Muestreo y acondicionamiento de residuos

Los residuos de café provienen del beneficio húmedo y se recolectaron en el municipio de Amixtlán, ubicado en la Sierra Norte de Puebla, México (20°02’ 53.1" Norte, 97°47’ 56.1" Oeste), entre 400 y 1 700 msnm, con clima cálido subhúmedo y lluvias todo el año. En el lugar de recolecta se deposita bagazo, cascarilla y pergamino del beneficio, por lo que las muestras fueron una mezcla de residuos de café (MRC); de la cual se tomaron 100 kg y transportaron en bolsas plásticas. La MRC se secó en horno de convección a 60 °C hasta alcanzar una humedad menor al 10% (^{Hames et al. 2008}); la composición de la MRC se determinó en tres muestras secas de 1 kg, que se separó en bagazo, cascarilla y pergamino, para luego pesarlos para relacionar con la masa total de la MRC. Del total de la MRC seca, se tomaron 500 g y se molieron, tamizaron y se tomaron 300 g del tamaño de partícula entre 2.37 y 1.68 mm (malla US12), los cuales se guardaron a temperatura ambiente en bolsas plásticas hasta su uso.

Cepas y preparación de inóculo

Los microrganismos, L. strigosus, T. harzianum, y dos hongos aislados de residuos, uno de paja (Aspergillus sp. APC) y otro de residuos de café (Aspergillus sp. ARC), se sembraron en matraz de 250 mL con 50 mL de PDA. Después de seis días (L. strigosus) y tres días de crecimiento (hongos ascomicetos) a 26 ± 2 °C se les añadió agua esterilizada para diluir micelio o esporas.

La solución de inóculo de los ascomicetos se preparó a partir de las esporas colectadas del crecimiento obtenido. el inóculo se preparó al diluir en 300 mL de agua estéril 1x10⁹ esporas mL^-1 de cada ascomiceto. Para L. strigosus, se diluyó el micelio de 6 días, cortando en cuadros de 0.5 cm² el agar invadido utilizando una cuchilla estéril. Los trozos de agar con el hongo fueron adicionados en un matraz Erlenmeyer conteniendo 300 mL de agua estéril, se agitó a 150 rpm durante 12 h y el sobrenadante obtenido con el micelio en suspensión (8.98 ± 0.70 mg mL^-1) fue utilizado como inóculo.

Montaje del sistema de fermentación en columnas de vidrio

La FES se realizó utilizando columnas tipo Raimbault (^{Raimbault y Alazard 1980}) empleando una torunda de algodón como tope en la base de la columna. Los 300 g de MRC secos se humedecieron con 300 mL de agua (relación 1:1). Las columnas y la MRC humedecidos se esterilizaron a 121 °C por 15 min; se dejó enfriar, la MRC estéril se inoculó con 300 mL de solución de cada inóculo, y se mezcló para homogeneizar. La humedad final del sustrato fue 67.5 ± 0.5%, posteriormente, las columnas se empacaron a una densidad de empaque de 0.51 ± 0.01 g ・cm^-3 hasta una altura de 5 cm (^{Quintanar-Gómez et al. 2012}). En la parte inferior de la columna se colocó un humidificador y se inyectó aire a una velocidad de 1 L・min^-1. Como estrategia para cuantificar la biomasa, se colocó en la parte superior de la columna un sistema de colección del aire, este aire se hizo burbujear en 100 mL de NaOH 1 M para atrapar el CO₂ metabólico producto de la respiración de los hongos. La fermentación se llevó a cabo a 25 °C durante 16 días.

Cinética del proceso

Para realizar los análisis y dar seguimiento a la cinética, se llevó a cabo el muestreo de columnas cada 2 días durante 16 días retirando aleatoriamente tres columnas en cada toma de muestra, en cada muestreo se cuantificó el CO₂ metabólico por volumetría y el contenido total de polifenoles (CTP) por espectrofotometría utilizando el método modificado de Folin-Ciocalteu (^{Geremu et al. 2016}, ^{Hernández-Teyssier et al. 2023}), el cual consistió en colocar en tubos eppendorf color ámbar de 2 mL, 200 µL de muestra, 1 mL de solución comercial de Folin-Ciocalteu diluida 10 veces, 800 µL de Na₂CO₃ al 7.5%, la mezcla se dejó reposar por 30 min en oscuridad a 25 ± 2.0 °C. Las muestras se leyeron a 765 nm empleando ácido gálico como estándar y se reportó como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de residuos secos (mg EAG・g^-1 RS).

Cuantificación indirecta de biomasa utilizando el CO₂ metabólico

Para cuantificar el CO₂ metabólico se tomaron 2 mL de la solución trampa de NaOH, se añadieron 18 mL de agua y se colocaron tres gotas de fenolftaleína, se tituló con HCl 0.1 M valorado hasta el cambio de vire, de violeta a incoloro (Alcalinidad a la fenolftaleína); posteriormente, se colocaron tres gotas de naranja de metilo y se tituló hasta el cambio de vire, de amarillo a canela (Alcalinidad total). La alcalinidad total y alcalinidad a fenolftaleína se determinaron de acuerdo a la NMX-AA-036 (^{SE 2014}); la Alcalinidad a la fenolftaleína se calculó con el volumen de ácido para el cambio de vire con fenolftaleína. Posteriormente, con la siguiente Ecuación se calculó la concentración de CO₂.

El factor de conversión de CO₂ metabólico a biomasa se obtuvo a partir de la solución de la ecuación de estequiometría de crecimiento, considerando una composición teórica elemental de la MRC a partir del porcentaje de cada residuo (^{Pineda-Insuasti et al. 2014}), la fórmula general empírica de biomasa (^{Doran 2012}) y una eficiencia biológica (Y _x/s ) de 0.35 g g^-1.

Después de aplicado el factor de conversión, los datos se modelaron con la ecuación modificada de Gompertz (^{Rosero-Delgado et al. 2017}) y se obtuvieron los parámetros cinéticos, velocidad máxima específica de crecimiento (µ_max) y periodo de latencia (λ).

Donde: X_o es biomasa inicial (mg ・ g^-1 RS), X _max biomasa máxima obtenida (mg ・ g^-1 RS), µ _max velocidad máxima especifica de crecimiento (d^-1), λ periodo de latencia (d) y t tiempo de muestreo.

Seguimiento del desgaste de la matriz por espectroscopía FT-IR

Los residuos fermentados secos se molieron hasta un tamaño menor a 0.149 mm y se analizaron en un Espectrofotómetro Infrarrojo con Transformada de Fourier (FT-IR) modelo Agilent (CARY 630), la toma de datos se realizó en el rango espectral de 4000 a 600 cm^-1, con una resolución de 100 escaneos, los análisis se realizaron por triplicado (^{Hernández-Teyssier et al. 2023}).

Análisis estadístico

Todos los experimentos y mediciones se realizaron por triplicado. Los análisis de varianza (ANOVA) y comparación de medias de Duncan se realizaron a un α = 0.05, y la validación del modelo cinético a partir del coeficiente de correlación obtenido (R²) y el error de raíz cuadrada media (RMSE) se realizó con el software R versión 4.3.0 (^{Wickham 2016}, ^{Wickham et al. 2022}, R ^{Core Team 2023}).

Solución de la ecuación de estequiometría

La composición de la MRC presentó 5% de pergamino, 40% de cascarilla y 55% de bagazo, de aspecto heterogéneo y tonos cafés. Para el calculó de la composición elemental de la MRC, se buscó en la literatura la composición elemental de cada residuo (Tabla 1). Con base en el l porcentaje de MRC se calculó el valor de cada elemento en cada residuo, al ser una propiedad extensiva de la materia, se suman y se obtiene la composición teórica elemental de 49.33% de C, 4.70% de H, 40.45% de O, 2.63% de N y 2.88% de cenizas. Para luego con la fórmula empírica en relación atómica de un mol de C de sustrato: CH _1.14 O_0.62 N_0.05. Para luego con las fórmulas empíricas, de sustrato y de biomasa, suponiendo como fuente de nitrógeno al NH₃ y partiendo de una Yx/s de 0.35 g ・ g^-1 se resolvió el sistema de ecuaciones para obtener la solución a la ecuación de estequiometría de crecimiento, dando como resultado la ecuación de estequiométrica de crecimiento microbiano siguiente:

Después de comprobado el equilibrio en la ecuación, el factor de conversión se definió como 3.53 g de CO₂ por gramo de biomasa.

Modelado de biomasa

Aplicando el factor de conversión a los valores de CO₂, los datos obtenidos en unidades de biomasa (mg・g^-1 RS) se simularon por el modelo de crecimiento de Gompertz modificado. El valor de los parámetros µ _max y λ se asignó considerando valores bajos de RMSE y mayor coeficiente de correlación (R²) entre los datos experimentales y los datos modelados. En la Tabla 2 se presentan los valores de cada parámetro del modelo y de las dos métricas, R² y RMSE; luego de realizar una comparación de medias con la Prueba de Duncan, se observó en las µmax diferencias significativas entre sí, la µ _max más alta fue de 0.42 ± 0.08 h^-1 para Aspergillus sp. ARC, muy similares entre Aspergillus sp. APC y T. harzianum (0.21 ± 0.01 h^-1 y 0.20 ± 0.03 h^-1, respectivamente) y muy baja para L. strigosus (0.12 ± 0.01 h^-1). Los ajustes de los datos experimentales con el modelado indican valores de la métrica R² superior a 0.95, pero el modelo matemático presenta deficiencia en el pronóstico de algunos microorganismos por valores de RMSE relativamente altos.

Reducción del contenido de polifenoles y crecimiento microbiano

Durante la FES se evaluó el CTP, considerando su reducción como la detoxificación de los residuos de café, pero luego de unos días de fermentación, se observó un ligero aumento en su concentración. En la Figura 1 se muestra el comportamiento del CTP para cada microorganismo y en la Tabla 3 la velocidad de degradación del CTP en cada FES, las cuales muestran diferencias significativas, considerando a T. harzianum como el microorganismo más rápido, por lograr una velocidad de reducción de 1.92 ± 0.28 mg EAG g^-1 RS día^-1, seguido por Aspergillus sp. APC (1.39 ± 0.19 mg EAG g^-1 RS día^-1), L. strigosus (0.88 ± 0.18 mg EAG g^-1 RS día^-1) y Aspergillus sp. ARC (0.17 ± 0.002 mg EAG g^-1 RS día^-1). Estas velocidades se observaron para todos los casos, a los 4 días de fermentación. Respecto al porciento de detoxificación, los mejores resultados se observaron con L. strigosus con 75.74 ± 6.07% a los 10 días de fermentación, seguido de T. harzianum con 56.13 ± 6.92% a los 4 días, Aspergillus sp. APC con 50.34 ± 4.82% a los 4 días y Aspergillus sp. ARC con 32.89 ± 3.17% a los 10 días. Posterior al día de máxima reducción de polifenoles, se observó en cada FES un ligero aumento en CTP, lo que coincidió con el inicio de la fase estacionaria, pero sin lograr rebasar el CTP iniciales (Figura 1).

Figura 1 Cinéticas en FES de A) L. strigosus, B) T. harzianum, C) Aspergillus sp. APC y D) Aspergillus sp. ARC, del CTP (△ ▲), masa residual de MRC fermentados (○), crecimiento experimental (□) y modelado (-) (n = 3). 

Desgaste de residuos de café por FES

El desgaste de la matriz se analizó por espectroscopía de IR, como los residuos lignocelulósicos están compuestos de lignina, hemicelulosa y celulosa; el análisis de FT-IR se enfocó en cambios como la aparición, aumento o nitidez de picos y en longitudes de onda correspondientes a grupos funcionales de estos biopilímeros (Tabla 4). Los cambios en la MRC fermentados se evaluaron en tres tiempos: tiempo inicial, tiempo intermedio (tiempo de máxima detoxificación) (Tabla 3) y tiempo final. También se analizaron los residuos sin tratamiento y los residuos después de esterilizados como blancos para comparar los cambios por la interacción con el microrganismo.

Generalmente la descripción de los espectros de FT-IR se divide en dos regiones, en la región de grupo funcional (≥ 1 500 cm^-1) y en la región de huellas características (< 1 500 cm^-1). En la primera los residuos mostraron cambios en el porcentaje de transmitancia (% T) (Figura 2) específicamente entre 3 500 y 2 850 cm^-1, correspondiente a grupos funcionales γ (O-H) y C-H de la celulosa, hemicelulosa y lignina; y en la otra región, los residuos se diferencian mejor por la aparición o desaparición de señales entre los 1 740 a los 835 cm^-1, mayormente relacionada a grupos funcionales de la lignina, como C=C, C-O, C-O-C, C-H.

Figura 2 Espectros FT-IR de residuos fermentados por A) L. strigosus, B) T. harzianum, C) Aspergillus sp. APC y D) Aspergillus sp. ARC a (-) tiempo inicial, (-) tiempo intermedio y (-) tiempo final contrastando con (-) residuos sin tratamiento y (-) residuos esterilizados (n = 3). 

De los cuatro espectros (Figura 2), el residuo desgatado en la FES con T. harzianum (Figura 2B) mostró en la región de grupo funcional (3 500 a 2 850 cm^-1) un patrón distinto a lo observado por los otros microrganismos, ya que los residuos de tiempo intermedio presentaron menos cambios en % T. Por otro lado, la región de huellas características (1 740 a 835 cm^-1) es más compleja y para este estudio, los espectros y su descripción se centraron en grupos funcionales de compuestos fenólicos y anillos aromáticos derivados de la lignina y polifenoles (Tabla 4), por lo que, se acotó la región entre 1 115 y 1 437 cm^-1.

En la Figura 2A se muestra el patrón de desgaste de los residuos fermentados por L. strigosus, donde se observó el mismo número de señales, pero con menos % T (Figura 2A). En la Figura 2B, de T. harzianum, se observaron señales más nítidas y amplias, así como la formación de otra a los 1 400 cm^-1 al tiempo intermedio; en cuanto a APC y ARC (Figura 2C y 2D) las señales son muy parecidas, ya que el valor del % T en tiempo inicial es mayor y en tiempos intermedio y final las señales se solaparon y son menores en % T; y porque no aparecen o desaparecen señales solo se definen y alargan más.

Modelado de crecimiento en FES

Para desarrollar satisfactoriamente la estrategia de cuantificación indirecta y modelación de biomasa, fue necesario conocer la composición elemental de la mezcla, por lo se optó por la deducción teórica a partir del conocimiento en porcentaje de cada residuo en la MRC y de la composición elemental de cada residuo, para así resolver la ecuación estequiométrica de crecimiento. Este procedimiento ya ha sido utilizado por ^{Rosero-Delgado et al. (2017)} quienes modelaron el crecimiento de Auricularia auricula en cascarilla de arroz y bagazo de caña en FES a partir de la cuantificación de CO₂ metabólico, la conversión a biomasa por la ecuación de estequiometría y la ecuación modificada de Gompertz, reportando µ _max de 0.004 h^-1 y 0.003 h^-1, en cascarilla de arroz y bagazo de caña, respectivamente.

Además de cuantificar CO₂ metabólico, otros estudios han aplicado métodos indirectos para cuantificar y modelar el crecimiento de basidiomicetos y actinomicetos en FES que no implican conocer el contenido elemental de los sustratos. Al respecto, ^{Smits et al. (1999)} cuantificaron el contenido de glucosamina, consumo de oxígeno y actividad del agua en FES de salvado de trigo con Trichoderma reesei, propuniendo cuatro modelos de crecimiento, pero solo uno predice con mayor precisión el crecimiento en periodos largos de fermentación. Por otro lado, ^{Téllez-Téllez et al. (2008)} cuantificaron las biomasas de Pleurotus ostreatus y A. auricula en FES y fermentación sumergida (FSm); en FES emplearon un soporte inerte y por diferencia de peso definieron la biomasa real producida; para ambas fermentaciones aplicaron las ecuaciones Velhurst-Pearl o logística y obtuvieron la mayor velocidad máxima de crecimiento (µ _max ) (0.033 h^-1) en FES que en FSm (0.022 h^-1), debido probablemente a la similitud de hábitat natural de los hongos.

La parametrización del crecimiento biológico conlleva a una mejor descripción del proceso, en la Tabla 2 se muestran los valores requeridos para el modelo Gompertz modificado y los valores de los métricos R² y RMSE. Generalmente, para modelar el crecimiento se requiere el valor de la µ _max porque permite saber el tiempo de multiplicación del microorganismo y estimar su adaptabilidad por la asimilación del sustrato, además este valor es específico para los microorganismos con el sustrato. Las µ _max obtenidas por los microorganismos, muestran como algunos microrganismos están más adaptados al sustrato y consumo de nutrientes. Por un lado, el microorganismo más lento fue L. strigosus por presentar el menor valor (0.12 ± 0.01 h^-1), pero al compararlo con otros basidiomicetos como P. ostreatus y A. auricula (^{Téllez-Téllez et al. 2008}) es más rápido, debido a su capacidad metabólica y disponibilidad de sustrato. Por otro lado, el microorganismo con mayor rapidez para crecer fue Aspergillus sp. ARC con un valor de 0.42 ± 0.08 h^-1, este microorganismo fue aislado de los residuos de café y al ser un ascomiceto y en comparación con los basidiomicetos, es más rápido para el desarrollo de micelio en sustratos lignocelulósicos (^{De-Oliveira-Rodrigues et al. 2020}). La µ _max de los otros ascomicetos no mostro ser tan significante ya que luego de la prueba de Duncan, Aspergillus sp. APC y T. harzianum fueron agrupados como b y bc, respectivamente, considerándose como iguales en tanto a adaptación al sustrato y capacidad de metabolizar los nutrientes.

La utilidad de los valores métricos radica en cómo y cuánto podemos aceptar la predicción de valores por un modelo matemático a partir de datos experimentales. Es decir, R² muestra la proporción de la varianza en la variable respuesta de los datos modelados, y RMSE indica qué tan alejados están los valores modelados de los experimentales. Contrario al valor de R², los valores de RMSE no tienen un límite máximo o un criterio definido para saber el mejor ajuste, solo se considera que sea menor para un mejor ajuste (^{Montgomery 2004}). En este estudio los valores de R² son superiores a 0.95, lo cual sugiere una menor varianza entre los datos modelados y experimentales, sin embargo, llega a existir diferencia significativa entre los microorganismos T. harzianum y Aspergillus sp. APC, situación justificable, porque el valor RMSE de cada uno también se diferencia, mientras que para Aspergillus sp. APC es un valor pequeño (0.82 ± 0.47), para T. harzianum es 3.36 ± 0.67, lo cual indica que el modelo Gompertz modificado no fue el ideal para evaluar el crecimiento de todos los hongos, ya que al comparar cada valor de RMSE se observan diferencias significativas, considerándolo más apto para modelar el crecimiento de Aspergillus sp. APC, y menos para Aspergillus sp. ARC, donde se observó un mayor valor de RMSE (7.28 ± 3.76). Por lo que es necesario evaluar otros modelos de crecimiento con esta estrategia de cuantificación de biomasa.

Desarrollo del contenido total de polifenoles en FES

De acuerdo a las cinéticas de crecimiento (Figura 1), la pendiente de reducción de polifenoles se relaciona con la fase exponencial de crecimiento, lo cual sugiere que estos compuestos son de fácil asimilación debido a que son consumidos en las primeras instancias del crecimiento, y probablemente, su consumo se deba a la síntesis de enzimas como las tanasas encargadas de hidrolizar taninos hasta generar subproductos como glucosa y ácido gálico (^{Govindarajan et al. 2019}, ^{Ristinmaa et al. 2022}). Por lo tanto, es probable que la detoxificación de residuos de café se deba a la hidrólisis de los polifenoles presentes en el residuo y otro biopolímeros como lignina, hemicelulosa y celulosa, lo cual coincide con lo mencionado por ^{Ristinmaa et al. (2022)} quienes evaluaron un medio específico con galoctaninos solubles en agua y Clostridium butyricum. Los resultados obtenidos sugieren que los polifenoles pueden ser una fuente de carbono que activa la secreción de enzimas hidrolíticas en hongos, levaduras y bacterias (^{Lekshmi et al. 2021}). Es común el uso de bacterias para la producción de enzimas como las tanasas ya que representan ventajas siendo la principal, el tiempo de crecimiento, pero no es común su uso para el aprovechamiento integral de residuos lignocelulósicos (^{Govindarajan et al. 2019}, ^{Lekshmi et al. 2021}, ^{Ristinmaa et al. 2022}).

Por otro lado, el aumento observado de CTP se puede deber a que el hongo basidiomiceto L. strigosus, crecen debido a la degradación inicial de los polifenoles presentes en el residuo que generan una caída en la concentración de CTP, agotadas estas moléculas, se inicia la degradación de la lignina propiciada por la presencia de enzimas ligninolíticas, lacasa, manganeso peroxidasa (MnP) y lignina peroxidasa (LiP) (^{García-Esquivel et al. 2021}), las cuales generan monolignoles (^{Lu y Ralph 2010}, ^{Chen et al. 2023}) y moléculas reactivas que son cuantificables por el método de Folin-Ciocalteu por presentar un grupo hidroxil en el anillo fenólico; además de que se conoce mayor producción de estas enzimas en basidiomicetos que en ascomicetos (^{De-Oliveira-Rodrigues et al. 2020}).

Para los tres ascomicetos evaluados, el aumento de CTP se podría justificar porque los polifenoles no estructurales, como ácido tánico y ácido digálico, se degradan por la enzima tanasa producida por este género de hongos, la cual hidroliza el enlace éster del tanino hidrolizable generando éster de galoilo, glucosa y ácido gálico (^{Lekshmi et al. 2021}). Además, compuestos como vainillato, ferulato y siringato y cafeína se degradan por una ruta similar a la degradación de ácido gálico, pero por medio de enzimas dioxigenasas (^{Kasai et al. 2007}) generando en todos los casos un reactivo (protocatechuado o 4-carboxi-2-hidroximuconato semialdehído) recondensable biológicamente por el NADP_+. Para luego dar lugar al ácido 2-pirona-4, 6-dicarboxílico, sustancia formada por un anillo de pirano con dos grupos de ácido carboxílico (^{Otsuka et al. 2006}), detectable por el método de Folin-Ciocalteu. Por lo cual el aumento de CTP en los ascomicetos podría deberse a la recondensación biológica y presencia de este tipo de enzimas; situación observada también por ^{Londoño-Hernandez et al. (2020)} luego de 60 h de cultivo de Rhizopus oryzae en FES y ^{Serna-Diaz et al. (2016)} que observaron recondenzación en la deslignificación de paja de cebada. La mayor detoxificación observada en el basidiomiceto L. strigosus, podría deberse a la capacidad de secretar enzimas ligninolíticas como lacasa, LiP y MnP (^{García-Esquivel et al. 2021}). La cual esta relacionadas con la degradación de la lignina y su mineralización; además, este hongo podría aprovecharse para generar biomasa comestible debido a sus beneficios nutricionales y terapéuticos (^{Dulay et al. 2014}).

El tiempo de degradación es un factor de suma importancia en procesos fermentativos, los ascomicetos estudiados mostraron capacidad para reducir la cantidad de polifenoles presentes en los residuos en un menor tiempo que el utilizado por el biasidiomiceto, y pone en evidencia su potencial para procesos de detoxificación. Al respecto, se han descritos resultados similares como el caso de Rhizopus oryzae al lograr una reducción del 91.16% a los 8 días (^{Londoño-Hernandez et al. 2020}) o el uso de Aspergillus sp para degradar a los 6 días de fermentación el 92% de cafeína presente en residuos de café (^{Brand et al. 2000}). Es posible mejorar los tiempos de degradación al controlar variables como el pH, humedad del sustrato, temperatura de incubación, tamaño de inóculo entre otros, y acelerar la degradación de compuestos tóxicos utilizando hongos filamentosos como los ascomicetos o basidiomicetos.

Modificación de matriz orgánica por metabolismo microbiano

La matriz orgánica utilizada está compuesta principalmente por lignocelulosa, lo que es una ventaja para dar seguimiento de su desgaste. La lignocelulosa está conformada por lignina, hemicelulosa y celulosa, la cual representa el mayor porcentaje en peso de la matriz y muy pocas veces se puede acceder a ella únicamente por procesos biológicos o enzimáticos. En las señales observadas por FT-IR (Figura 2), se observa que las señales más intensas pertenecen a la hemicelulosa y lignina, ya que, al considerarlas como capas externas de esta matriz lignocelulósica, son más fácilmente observables y son las más susceptibles a cambios estructurales por el contacto directo con el micelio. La lignina y hemicelulosa son polisacáridos heterogéneos, con un gran número de grupos funcionales, principalmente OH, C-H, C=C, los cuales muestran estiramiento vibracional en la región de grupo funcional (1 500 cm^-1) y comparando lo reportado con otros autores (^{Zhang et al. 2020}, ^{Volli et al. 2021}) se asimilan en esta región, siendo específicamente entre los 3 600 y 3 200 cm^-1, la señal observada en todos los residuos lignocelulósicos. Por otro lado, el residuo mostró señales en los 2 922 cm^-1 y 2 854 cm^-1, que es una señal poco común en los residuos lignocelulósicos, y hasta el momento, esta señal también la comparten los residuos de cebada, elote (^{Volli et al. 2021}), cascarilla de arroz (^{Jorge-Montalvo et al. 2019}) y cáscara de nuez (^{Zhang et al. 2020}). Lo que se sugiere que esta señal corresponde a grupos funcionales de la celulosa degradada parcialmente, luego de tratamientos físico o químicos en los residuos, por lo tanto, el contacto de los residuos con microorganismos, desgasta las primeras capas (lignina y hemicelulosa) y expone parcialmente la celulosa. El primer contacto del microorganismo con el residuo es con la lignina y luego la hemicelulosa, por lo tanto, se observan señales más nítidas de los grupos funcionales presentes en ambos biopolímeros, estas señales son consideradas como huellas características (huellas dactilares) en la región menor de 1 500 cm^-1, como lo mencionan (^{Volli et al. 2021}) que compararon las señales entre 1 115 y 1 604 cm^-1 asociándolo a un patrón típico de lignina por lo que llegaron a la conclusión de que esta región corresponde a los grupos funcionales de este polímero. En la Tabla 4 se muestran los valores obtenidos en la región donde se observa reducción en el tamaño/intensidad de las señales (menor % T) que puede atribuirse a la exposición de los biopolímeros a la acción enzimática que pueden afectar las regiones internas del biopolímero por la acción metabólica (atenuación y nitidez de señales), ya que se ha mencionado, que el aumento de CTP, se puede deber a que los microorganismos hidrolizan lignina, liberando algunos monómeros y exponiendo otros aumentando la detección de CTP.