de la aplicación de extractos de Sargassum myriocystum como estimulante en plántulas de frijol, reportando que dosis bajas (10%) incrementan la altura, longitud de la raíz, peso fresco y seco de las plántulas; mientras que dosis altas, mayores de 10%, mostraron tendencias decrecientes. Mientras que ^{Vijayanand et al. (2014)} al evaluar aspersiones foliares de extractos de Sargassum wightii en el cultivo de frijol indican que tratamientos a dosis de 1.5%, al igual que este experimento mejoraron los parámetros de crecimiento del cultivo en comparación con el control.

Pigmentos fotosintéticos

La capacidad fotosintética de las hojas está relacionada con el contenido de N, principalmente porque las proteínas de los tilacoides y las que actúan en el ciclo de Calvin representan la mayoría del N foliar (^{Latsague et al. 2014}, ^{Sánchez et al. 2018}), lo cual, está relacionado con la concentración de metabolitos nitrogenados en los EAS, motivo por el cual, se cree que todos los EAS incluido el producto comercial incrementaron la concentración de pigmentos en comparación al control absoluto.

También hay estudios que demuestran que los extractos de algas pardas contienen betaínas, compuesto que cumple diversas funciones en las plantas, como osmoprotector ante el déficit hídrico, sin embargo, su rol principal está en el incremento de la actividad fotosintética, ya que, evita la degradación de los pigmentos (^{Blunden et al. 1996}, ^{Estaji et al. 2019}). Como lo mencionan ^{Zermeño-González et al. (2015)} quienes demuestran que la adición foliar y drench de extractos de Sargassum spp. a dosis de 1 L ha^-1 en vid aumentó significativamente la concentración de clorofilas en las hojas. Mientras que ^{Vijayanand et al. (2014)} también indican que aspersiones foliares de extractos de Sargassum wightii a dosis de 1.5% incrementan la concentración de pigmentos fotosintéticos en hojas de frijol.

Proteínas y estado antioxidante de las plántulas

Un antioxidante es cualquier molécula que retrasa, previene o elimina el daño oxidativo a otras moléculas, con la eliminación o neutralización de especies reactivas de oxígeno, nitrógeno y azufre producidas durante el estrés, las cuales, son causantes de dicho daño oxidativo, induciendo así tolerancia en las plantas (^{Olson et al. 2017}, ^{Kapoor et al. 2019}, ^{Chib et al. 2020}). Los resultados de esta investigación posiblemente son producto de la mayor concentración de metabolitos en el EAS7 (Tabla 1), los cuales, actúan como bioestimulantes, como los compuestos nitrogenados presentes (proteínas, aminoácidos y glutatión). Al respecto, varios estudios demuestran que este tipo de metabolitos tienen la capacidad de activar el sistema de defensa de las plantas, al inducir mayor síntesis de compuestos antioxidantes, como lo indican ^{Kollist et al. (2019)} y ^{Shukla et al. (2019)} quienes reportan que las membranas celulares cuentan con una serie de sensores, los cuales, tienen la función de unirse al metabolito y eventualmente desencadenar una serie de señalizaciones celulares que resultan en la activación del sistema de defensa, por lo cual, se incrementa la síntesis y actividad de compuestos antioxidantes, como los enzimáticos (superóxido dismutasa, catalasa, ascorbato peroxidasa y glutatión peroxidasa) y no enzimáticos (fenoles, carotenoides, glutatión y vitaminas) (^{He et al. 2018}, ^{Shukla et al. 2019}). Los antioxidantes en zimáticos se consideran la primera línea de defensa, la cual dificulta la producción de radicales libres que conduce al estrés oxidativo, en cambio los antioxidantes no enzimáticos participan en la segunda línea de defensa, que se encarga de inhibir la producción de daños causados por la reacción oxidativa (^{Haida y Hakiman 2019}).

Existen estudios que indican que los EAS pueden incrementar la síntesis de compuestos antioxidantes, como lo muestran ^{Vijayanand et al. (2014)} quienes afirman que la aplicación foliar de extractos de Sargassum wightii a dosis de 1.5% aumentan la concentración de azúcares reductores y ácido ascórbico en las hojas de frijol. Mientras que ^{Kumari et al. (2011)} al evaluar la aplicación foliar, drench y combinada de extractos de Sargassum johnstonii sobre el contenido de compuestos bioactivos en frutos y hojas de tomate, reportan que todas las formas de aplicación mejoraron la síntesis de proteínas, azúcares, fenoles, ácido ascórbico y licopeno a dosis de 10%. Mientras que ^{Vasantharaja et al. (2019)} demostraron que la adición foliar de extractos Sargassum swartzii al 3% incrementó la concentración de proteínas, fenoles totales, flavonoides y capacidad antioxidante DPPH en frijol. De forma similar ^{Kasim et al. (2015)} informaron que el pretratamiento de semillas de trigo con extractos de Sargassum latifolium al 1.5% mejoró el mecanismo de defensa (enzimático y no enzimático) de las plántulas al ser estresadas por sequía.

Es importante mencionar que los EAS también son ricos en carotenoides, vitaminas, fenoles, hormonas, azucares y minerales, los cuales, posiblemente también influyeron en todos los resultados y no solo los nitrogenados. Aunado a esto se puede observar que existen respuestas muy diferentes en cada una de las variables estudiadas de acuerdo al tratamiento aplicado, lo cual, depende del tipo de material, sistema de producción, condiciones ambientales y la concentración de los EAS. Cada uno de estos factores afecta de manera diferente el desarrollo y síntesis de metabolitos en las plantas. El material vegetal y el sistema de producción son de importancia, ya que, de esta manera se pueden controlar ciertos factores ambientales que son causantes de estrés (^{Holzkámper 2017}, ^{Khaki et al. 2019}). La concentración de los EAS es algo que siempre se tiene que tomar en cuenta, y lo más recomendable de acuerdo a diferentes investigaciones es aplicar este tipo de bioestimulantes a dosis bajas (^{Kauffman et al. 2007}).