Recolección y procesamiento de tejido vegetal

De enero de 2020 a enero de 2021, se recolectaron en seis huertos comerciales de guanábana en Nayarit (Tabla 1), secciones de raíce de dos árboles por huerto con los siguientes síntomas: aparente muerte descendente, defoliación, manchas necróticas y exudados en tallos. Las muestras se colocaron en bolsas de papel Kraft (31 × 15.5 cm) y, dentro de una hielera a temperatura ambiente, se trasladaron al Laboratorio de Parasitología Agrícola del Centro Multidisciplinario de Investigación Científica (CEMIC 03) de la Universidad Autónoma de Nayarit (UAN), en donde se almacenaron a 4 °C hasta su procesamiento.

Las muestras de raíz recolectadas se enjuagaron con agua potable y se sometieron a desinfección superficial con hipoclorito de sodio (NaClO) al 3% por 30 s, seguido por dos lavados con agua destilada estéril (^{Huaman et al. 2015}). Se secaron en toallas de papel estériles, se obtuvieron cuatro trozos de 2 cm³ por muestra y se sembraron de manera equidistante en placas de Petri (90 × 15 mm) con los medios de cultivo V8 agar (V8 HERDEZ®) y papa dextrosa agar (PDA), posteriormente, fueron incubadas a 24 ± 2 °C sin luz en una cámara bioclimática (NOVATECH Ei45). Tres días después, de los hongos aislados, se realizaron cultivos monospóricos y siembras por punta de hifa, mismas que se mantuvieron a 24 ± 2 °C (^{Valle et al. 2021}). Finalmente, los hongos puros, se identificaron morfológicamente con microcultivos en portaobjetos con lactofenol, y se visualizaron en un microscopio óptico Leica® (modelo DME 13595XXX) con los objetivos 40 X y 100 X (^{Rosado et al. 2020}), y se utilizaron las claves taxonómicas de ^{Watanabe (2002)}. Los aislamientos fúngicos obtenidos, se conservan el cepario del CEMIC 03.

Pruebas de patogenicidad en árboles de guanábana

De los hongos obtenidos de las raíces de árboles de A. muricata con síntomas de pudrición, se eligió un aislado fenotípicamente igual de cada género para probar su patogenicidad. Se utilizaron árboles de guanábana de un año de edad, previamente sembrados a partir de semillas de frutos de los genotipos de Compostela y San Blas, en bolsas para vivero de 25 × 30 cm con una mezcla 1:1:1 de sustrato (SUNSHINE®), perlita (AGROLITA®) y suelo estéril. En traspatio con malla sombra, se inocularon 10 árboles con cada uno de los aislados seleccionados. A cinco, se les realizó un corte (con bisturí estéril) en forma de bisel a una profundidad aproximada del 40% del diámetro del tallo en la base del mismo, mientras que al resto de los árboles no se les causó lesión. En seguida, se inocularon con un disco de 6 mm de diámetro de PDA con micelio del hongo con seis días de crecimiento en la base del tallo. Como testigo se utilizó el mismo número de árboles (con y sin lesión) a los cuales, se les colocó en la base del tallo un disco de PDA estéril. El área inoculada se envolvió a presión con PARAFILM® (^{De Oliveira et al. 2016}, ^{Ángel et al. 2018}).

Los árboles se regaron cada tercer día a capacidad de campo (^{Almaraz et al. 2016}), y se revisaron cada semana por cinco meses para registrar síntomas típicos por infección fúngica (^{De Oliveira et al. 2016}, ^{Ruiz et al. 2017}). Por otra parte, los hongos que se consideraron patogénicos, se inocularon en conjunto en el mismo número de árboles de guanábana. Además, para corroborar que el microorganismo inoculado inicialmente fue el causante de la enfermedad, se realizó un re-aislamiento en medio de cultivo PDA y su identificación morfológica.

Identificación de los patógenos causantes de la pudrición de raíz de guanábana

A los hongos que resultaron positivos a las pruebas de patogenicidad, se les extrajo el ADN genómico (ADNg) con la metodología de ^{Bobadilla et al. (2020)}. El ADN se utilizó para amplificar el espaciador transcrito interno (ITS4 e ITS5) del rADN con los cebadores universales ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) e ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’). En el caso de Fusarium sp., también se amplificó el factor de elongación de la traducción (TEF 1-α) con los cebadores Ef1α (5’-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3’) y EF2 (5’-GGAGGTACCAGTGCATCATGTT-3’) (^{Ruíz et al. 2017}, ^{Henao et al. 2018}). La detección de los productos del PCR se realizó con electroforesis submarina en gel de agarosa al 1.5% por 110 min a 80V. Para verificar el tamaño de los fragmentos obtenidos, se utilizó el marcador de peso molecular de 1 kb (Invitrogen por Thermo Fisher Scientific®. Se observaron los fragmentos obtenidos en un transiluminador de mesa (UVP 95-0428-02) (^{Salazar et al. 2016}). Los productos del PCR fueron secuenciados por la empresa Macrogen en Beotkkotro, Geumcheongu, Seoul (Gasandong, World Meridian I), Corea, y las secuencias obtenidas se ensamblaron y compararon con las disponibles en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), con la herramienta BLAST para obtener las secuencias altamente similares. En el caso de las secuencias de Fusarium sp., se ensamblaron y compararon con las disponibles en la base de datos FUSARIUM-ID v.3.0 (^{Torres et al. 2022}).

Síntomas de pudrición de raíz de árboles de guanábana

Los árboles observados en campo evidenciaban defoliación parcial o total, ramas con apariencia seca en la copa que aparentemente mueren de forma descendente, ocasionalmente se observaron árboles con manchas necróticas y exudados en el tallo (Figura 1).

Figura 1 Síntomas de árboles de Annona muricata muestreados en campo con apariencia enferma. a) Árbol con muerte descendente, b) Árbol con mancha necrótica en tallo, c) Raíz con pudrición, d) Árbol con apariencia sana. 

Sobre lo mismo, en el cultivo de Annona cherimola Mill., Dactylonectria macrodidyma causa una necrosis que se extiende desde la corteza, hasta la médula en las partes enfermas de las plantas, coloración negra en la madera, así como rayas negras en el tejido vascular y reducción de la biomasa de la raíz, con lesiones radiculares hundidas y necróticas (^{Auger et al. 2015}). Por otra parte, hongos como L. theobromae, en cultivos como las moras (Morus alba L.), causan afectaciones en xilema y la corteza de las raíces, en consecuencia, las raíces se tornan oscuras y el follaje se marchita, pero queda adherido a la planta por al menos tres semanas, mientras que, el tallo y las ramas mueren después de un mes de haberse infectado (^{Xie et al. 2014}).

Identificación de microorganismos asociados a raíces con pudrición de Annona muricata

De las 713 secciones de raíz de guanábana con pudrición que fueron sembradas in vitro en PDA, se identificó a los géneros de hongos Fusarium en 311 secciones de raíz, Lasiodiplodia con una aparición en 182 secciones, Aspergillus en 16 secciones de raíz, Penicillium y Rhizopus en 15 y 9 secciones, respectivamente. Cabe mencionar que Fusarium y Lasiodiplodia se encontraron asociados en la misma sección de raíz en algunas de las muestras de tejido procesadas. Al respecto, en el cultivo de guanábana, especialmente en el fruto, se asoció a los hongos Lasiodiplodia sp., Cladosporium sp., Rhizopus sp., Penicillium sp., Aspergillus sp. y Fusarium sp., posiblemente con un comportamiento de hongos saprófitos (^{Cambero et al. 2019}).

Pruebas de patogenicidad

Los hongos Aspergillus, Rhizopus y Penicillium, no indujeron pudrición de raíz en árboles de guanábana, sin embargo, se observó el 100% de patogenicidad con Fusarium sp. sólo en árboles con lesión, induciendo necrosis en raíz y tallo; a partir de la zona de inoculación, la necrosis se extendió al tallo a una altura de 7 a 15 cm, y se extendió a la raíz principal de 3.5 a 6 cm a partir de la lesión. La necrosis mostró manchas cafés claro con ligeros tonos negros distribuidas por el córtex y cilindro vascular, lo que puede afectar la medula, el xilema y floema. Al respecto, especies como F. oxysporum Schl. y F. solani Mart., causan pudrición radical, amarillamiento de hojas, marchitez y necrosis apical (^{Olalde et al. 2020}). Por otra parte, ^{Herrera et al. (2017)}, el cultivo de Jatropha curcas L., identificaron a F. solani como causante de pudrición en raíces, marchitez y necrosis de tejido vascular, y a F. equiseti como agente causal de necrosis y muerte descendente de tallos.

Por otra parte, Lasiodiplodia sp. fue 100% patogénico en árboles de guanábana con herida, la necrosis en el tallo avanzó hasta 13.1 cm, mientras que en la raíz principal la necrosis recorrió hasta 15 cm, además de causar pudrición en algunas raíces secundarias. La pudrición implicó el daño del córtex y cilindro vascular; se manifestó una necrosis con color negro intenso, y el avance de la lesión se mostró de color café claro. Al respecto, en el cultivo de A. cherimola L. se identificó a L. theobromae como causante de la muerte regresiva, este patógeno provoca decoloración característica y lesiones necróticas a partir de las ramas apicales, los tallos exhiben oscurecimiento y vetas vasculares de la madera desde el punto de inoculación (^{Wang et al. 2022}).

Además, al inocular a ambos aislados fúngicos (Fusarium y Lasiodiplodia) juntos en árboles de A. muricata, se presentó 100 % de patogenicidad con herida y el avance de la necrosis a partir de la zona infectada con dirección al tallo fue de 3 a 12.5 cm y, de 3.1 a 8.8 cm hacia la raíz principal. En una investigación realizada por ^{Khanzada et al. (2004)} en el cultivo de mango Mangifera indica L., al inocular en la base del tallo a F. solani y L. theobromae, se observó enfermedad en partes aéreas y subterráneas, que al mismo tiempo expresan una muerte en declive con síntomas como sequedad de ramas, exudados gomosos en tallo, así como necrosis en tejidos vasculares, similar a lo observado en los huertos comerciales de guanábana de Nayarit.

Identificación morfológica y molecular de patógenos de raíz de guanábana

El hongo Fusarium sp., presentó micelio algodonoso con tonos ligeramente amarillentos, el medio de cultivo se tornó de color amarillo-salmón. El micelio fue septado, delgado, con microconidios y macroconidios ligeramente curvados, en forma de canoa (^{Watanabe 2002}). En lo que respecta a Lasiodiplodia sp., presentó colonias medianamente densas, micelio aéreo joven de color blanco con cambio a gris-olivo a los siete días que con el paso del tiempo se tornan color negro intenso. Los conidióforos son hialinos, pero se tornan color café oscuro una vez maduros, los conidios son subovoides, tienen ápices redondeados que se estrechan para truncar la base, misma que es más ancha a mediados del tercio superior con paredes gruesas, los conidios inmaduros son hialinos, pero al madurar se tornan color café oscuro y cuentan con un septo (^{Picos et al. 2015}).

En el análisis electroforético, se observaron fragmentos de 600 pb para ITS y TEF 1-α (Figura 2), por otra parte, de acuerdo con las secuencias genómicas, al compararse con aquellas disponibles en la base de datos del NCBI, los patógenos causantes de la pudrición de raíz en árboles de A. muricata en Nayarit fueron Fusarium falciforme (Hypocreales: Nectriaceae) y Lasiodiplodia theobromae Griffon & Maubl. con similitudes del 99.8 y 100% respectivamente. Los genes ITS y TEF1α, permitieron obtener los amplicones esperados, fragmentos entre 500-700 pb (^{Valle et al. 2019}). Diversos autores han reportado e identificado molecularmente diferentes especies de Fusarium como patógenos de raíz en manzano (Malus domestica Borkh.) (^{Ruiz et al. 2017}), naranjo (Citrus sinensis L.) (^{Parra et al. 2019}) y chile chilaca (Capsicum annuum L.) (^{Reyes et al. 2019}). Particularmente, a F. falciforme se le ha reportado como fitopatógeno en algunos cultivos, como el frijol silvestre (Phaseolus vulgaris L.) donde provoca marchitez (^{Díaz et al. 2021}), en crisantemos (Chrysanthemum sp.) causa pudrición de la raíz (^{Thao et al. 2021}) y en papaya (Carica papaya L.) origina pudrición de raíces y tallos (^{Vega et al. 2019}). Por otra parte, a L. theobromae, se le considera un patógenos cosmopolita, cuenta con un gran número de hospederos de cultivos de importancia agrícola como el cacao (Theobroma cacao L.), aguacate (Persea americana Mill.), M. indica, cítricos, C. papaya (^{Moreira et al. 2021}) y recientemente se le identificó como causante de muerte descendente en A. muricata (^{Betancourt et al. 2024}).

Figura 2 Análisis electroforético de ADN de Fusarium falciforme y Lasiodiplodia theobromae en agarosa al 1.5%. a) Amplificación de fragmento de 600 pb mediante PCR con iniciadores ITS4 e ITS5, b) Amplificación de fragmento de 600 pb mediante PCR con iniciadores Ef1α y EF2. Fu = F. falciforme. La = L. theobromae 

Debido a los resultados obtenidos en este estudio, se puede inferir que F. falciforme y L. theobromae son los patógenos responsables de la pudrición de raíz en guanábana tanto individual como en combinación; a su vez, estos son reportados por primera vez en Nayarit y en México como patógenos de raíz de A. muricata.