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Introducción
Azadirachta indica, comúnmente reconocido como neem, es un árbol de gran relevancia en diferentes países debido a que se le atribuyen propiedades biológicas, tales como insecticida, antifúngico y anticonceptivo, entre otras. Los compuestos bioactivos relacionados con estas propiedades pueden encontrarse en la corteza, ramas, hojas, tronco y semillas; destacando éstas últimas debido a que es en ellas donde se albergan la mayor proporción de estos compuestos bioactivos (Ospina-Salazar et al. 2015). La fracción oleosa de las semillas de neem es la más relevante debido a que constituye alrededor del 40% de su peso y por qué en ella se han identificado metabolitos como los limonoides (tetranotriterpenoides), los cuales poseen actividad bactericida, antifúngica y antialimentaria en insectos (Gahucar 2014, Hatti et al. 2014, Djibril et al. 2015, Muñiz-Reyes et al. 2016, Teuntor y Aleman 2016). De entre los compuestos bioactivos, la azadiractina es el más reconocido debido a sus propiedades insecticidas, encontrándose principalmente en las semillas y en menor concentración en las hojas.
La presencia de azadiractina en el aceite de neem ha hecho de éste un producto de gran interés comercial enfocado al control de diferentes tipos de insectos en diversos cultivos. No obstante, la presencia de otros compuestos como la nimbina y la salanina, adquieren relevancia ya que la sinergia entre ellos, o con otros componentes han demostrado destacadas propiedades antifúngicas contra algunas especies tales como M. canis, C. albicans y Aspergillus sp. (Mahmoud et al. 2011), así como contra Drechslera, Alternaria y Fusarium (Ospina-Salazar et al. 2015).
Diferentes hogos fitopatógenos son responsables del deterioro de una gran variedad de productos agrícolas, generando éstos importantes pérdidas (5 al 25% en países desarrollados y 20 al 50% en países en desarrollo) (Herrera-Cebreros et al. 2022). Considerando lo anterior, resulta atractivo el evaluar la actividad antifúngica de extractos oleosos de la semilla del neem contra hogos fitopatógenos relacionados con daños pre y postcosecha de algunas frutas y hortalizas.
Si bien, la fracción oleosa de los frutos del árbol de neem contiene compuestos con un amplio espectro de actividad biológica, su naturaleza lipofílica limita su aplicación en entornos hidrofílicos reduciendo significativamente el efecto esperado. La nanotecnología a través del desarrollo de nanoemulsiones ha demostrado ser una alternativa efectiva en la protección, acarreo y liberación de compuestos bioactivos de interés tecnológico, ofreciendo una mayor solubilidad, estabilidad, bioaccesibilidad, biodisponibilidad y eficacia (Zambrano-Zaragoza et al. 2013, Ohashi et al. 2015). En este sentido, investigaciones recientes han reportado mejoras en la actividad antifúngica de diversos aceites esenciales cuando éstos fueron integrados en nanoemulsiones como sistemas de acarreo y liberación (Wan et al. 2019). Este efecto observado se sugiere que es debido al reducido tamaño de la nanoestructura conformada lo cual incrementa la absorción celular pasiva, disminuyendo la resistencia a la transferencia de masa hacia los compartimentos intercelulares del hongo. Por otro lado, se incrementa la estabilidad fisicoquímica de la fracción oleosa o aceite esencial durante el almacenamiento de la nanoemulsión (Bedoya-Serna et al. 2018, Ribes et al. 2017).
Las nanoemulsiones han sido definidas como finas dispersiones de agua en aceite o de aceite en agua, que presentan una distribución de tamaño de glóbulo de entre 20 y 500 nm, estabilizadas por pequeñas cantidades de emulsificantes, que a diferencia de las emulsiones, ofrecen diversas ventajas entre las que destacan una mayor estabilidad de las gotas ante la agregación y separación gravitacional, alta solubilidad y estabilidad, además de mejorar la biodisponibilidad y eficacia biológica a los compuestos bioactivos en ellas dispersos (Cardoso-Ugarte y Jimenez-Munguia 2015). Para mantener la estabilidad fisicoquímica de las nanoemulsiones, en su formulación pueden emplearse diversos métodos de preparación, diversas condiciones de operación características del método de preparación, diferentes tipos y proporciones de las fases que las conforman, así como diferentes tipos y proporciones de los emulsificantes empleados (Mushtaq et al. 2023). Considerando que la estabilidad de las nanoemulsiones a desarrollar es una característica determinante en el logro de la función de acarreo de compuestos activos, las formulaciones planeadas, así como lo principales parámetros de proceso deben ser evaluados y monitoreados durante su preparación, así como a través del tiempo de almacenamiento. En base a lo anterior, el objetivo del presente trabajo consistió en desarrollar nanoemulsiones estables a base de aceite de neem, así como evaluar su actividad antifúngica frente a una cepa de Aspergillus niger aislada de frutos de papaya.
Materiales y métodos
Extracción de aceite a partir de semillas de neem
Frutos maduros de árboles de neem (Azadirachta indica) fueron recolectados en los alrededores de la Universidad Tecnológica de Tabasco. Los frutos fueron trasladados al laboratorio, lavados y retirada la pulpa de sus semillas. Las semillas fueron secadas a temperatura ambiente bajo sombra y posteriormente se retiró la cascarilla del kernel. El kernel obtenido fue molido hasta convertirlo en una masa homogénea la cual se pesó dentro de matraces Erlenmeyer, adicionando posteriormente acetona como solvente de extracción. La relación kernel:Acetona empleada fue de 1:10 (p:v). La mezcla kernel-acetona fue colocada en un baño sonicador (Cole-Parmer Modelo 8895-39) con potencia de salida de 110W, 40KHz. Las condiciones de sonicación fueron de 20 min a una temperatura de 40 °C. Al finalizar el tiempo de extracción, la mezcla fue filtrada a vacío y el filtrado evaporado bajo vacío empleando un rota evaporador a 50 °C. La fracción oleosa extraída fue pesada y estimado el porcentaje de extracción mediante la relación de los pesos del aceite extraído y del kernel inicialmente empleado.
Diseño, preparación y evaluación de nanoemulsiones
Nanoemulsiones aceite en agua fueron planteadas considerando un diseño experimental central compuesto, con tres factores a tres niveles y dos puntos axiales, empleando como ingredientes: aceite de neem, agua desionizada y mezcla de emulsificantes no iónicos (Tween 20 y Span 20, ambos de la marca Cedrosa®). Los factores considerados fueron: concentración de aceite en la nanoemulsión, proporción aceite-emulsificante y valor de HLB. Los valores de HLB considerados se obtuvieron a través de la mezcla de diferentes proporciones de los emulsificantes. En la Tabla 1 se muestran las formulaciones planteadas dentro del diseño experimental. Para la elaboración de las nanoemulsiones, se preparó la fase oleosa mezclando las proporciones adecuadas de los emulsificantes con el aceite de neem. A continuación, una emulsión gruesa fue preparada mediante la adición de agua destilada a la fase oleosa, homogenizándola por 3 min a 20,000 rpm con ayuda de un homogeneizador Ultra-Turrax T25 digital (IKA Works, Inc. Staufen, Alemania). Cada emulsión gruesa fue sometida a ultra sonicación empleando un Sonicador Branson Digital S- 450D (Branson Ultrasonics Corp., Danbury, CT). Las condiciones de proceso fueron: 20% de amplitud, 50% de ciclo de trabajo, 6 minutos de tratamiento en ciclos de 1 minuto de sonicación, 1 minuto de reposo.
Tabla 1 Formulación de nanoemulsiones planteadas por diseño experimental central compuesto con tres factores a tres niveles y dos puntos axiales.
| Formulación | Aceite (%) | Relación aceite:mezcla emulsificantes (p:p) | HLB | Composición porcentual (%) de emulsificantes en mezcla | |
|---|---|---|---|---|---|
| Tween 20 | Span 20 | ||||
| 1 | 3 | 1:2 | 10.625 | 25 | 75 |
| 2 | 7 | 1:2 | 10.625 | 25 | 75 |
| 3 | 3 | 1:4 | 10.625 | 25 | 75 |
| 4 | 7 | 1:4 | 10.625 | 25 | 75 |
| 5 | 3 | 1:2 | 14.675 | 75 | 25 |
| 6 | 7 | 1:2 | 14.675 | 75 | 25 |
| 7 | 3 | 1:4 | 14.675 | 75 | 25 |
| 8 | 7 | 1:4 | 14.675 | 75 | 25 |
| 9 | 1 | 1:3 | 12.65 | 50 | 50 |
| 10 | 9 | 1:3 | 12.65 | 50 | 50 |
| 11 | 5 | 1:1 | 12.65 | 50 | 50 |
| 12 | 5 | 1:5 | 12.65 | 50 | 50 |
| 13 | 5 | 1:3 | 12.65 | 50 | 50 |
| 14 | 5 | 1:3 | 8.6 | 0 | 100 |
| 15 | 5 | 1:3 | 16.7 | 100 | 0 |
La nanoemulsiones preparadas fueron analizadas en su tamaño de glóbulo, índice de polidispersidad y carga superficial del glóbulo, para lo cual se empleó un equipo de dispersión de luz dinámica Zetasizer Nano-ZS90 (Malvern Instruments Inc.) con ángulo fijo de 90°y 25 °C de temperatura. A partir de los resultados del tamaño de glóbulo alcanzado en las nanoemulsiones preparadas y, derivado de un análisis estadístico de superficie de respuesta, se identificó una formulación óptima a partir de la cual se obtuviera una nanoemulsión cuyo tamaño de glóbulo estuviera entre 30 y 60 nm. La estabilidad de las nanoemulsiones con tamaño de glóbulo menor a 100 nm fue evaluada durante su almacenamiento a 4 °C. Análisis del tamaño de glóbulo, distribución y carga superficial fueron realizados cada siete días, durante los primeros 28 días y finalmente después de 365 días.
Aislamiento e identificación del hongo filamentoso
A partir de un fruto de papaya (Carica papaya L.) con síntomas visibles de daño por hongo filamentoso, se realizó un aislamiento mediante la siembra directa en medio Agar Dextrosa y Papa (PDA) (MCD LAB®) acidificado. El cultivo fue incubado a 25 ± 1 °C por 5 días y posteriormente se realizaron una serie de reaislamientos en medio PDA hasta obtener un cultivo monospórico. El hongo filamentoso aislado fue identificado molecularmente, para lo cual se extrajo su ADN según Raeder y Broda (1985) y se utilizó para la amplificación de la región espaciadora interna (ITS) transcrita del ADN ribosomal por la técnica de PCR, según White et al. (1990). El ADN amplificado fue secuenciado en el Instituto de Biotecnología (IBT) de la Universidad Nacional Autónoma de México (Cuernavaca, Morelos, México), y las secuencias fueron alineadas con secuencias depositadas en el Gen-Bank del NCBI mediante el programa BLASTn, para verificar el porcentaje identidad correspondiente a la especie analizada.
Evaluación de actividad antifúngica In vitro
La técnica de alimento envenenado fue empleada para evaluar la actividad antifúngica de las nanoemulsiones preparadas, considerando la formulación óptima previamente identificada. Para la preparación de estas nanoemulsiones se consideró, por un lado, aceite recién extraído a partir de las semillas de neem y por otro, aceite de neem comercial (NowFoods®). Aunado a lo anterior, se evalúo también la actividad antifúngica de los aceites, tanto el extraído como el comercial, sin nano emulsionar. Las concentraciones evaluadas del aceite de neem (nanoemulsionado o solo) en el medio de cultivo fueron de 7.7, 15.4, 23.1, 30.8 y 38.5 mg mL-1. Durante la preparación de las pruebas, las nanoemulsiones a evaluar, así como los aceites de neem fueron mezclado con medio PDA a 40 °C y vertidos en cajas de Petri de 90 mm de diámetro. Cajas de prueba con medio PDA sin nanoemulsión o sin aceite de neem integrado fueron empleadas como tratamiento testigo. Una vez solidificado el medio, se inoculó al centro de cada caja de Petri un disco de 5 mm de diámetro conteniendo crecimiento del hongo filamentoso aislado previamente, sembrado en medio PDA e incubado por 8 días. Todas las Cajas de Petri inoculadas al centro fueron incubadas a 25 1 °C hasta que el crecimiento del hogo filamentoso en el tratamiento testigo ocupara el 100% de la superficie de la caja de Petri. El crecimiento radial del micelio alrededor de los discos en cada caja de prueba fue medido diariamente empleando un vernier. El porcentaje de inhibición fue estimado considerando la siguiente ecuación:
Donde: D1 = Diámetro colonial testigo, y D2 = Diámetro colonial tratamiento
Análisis estadístico
La identificación de una formulación óptima para preparar nanoemulsiones con tamaño de glóbulo de entre 30 y 60 nm fue realizada mediante un análisis de superficie de respuesta empleando el Optimizador de Respuesta del Software Minitab (© 2022 Minitab, LLC. All Rights Reserved). Análisis de varianza (ANOVA) con posterior comparación de medias empleando la prueba de Tukey (p ≤ 0.05) fueron realizadas para estimar diferencia entre los tratamientos.
Resultados
Preparación de nanoemulsiones, caracterización y definición de formulación óptima
Aceite extraído de las semillas de frutos del árbol de neem fue empleado como fase oleosa en la preparación de las nanoemulsiones, considerando las formulaciones planeadas bajo el diseño experimental indicado en la Tabla 1. Cada una de las preparaciones fue analizada en su tamaño de glóbulo, índice de polidispersidad (PDI) y carga superficial (potencial Z). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2; en ésta se observa que la concentración de aceite de neem empleada (A), así como la relación aceite:emsulsificante (RAE) y los valores de HLB alcanzados por las diferentes mezclas de los emulsificantes usados (Tween 20 y Span 20) tienen efecto significativo en el tamaño de glóbulo obtenido en las nanoemulsiones generadas a partir de estos componentes. Así mismo, las interacciones A*RAE, A*HLB, RAE*HLB y RAE*RAE también mostraron tener efectos significativos sobre el tamaño de glóbulo. Por otro lado, en el caso del PDI, únicamente las interacciones A*HLB y RAE*HLB mostraron efectos significativos sobre este parámetro. En el caso del potencial Z, éste fue solo influenciado por el HLB y su término cuadrático (HLB*HLB) (Tabla 2).
Tabla 2 Valores de p derivados del Análisis de Varianza de los efectos de los diferentes factores y términos del modelo sobre las diferentes variables de respuesta consideradas en la caracterización de las nanoemulsiones preparadas.
| Valores de p | |||
|---|---|---|---|
| Tamaño de glóbulo | Índice de polidispersidad (PDI) | Carga superficial del glóbulo (Z) | |
| Aceite (A) | 0.000 | 0.294 | 0.398 |
| Relación Aceite:Emulsificante (RAE) | 0.000 | 0.851 | 0.503 |
| HLB | 0.000 | 0.202 | 0.000 |
| A*A | 0.120 | 0.129 | 0.078 |
| RAE*RAE | 0.026 | 0.439 | 0.095 |
| HLB*HLB | 0.374 | 0.065 | 0.020 |
| A*RAE | 0.000 | 0.160 | 0.965 |
| A*HLB | 0.002 | 0.007 | 0.420 |
| RAE*HLB | 0.017 | 0.001 | 0.097 |
Considerando que el tamaño de glóbulo alcanzado es una característica relevante, el conocer el efecto que ejercen los diferentes factores involucrados en su preparación es muy importante. En este sentido, al analizar en forma general los efectos principales ejercidos por cada uno de los factores estudiados se encontró que al incrementar la concentración del aceite, o aumentando la RAE, los tamaños de glóbulo obtenidos tienden a ser mayores (Figura 1a, región derecha). Situación contraria se observó en el caso del HLB, siendo que valores de HLB mayores favorecen la formación de glóbulos de menor tamaño (Figura 1b y c, región izquierda). El efecto de las interacciones observadas entre los diferentes factores también fue significativo. En este sentido es de hacer notar la influencia que la RAE ejerce sobre el tamaño de glóbulo en las nanoemulsiones obtenidas, de manera que grandes incrementos en el tamaño de glóbulo son observados al incrementar tanto los niveles de este factor como el de la concentración de aceite en las formulaciones (Figura 1a). Por lo anterior, si se desea obtener nanoemulsiones con tamaños de glóbulo en escala nanométrica (< 100 nm) es necesario considerar esta importante interacción (Figura 1a). En este mismo sentido, en las Figuras 1b y 1c se observa el efecto de las interacciones HLB* A y HLB*RAE sobre el tamaño de glóbulo. Como puede apreciarse, cambios en los niveles de HLB influyen marcadamente sobre el tamaño de glóbulo, siendo valores de HLB altos los que generan tamaños de glóbulo pequeños.
A partir de los resultados obtenidos se estimaron los coeficientes para cada uno de los términos que conforman modelos matemáticos que mejor se ajustan y describen los tamaños de glóbulo, PDI y potencial Z en función de los factores considerados en dichos modelos. Los coeficientes estimados, así como el grado de ajuste (R2) para cada uno de los modelos generados se muestra en la Tabla 3, siendo éstos empleados para el desarrollo de los gráficos de superficie presentados en las figuras 1a, 1b y 1c. Una característica fundamental en la funcionalidad esperada en las nanoemulsiones es que los tamaños de glóbulo alcanzados sean menores a 100 nm. Por ello al contar con un modelo matemático que predijera el tamaño de glóbulo de una nanoemulsión en función de la composición de sus ingredientes (factores estudiados) fue posible identificar una formulación (formulación óptima) con la cual se alcanzarían tamaños de glóbulo entre 30 y 60 nm. En este sentido, la formulación óptima identificada considera una concentración de aceite de neem del 8.21%, una RAE de 1:3.28 (p:p) y un HLB de 16.222. Lo anterior, descrito en términos porcentuales para cada uno de los ingredientes de la formulación corresponde al 8.21% de aceite de neem, 25.340% del emulsificante Tween 20, 1.589% del emulsificante Span 20 y 64.861% de agua destilada desionizada.
Tabla 3 Coeficientes estimados para cada uno de los diferentes términos considerados en los modelos generados para cada una de las variables de respuesta consideradas en la caracterización de las nanoemulsiones preparadas.
| Coeficientes del modelo | Tamaño de glóbulo | Índice de polidispersidad (PDI) | Carga superficial del glóbulo (Z) |
|---|---|---|---|
| Constante | -81.90 | -1.00 | 127.70 |
| Aceite (A) | 45.70 | 0.121 | 9.54 |
| Relación Aceite:Emulsificante (RAE) | -46.10 | 0.581 | 1.90 |
| HLB | 25.40 | -0.006 | -16.70 |
| A*A | 5.90 | 0.012 | -0.56 |
| RAE*RAE | 35.10 | 0.023 | 2.10 |
| HLB*HLB | 3.20 | 0.014 | 0.74 |
| A*RAE | 38.90 | 0.025 | 0.03 |
| A*HLB | -15.20 | -0.026 | -0.29 |
| RAE*HLB | -21.90 | -0.067 | -1.22 |
| R2 | 88.16 | 63.40 | 78.90 |
En nanoemulsiones, el mantener los tamaños de glóbulo en escala nanométrica a lo largo del tiempo es un requerimiento necesario para asegurar la funcionalidad de dichas nanoemulsiones durante su uso. En este contexto, en la Tabla 4 se muestran los tamaños de glóbulo observados en nanoemulsiones conteniendo aceite de neem durante su almacenamiento a 4 °C. Las nanoemulsiones consideradas en esta parte del estudio comprendieron aquellas cuyos tamaños de glóbulo inicial se encontraba por debajo de los 100 nm. Estas nanoemulsiones correspondían a las formulaciones 5 (F5), 6 (F6), 7 (F7), 11 (F11) y 14 (F14) indicadas en la Tabla 1. Así mismo, se consideró también la formulación identificada previamente como óptima (F Opt). Como puede apreciarse, las nanoemulsiones preparadas a partir de las formulaciones F Opt y F14 fueron las únicas que mantuvieron sus tamaños de glóbulo sin cambios significativos a lo largo del almacenamiento de 365 días (Tabla 4).
Tabla 4 Efecto del tiempo de almacenamiento sobre el tamaño de glóbulo (nm) de las nanoemulsiones generadas, considerando las formulaciones que menor tamaño de glóbulo producen.
| Formulación | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Días | F5 | F6 | F7 | F11 | F14 | F Opt |
| 0 | 49.36 ± 10.71cAB | 30.54 ± 0.04bB | 59.16 ± 10.72bA | 65.49 ± 7.32dA | 62.52 ± 3.12aA | 59.99 ± 2.16aA |
| 7 | 52.08 ± 2.41cB | 32.60 ± 2.46bB | 44.64 ± 6.79bB | 99.10 ± 6.47cA | 59.73 ± 16.00aB | 66.68 ± 10.00aAB |
| 14 | 55.79 ± 7.29cB | 36.78 ± 5.77bB | 44.55 ± 10.94bB | 127.34 ± 10.43bcA | 51.31 ± 10.59aB | 64.19 ± 7.09aB |
| 21 | 90.76 ± 4.32bB | 46.44 ± 7.97bC | 43.56 ± 10.66bC | 130.59 ± 10.09bcA | 64.41 ± 1.54aBC | 65.50 ± 6.24aBC |
| 28 | 99.13 ± 0.69bB | 48.82 ± 2.64bC | 57.16 ± 10.19bC | 142.37 ± 10.37bA | 62.32 ± 2.97aC | 66.47 ± 10.32aC |
| 365 | 269.10 ± 0.68aB | 322.60 ± 7.29aA | 218.60 ± 0.30aC | 208.80 ± 3.50aC | 64.79 ± 1.61aD | 67.17 ± 5.39aD |
Valores medios dentro de la misma columna que no comparten alguna letra minúscula son significativamente diferentes (p < 0.05). Valores medios dentro de la misma fila que no comparten alguna letra mayúscula son significativamente diferentes (p < 0.05).
Identificación del hongo filamentoso aislado
La funcionalidad esperada para las nanoemulsiones conteniendo aceite de neem fue su capacidad antifúngica frente a uno de los hongos responsables del deterioro postcosecha de frutos de papaya. En este sentido, derivado de la serie de reaislamientos en medio PDA, se obtuvo un hongo monospórico cuyas colonias después de 5 días de crecimiento presentaban características filamentosas, de color blanco grisáceas que tornaron a amarillo (Figura 2). Estas colonias posteriormente se cubrían de puntos oscuros apreciándose finalmente de color negro y granulosas. Características microscópicas indicaban la presencia de cabezas conoidales globosas de color café oscuro, conidióforos lisos de color marrón claro y conidios globosos. La posterior identificación molecular realizada mediante búsqueda por homología indicó como resultado un 99% de similitud con Aspergillus niger AY373852 y AF138904. Considerando todo lo anterior, el hongo aislado en este estudio fue identificado como Aspergillus niger.
Evaluación de la actividad antifúngica
Considerando la formulación identificada previamente como óptima, nanoemulsiones conteniendo aceite de neem recién extraído a partir de las semillas de neem (NeE), así como aceite de neem comercial (NeC) fueron evaluadas en su actividad antifúngica frente a la cepa de Aspergillus niger. En la figura 2b y 2c se muestra ejemplo de la inhibición del desarrollo radial del hongo en cajas de Petri con medio PDA conteniendo NeE y NeC. Lo anterior contrasta con el desarrollo normal del hongo en cajas de Petri con medio PDA sin nanoemulsiones adicionadas (Testigo) (Figura 2a). El grado de inhibición (%) estimado en cada caso deriva de la relación porcentual observada entre el desarrollo radial de la caja testigo contra la caja conteniendo las nanoemulsiones. En este sentido, aceite de neem extraído (AE), así como el aceite de neem adquirido comercialmente (AC), ambos sin nanoemulsificar, fueron también evaluados en su actividad antifúngica. En la Figura 3 se muestran los grados de inhibición alcanzados por cada una de las nanoemulsiones y de los aceites de neem sin nanoemulsificar bajo diferentes concentraciones de éstos en el medio PDA. Como puede apreciarse, el mayor grado de inhibición alcanzado (93.33 ± 5.77%) correspondió a nanoemulsiones preparadas con aceite de neem extríado (NeE) y que se encontraba presente en el medio a una concentración de 38.5 mg mL-1 (Figura 3). Aunque no se encontró diferencia estadísticamente significativa, menores concentraciones de NeE en el medio PDA tiende a provocar un menor grado de inhibición en el desarrollo radial de A. niger en el medio. En este sentido los grados de inhibición provocados por la presencia de Ne E en concentraciones de 7.7, 15.4, 23.1 y 30.5 mg ml-1 de medio PDA variaron desde 68.52 ± 11.56% a 76.67 ± 7.28% (Figura 3). Para el caso de nanoemulsiones conteniendo aceite de neem comercial (NeC), los niveles de inhibición alcanzados cuando éstas se encontraban en concentraciones de 15.4, 23.1, 30.5 y 38.5 mg ml-1 variaron de 68.40 ± 3.01% a 76.71 ± 3.93%. Los anteriores niveles de inhibición fueron significativamente superiores a los alcanzados cuando dichas Ne C se encontraban en el medio a una concentración de 7.7 mg ml-1 (Figura 3).
Figura 1 Efecto de las diferentes interacciones conformadas por las variables concentración de aceite, relación aceite:emulsificante y valores de HLB en el tamaño de glóbulo obtenido en las nanoemulsiones.
Figura 2 Crecimiento de Aspergillus niger en medio PDA después de 72 horas de incubación a 25 °C. (a) Tratamiento testigo; (b) Tratamiento con incorporación de NeC (23.1 mg mL-1); (c) Tratamiento con incorporación de NeC (38.5 mg mL-1)
Figura 3 Nivel de inhibición alcanzado por nanoemulsiones preparadas con aceite de neem comercial (NeC), aceite de neem extraído (NeE), así como de los aceites de neem comercial (AC) y extraído (AE) sin nanoemulsificar. Comparación entre valores medios derivados de diferentes concentraciones evaluadas dentro del mismo tipo de aceite o nanoemulsión y que no comparten alguna letra minúscula son significativamente diferentes (p < 0.05). Comparación entre valores medios derivados del empleo de diferente tipo de aceite o nanoemulsión considerando la misma concentración y que no comparten alguna letra mayúscula son significativamente diferentes (p < 0.05).
Al considerar el grado de inhibición generado por los aceites de neem sin nanoemulsionar (AC y AE) se encontró que los mayores niveles alcanzados correspondían al AE en concentraciones de 23.1 y 30.8 mg ml-1 (55.56 ± 0.04% y 66.67 ± 0.10%, respectivamente) (Figura 3). Los valores anteriores son significativamente superiores a los encontrados cuando el AE se encontraba en el medio a 7.7, 15.4 y 38.5 mg mL-1 o bien, cuando se empleó a AC en todas las concentraciones evaluadas (Figura 3).
Al comparar los niveles de inhibición generados por los aceites de neem sin nanoemulsionar (AC y AE) en comparación con su correspondiente contraparte nanoemulsionada (NeC y NeE) se observa un incremento significativo en el grado de inhibición en el desarrollo de A. niger en el medio PDA por efecto de la nanoemulsificación de los aceites (Figura 3).
Discusión
Muchos frutos durante su almacenamiento y comercialización son generalmente afectados por una gran variedad de microorganismos que ocasionan daño irreversible en ellos. En el caso de los frutos de la papaya se han identificado como responsables de daño a una serie de complejos fúngicos en los que destacan algunas especies como Alternaria alternata, Aspergillus niger, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Penicillium digitatum y Rhizopus stolonifer (Bautista-Baños et al. 2013, Lucas-Bautista et al. 2019). En el presente estudio, el microorganismo aislado e identificado en un fruto de papaya con daño correspondió a Aspergillus niger, concordando con lo reportado en las investigaciones previamente citadas. En este contexto, extractos derivados de diferentes partes del árbol de neem (hojas, frutos y semillas) han demostrado actividad antifúngica frente a diferentes hongos fitopatógenos, incluyendo Aspergillus niger. Extractos de hojas de neem han demostrado una efectividad variable y dependiente de la concentración del extracto empleada (Razzaghi-Abyaneh et al. 2005, Raja et al. 2013, Hussain et al. 2015, Keta et al. 2019). Por otro lado, en el caso del aceite de neem se ha reportado una reducción del crecimiento micelar del 84% para Aspergillus parasiticus cuando se empleó aceite al 0.5% y reducciones del 52 y 36% cuando se usó al 0.2 y 0.1% respectivamente (Gowda et al. 2004). Lo anterior, contrasta con lo reportado por Rodrigues et al. (2019), quienes reportan una inhibición del crecimiento micelar de Aspergillus carbonarius del 82.5% cuando empleó aceite de neem al 0.1%, incrementando la actividad antifúngica al 97.6% al usar aceite al 0.3%. No obstante, concentraciones de aceite del 0.5 y 1.0% generaron solo el 40.2 y 64.7% de inhibición. Los investigadores atribuyen lo anterior a que posiblemente, concentraciones de aceite de neem por arriba del 0.5% exceden los límites de solubilidad de éste en el medio, lo que limita su actividad antifúngica. En el presente estudio, un fenómeno similar se aprecia para el caso del aceite de neem extraído (AE, Figura 3). Sin embargo, el aceite de neem extraído y preparado en forma de nanoemulsión (NeE), usando formulación óptima, mostró un incremento significativo en el grado de inhibición frente a A. Niger (Figura 3). Lo anterior, podría deberse al mayor grado de dispersión y bio-accesibilidad que el aceite de neem alcanza al encontrarse en forma de nanoemulsión. Lo encontrado en el presente estudio es de importancia ya que plantea una mejora sustancial en la actividad antifúngica del aceite de neem al emplearla en forma de nanoemulsión. En el aceite de neem coexisten diversos compuestos los cuales podrían ser responsables de la actividad antifúngica antes indicada. Sin embargo, su presencia puede variar dependiendo de diferentes factores de procesamiento o almacenamiento que pueden favorecer la disminución de su presencia en el aceite. Lo anterior explicaría la menor actividad inhibitoria del aceite de neem adquirido comercialmente (AC) en comparación con el aceite recién extraído de las semillas de neem (AE) (Figura 3). En este contexto Zeringue et al. (2001) reportaron que los compuestos volátiles emitidos a 30 °C desde aceite de neem clarificado, mostraban una mayor inhibición en el desarrollo de Aspergillus spp. en comparación con la generada por la sola adición del aceite al medio de cultivo.
La preparación de nanoemulsiones estables involucra el control de la composición y proporción de los ingredientes que las conforman, así como de las condiciones de operación consideradas durante su preparación (Mushtaq et al. 2023). En este sentido, el efecto de los componentes de una formulación sobre las principales propiedades de las nanoemulsiones (tamaño de glóbulo, DPI y potencial Z) tiene gran influencia (Qian y McClements 2011). En el presente estudio, la concentración de aceite y la RAE mostraron importante efecto sobre el tamaño de glóbulo, lo cual concuerda con lo reportado por diferentes investigaciones en donde se plantea que el tamaño de glóbulo alcanzado es directamente proporcional a la concentración de aceite en la emulsión (Ullah et al. 2022). Lo anterior, se observa de forma clara cuando la RAE es de 1:5 o 1:4 (Figura 1a). Esto último se atribuye a que durante el proceso de emulsificación las partículas de aceite compiten entre ellas por el agente emulsificante, el cual generalmente se encuentra en cantidad limitada. De esta manera, los glóbulos pequeños que son formados, al no contar con suficiente agente emulsificante coalescen favoreciendo la formación de glóbulos más grades e incrementando el tamaño de glóbulo promedio en la emulsión (Cinar 2017, Pavoni et al. 2020). No obstante, lo anterior, cuando las RAE evaluadas fueron del orden de 1:1 o 1:2, concentraciones de aceite en el medio menores al 3% generaron tamaños de glóbulo mayores que concentraciones de aceite mayores al 6%. Lo anterior puede ser debido a que la mayor cantidad de emulsificante, en comparación con la de aceite, provoca la formación de multicapas de emulsificante alrededor de los glóbulos, promueve la floculación de los glóbulos o bien la formación de agregados de emulsificante (Qian y McClements 2011, Ochoa et al. 2016).
El empleo del adecuado surfactante influye directamente en la estabilidad de la emulsión, siendo atractivo el uso de mezclas de algunos de ellos debido a los diferentes mecanismos y sus interacciones, lo que favorece la estabilidad de las emulsiones (Hong et al. 2018). En general los surfactantes no iónicos contienen grupos hidrofílicos y lipofílicos cuyo balance es expresado en valores de HLB (Balance hidrofílico lipofílico). Los valores de HLB están relacionados con su solubilidad en agua, de esta manera, valores bajos (4 a 9) indican emulsificantes lipófilos y valores altos (11 a 18) emulsificantes hidrófilos (Chiang et al. 2023). En general, para formar emulsiones del tipo aceite en agua se emplean emulsificantes con valores de HLB altos, mientras que para emulsiones agua en aceite valores bajos (Chiang et al. 2023). En el presente estudio, el aumento en los valores de HLB de la mezcla de emulsificantes empleadas favoreció la formación de tamaños de glóbulo más pequeños (Figura 1b y 1c). Lo anterior coincide con lo reportado por Hong et al. (2018), quienes empelando mezclas de los emulsificantes Span 80 y Tween 80 (con diferentes valores de HLB) observaron la formación de emulsiones monodispersas, con menor tamaño de glóbulo, cuando los valores de HLB fueron de 12.6; en contraste con la formación de emulsiones multidispersas, con mayores tamaños de glóbulo, cuando la mezcla de emulsificantes tenía un HLB de 8.9.
La metodología de superficie de respuesta, desde su introducción, ha sido empleada como una técnica estadística multivariada en diversos estudios de optimización, en donde el efecto de diferentes variables independientes (y sus interacciones) sobre diferentes variables de respuesta se desea conocer. Esta técnica estadística permite generar modelos matemáticos a partir de los cuales es posible identificar condiciones que generen valores óptimos en alguna de las variables de respuesta (Samiun et al. 2020). En la Tabla 3, se muestran los coeficientes de regresión estimados para el modelo polinomial de segundo orden generado para cada una de las variables de respuesta consideradas (Tamaño de glóbulo, PDI y Potencial Z). Con el modelo generado para el tamaño de glóbulo, se procedió a identificar los valores de las variables independientes que definen el modelo (A, RAE y HLB) con los que se obtuvieran tamaños de glóbulo entre 30 y 60 nm. En este sentido, las condiciones encontradas correspondieron a valores de 8.21% para A, 1:3.28 para RAE y 16.22 para HLB, con lo cual el modelo predecía un tamaño de glóbulo de 32 nm. Al preparar nanoemulsiones bajo dichas condiciones, los valores de tamaño de glóbulo alcanzados fueron de 59.99 ± 2.16 nm. Como puede apreciarse el valor alcanzado se encontraba dentro del rango deseado, por lo que se decidió continuar con el estudio considerando dichas condiciones y definiéndolas como formulación óptima (F Opt).
Una nanoemulsión estable debe mantener su tamaño de glóbulo durante largos periodos de tiempo. En el presente estudio la formulación identificada como óptima (F Opt) se mantuvo estable a lo largo de 365 días de almacenamientos a 4 °C, conservando su tamaño de glóbulo sin cambio significativo (Tabla 4). Así mismo, no se apreció visualmente indicios de floculación, cremado o sedimentación. Esta estabilidad puede explicarse en función de los valores de PDI y potencial Z alcanzados, 0.12 ± 0.001 y -16.80 ± 1.7, respectivamente. El PDI en una nanoemulsión se relaciona con la calidad del proceso de emulsificación, considerando la homogeneidad de la emulsión. En este sentido, su resistencia al cremado, dependerán de la homogeneidad del tamaño de glóbulo (PDI). En este contexto, se ha planteado que nanoemulsiones con valores de PDI menores o cercanos a 0.1 se consideran altamente monodispersas, adecuadas y con una suspensión coloidal de buena calidad; nanoemulsiones con valores de PDI entre 0.10 y 0.40 se consideran moderadamente dispersas; aquellas con valores mayores a 0.40 son consideradas altamente dispersas. Mientras que valores cercanos a 1 indicarían emulsiones de muy pobre calidad (Ochoa et al. 2016, Ullah et al. 2022). Por otro lado, la intensidad del potencial Z es otra característica que se relaciona con la estabilidad de las nanoemulsiones. Se ha reportado que valores de potencial Z menores a -30 mV corresponden a nanoemulsiones estables debido a que las fuerzas de repulsión eléctrica generada entre los glóbulos son predominantes. Mientras tanto, valores de entre -5 mV y -15 mV representarían una zona de floculación limitada (Heurtault et al. 2003). Los valores de intensidad de potencial Z alcanzados en la F Opt fueron de -16.80 ± 1.7 mV. Este valor de potencial Z ubica a la F Opt muy cerca de la región de floculación limitada. Sin embargo, mecanismos de estabilización estérica ocasionado por el agente surfactante empleado podrían estar colaborando en la estabilidad observada en la nanoemulsión. En este sentido se ha planteado que para que una nanoemulsión alcance estabilidad se requiere un potencial Z menor a -9 mV en combinación con la estabilidad estérica generada por el surfactante empleado (Heurtault et al. 2003).
Conclusiones
Nanoemulsiones estables, constituidas por aceite de neem extraído de frutos, los emulsificantes Tween 20/Span 20 y agua fueron altamente efectivas en inhibir In vitro el crecimiento de Aspergillus niger, en contraste con el empleo de aceite de neem no nanoemusionado. De esta manera, el uso de nanoemulsiones a base de aceite de neem representa una alternativa prometedora en el control del deterioro poscosecha en frutos ocasionada por Aspergillus niger.
