Introducción

La micropropagación se refiere a la propagación asexual o clonación in vitro de plantas, utilizando técnicas de cultivo in vitro de CTV. Estas técnicas son una herramienta de la biotecnología vegetal que permite la conservación, manipulación, saneamiento y clonación de plantas bajo condiciones artificiales, controladas y asépticas (^{Ramírez-Mosqueda et al., 2020}). La clonación in vitro es una alternativa para la producción de plantas genéticamente homogéneas, vigorizadas, libres de plagas y enfermedades. Esto se logra cultivando los tejidos en un medio artificial rico en nutrimentos y compuestos orgánicos para su multiplicación en condiciones de laboratorio.

En la actualidad, la micropropagación de plantas cuenta con un gran potencial productivo; siendo explotada en laboratorios comerciales y de investigación, principalmente para la propagación de plantas ornamentales, de importancia agroalimentaria y forestal. Sin embargo, durante las etapas de la micropropagación pueden ocurrir problemas asociados con la contaminación y problemas relacionados con la acumulación de etileno en los recipientes de cultivo (^{Aragón et al., 2014}; ^{Bello-Bello et al., 2021}). Una alternativa para la solución a estos problemas es mediante el uso de bionanotecnología. La bionanotecnología es una ciencia que integra la biología y la nanotecnología para la producción, transformación y/o conservación desde biomoléculas hasta organismos utilizando nanomateriales (Figura 1).

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 1 Bionanotecnología: integración de la biología y la nanotecnología. 

La bionanotecnología ha permitido la aplicación de diferentes materiales a escala nanométrica (0-10 nm) como las nanopartículas de plata (NPsAg). Las NPsAg tienen aplicación para la eliminación de agentes microbianos contaminantes como los hongos y bacterias (^{Vázquez-Muñoz et al., 2017}; ^{Acharya y Pal, 2020}; ^{Crisan et al., 2021}; ^{Villarreal-Gómez et al., 2021}) y para disminuir los efectos de acumulación de etileno en los cultivos in vitro (^{Manh-Cuong et al., 2021}; ^{Tung et al., 2021a} y ^2021b). El uso de NPsAg en el CTV es parte del desarrollo de la bionanotecnología (^{Castro-González et al., 2019}; ^{Salama et al., 2021}). Las NPsAg tienen las ventajas de poseer un amplio espectro microbicida, no generan resistencia antimicrobiana, son fáciles de adquirir, no son toxicas a concentraciones adecuadas y son económicas en comparación con otros productos. Además, las NPsAg se han utilizado en plantas para inducir la germinación, aumentar el rendimiento de los cultivos y promover el desarrollo de los cultivos in vitro (^{Spinoso-Castillo et al., 2017}; ^{Castro-González et al., 2019}; ^{Manh-Cuong et al., 2021}; ^{Salama et al., 2021}; ^{Tung et al., 2021b}). Sin embargo, una de las desventajas es que debe evaluarse la concentración de las NPsAg para cada modelo de estudio, así como la citoxicidad en diferentes organismos y su posible afectación a microrganismos benéficos en el ambiente.

Algunos estudios en plantas se han enfocado en descubrir los efectos de las NPsAg sobre la actividad microbicida (^{Sarmast y Salehi, 2016}; ^{Spinoso-Castillo et al., 2017}; ^{Kale et al., 2021}), inhibición de etileno e inducción de hormesis bajo condiciones in vitro (^{Bello-Bello et al., 2017}; ^{Ramírez-Mosqueda et al., 2020}; ^{Hu y Xianyu, 2021}; ^{Manh-Cuong et al., 2021}; ^{Tung et al., 2021a}). La hormesis se caracteriza por estimular el desarrollo por bajas concentraciones e inhibición por concentraciones elevadas (^{Calabrese, 2008}; ^{Calabrese y Mattson, 2011}; ^{Calabrese et al., 2021}). Debido a la importancia que tiene la micropropagación, es importante estudiar los efectos que tienen las NPsAg para este sistema de producción in vitro de plantas. En esta revisión se describe el uso de las NPsAg como agente microbicida, inhibidor de efectos de etileno y como estimulador del desarrollo de las plantas en laboratorio.

Metodología para la sección bibliográfica

La búsqueda sistemática para esta revisión se realizó considerando artículos publicados en texto completo y en idioma inglés. También se consideraron artículos con estudios en plantas in vitro sobre actividad antimicrobiana de NP-sAg. Se incluyeron artículos de información científica en bases de datos como: Science Direct, PubMed y Web of Science. Las palabras clave utilizadas fueron: nanotecnología, nanopartículas de plata, biotecnología vegetal, cultivo in vitro y hormesis. Para la selección de artículos adecuados al tema, se revisaron los títulos y después la información que aporta el resumen, así como en los criterios de inclusión. La concentración de nanopartículas empleada en otros estudios fue utilizada para comparar la efectividad antimicrobiana y el efecto hormético en la micropropagación de plantas. Adicionalmente, se incluyeron artículos científicos, de divulgación y comunicaciones personales de los autores para interpretar de manera clara la difusión de este artículo.

Micropropagación de plantas

Para comprender las diferentes aplicaciones de las NPsAg durante la micropropagación de plantas es importante conocer las diferentes etapas de esta técnica de producción de plantas. La micropropagación es un proceso que consta de cinco fases o etapas básicas: 0) selección de la planta madre, 1) establecimiento, 2) multiplicación, 3) elongación y enraizamiento, y, 4) aclimatización (Figura 2). A continuación, se describen cada una de estas:

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 2 Etapas de la micropropagación: a) selección de la planta madre, b) establecimiento, c) multiplicación, d) elongación y enraizamiento y e) aclimatización. 

Fase 0: Selección de la planta madre. En esta etapa se incluyen dos aspectos fundamentales: la selección adecuada de la especie y pretratamientos de la planta madre. La selección consiste en la identificación taxonómica correcta de la especie, accesión, cultivo o variedad que se necesita para su establecimiento. El material vegetal de partida se llama explante, que puede ser cualquier parte de la planta, y proviene de una planta élite seleccionada. El pretratamiento de la planta madre consiste en el crecimiento de la planta en cuarentena bajo condiciones estrictas de sanidad para reducir los riesgos de contaminación.

Fase I: Establecimiento. El comienzo de los cultivos in vitro consiste en la selección del explante y asepsia del mismo para iniciar el cultivo aséptico en un medio de cultivo artificial. En esta etapa se requiere del uso de agentes químicos que garanticen la asepsia de los explantes como son: alcohol, hipoclorito de sodio, cloruro de mercurio, peróxido de hidrógeno, NPsAg, entre otros. El objetivo de esta etapa es establecer cultivos limpios y fisiológicamente viables para, posteriormente, iniciar el proceso de multiplicación.

Fase II: Multiplicación. El objetivo de esta fase es la producción del mayor número posible de brotes a partir de los propágulos establecidos. Los brotes deben multiplicarse durante un número definido de subcultivos para evitar posibles mutaciones y mantener un coeficiente de multiplicación estable a través del tiempo. En la fase de multiplicación, las NPsAg pueden tener un efecto hormético que promueva un mayor número de brotes por explante.

Fase III: Elongación y enraizamiento. En esta fase, los brotes obtenidos durante la etapa de multiplicación crecen hasta desarrollar un sistema radical y una altura adecuada que les permite ser transferidos a un sustrato en condiciones de invernadero para su aclimatización. Las NpsAg, también pueden inducir un desarrollo durante esta etapa.

Fase IV: Aclimatización. Los objetivos de esta fase son lograr la supervivencia de las plantas al momento del trasplante y el inicio del crecimiento bajo condiciones de invernadero. La aclimatización es importante para la rentabilidad de un sistema de micropropagación. Esto debido a que si las plantas no sobreviven se pueden llegar a tener cuantiosas pérdidas económicas.

Efecto microbicida de las NPsAg

La contaminación en la micropropagación de plantas puede deberse a microrganismos endófitos (habitan entre los tejidos de la planta), manipulación, tolerancia de microrganismos a la esterilización por calor en autoclave, resistencia a antibióticos y fungicidas. Los contaminantes in vitro pueden afectar el crecimiento de los explantes compitiendo por agua, luz, espacio y nutrimentos. La contaminación es un problema grave durante la micropropagación, ya sea a pequeña escala o de manera comercial. Una alternativa para eliminar los contaminantes son la utilización de NPsAg, las cuales en adecuadas concentraciones tienen la capacidad de eliminar hongos, bacterias y virus, sin ocasionar efectos que limiten el desarrollo de los explantes. Existen diferentes mecanismos de acción de NPsAg sobre los contaminantes: 1) la liberación de iones Ag+ genera estrés oxidativo y más adelante apoptosis o muerte celular; 2) el contacto directo de las NPsAg con las paredes celulares de los microrganismos ocasionando la destrucción de la integridad celular; 3) la generación de especies reactivas de oxígeno ocasiona daños en la estructura del ADN de los microrganismos (^{Juárez-Moreno et al., 2016}; ^{Guo et al., 2020}; ^{Hu y Xianyu, 2021}) e inhibe la replicación en virus (^{Almanza-Reyes et al., 2021}). Debido a su mecanismo de acción sobre algunos microrganismos, las NPsAg no generan resistencia a bactericidas y fungicidas, esta característica las convierte en una de las mejores alternativas para el control de la contaminación durante la micropropagación (^{Borrego et al., 2016}; ^{Vázquez-Muñoz et al., 2017}; ^{Villarreal-Gómez et al., 2021}). Las NPsAg pueden ser aplicadas de dos formas: durante la desinfección de explantes en una solución acuosa y/o agregadas al medio de cultivo. En la micropropagación, las NPsAg se han utilizado para disminuir la contaminación en pino (Araucaria excelsa R. Br.) var. Glauca, vainilla (Vanilla planifolia Jacks. ex Andrews), almendro x melocotonero (Prunus amygdalus L. x Prunus pérsica L.) y clavel (Dianthus caryophyllus L.) (^{Sarmast et al., 2011}; ^{Arab et al., 2014}; ^{Ahmadian et al., 2015}; ^{Pastelín-Solano et al., 2020}). Además, las NPsAg han tenido diversas aplicaciones, han sido utilizadas para la eliminación del virus causante de la fiebre del valle del rift (Rift Valley Fever Virus, RVFV) con una concentración de 12 µg mL^-1, inhibición de bacterias Gram negativas y Gram positivas como Escherichia coli y Staphylococcus aureus a una concentración mínima inhibitoria de 12 µg mL^-1, eliminación de Candida albicans con una concentración de 18 µg mL^-1, inhibición del crecimiento de microalgas (Rhodomonas sp.) con una concentración de 4 µg mL^-1 y de igual manera para líneas de células animal y líneas de células de cáncer en humano a concentraciones que van desde los 7.5 a 10 µg mL^-1 (HeLa: MDA-MB-231) (^{Vázquez-Muñoz et al., 2014} y ²⁰¹⁷; ^{Borrego et al., 2016}; ^{Castañeda-Yslas et al., 2021}).

En la Figura 3 se puede observar la inhibición del crecimiento del hongo Sordaria tomento-alba en PDA (agar papa y dextrosa) suplementado con diferentes concentraciones de NPsAg.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 3 Inhibición del crecimiento del hongo Sordaria tomento-alba en agar papa y dextrosa (PDA) suplementado con diferentes concentraciones de NPsAg después de 21 días de incubación: a) 0, b) 25, c) 50, d) 100 y e) 200 mg L^-1 de NPsAg. 

Reducción de efectos de etileno en los cultivos in vitro

El etileno (C₂H₄) es una hormona vegetal que se encuentra en estado gaseoso con actividad biológica a bajas concentraciones (^{Manh-Cuong et al., 2021}). En el CTV, en algunas especies, el etileno afecta el crecimiento y diferenciación de las células, tejidos y órganos durante la micropropagación (Figura 4).

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 4 Efectos del etileno in vitro sobre el tallo de estevia (Stevia rebaudiana B.); a) formación de callo en la base del tallo, b) abscisión de hojas hasta defoliación completa en plantas in vitro, c) formación de callo a lo largo del tallo y d) formación de callo en hoja. 

El papel del etileno en el CTV no está completamente dilucidado. En algunas especies como el arroz (Oriza sativa L.), rosa (Rosa hybrida L.) y ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv), el etileno in vitro promueve la regeneración de plantas (^{Da Costa y Sharma, 2016}; ^{Ngan et al., 2020}; ^{Manh-Cuong et al., 2021}). Sin embargo, especies como papa (Solanum tuberosum L.), estevia (Stevia rebaudiana B.), todas las especies de chile y algunos forestales, presentan alta sensibilidad a este gas. La adición de compuestos como cloruro de cobalto (CoCl₂) o nitrato de plata (AgNO₃), pueden inhibir la síntesis o percepción de etileno, respectivamente (^{Giridhar et al., 2004}). El AgNO₃ ha sido utilizado para contrarrestar los síntomas de etileno en plantas (^{Cardoso, 2019}; ^{Manh-Cuong et al., 2021}). En el CTV, se ha utilizado AgNO₃ para inhibir los efectos de este gas durante la embriogénesis somática (^{Fuentes et al., 2000}; ^{Giridhar et al., 2004}), inducción de brotes (^{Cardoso, 2019}) y enraizamiento in vitro (^{Steinitz et al., 2010}). Sin embargo, las NPsAg son una alternativa para inhibir la percepción de etileno durante el cultivo de tejidos vegetales en algunas especies (^{Thao et al., 2015}). El modo de acción mediante el cual las NPsAg reducen los efectos del etileno en cultivos in vitro se debe a la liberación de iones de plata que se unen a los receptores a etileno a través de la competencia con el ion de cobre (Cu+), el cual funciona como cofactor y que normalmente interactúa con el etileno en el citosol alrededor de las membranas externas del retículo endoplásmico para formar un complejo de etileno-cofactor (^{Rodriguez et al., 1999}; ^{Taiz et al., 2015}; ^{Park et al., 2016}; ^{Manh-Cuong et al., 2021}). Este cofactor de Cu+ es fundamental, al permitir la unión del complejo etileno-cofactor con el dímero de histidina quinasa del gen ETHYLENE RECEPTOR 1 (ETR1), el cual funciona como receptor primario de etileno y se encuentra incrustado en la membrana del retículo endoplásmico (^{Rodríguez et al., 1999}; ^{Taiz et al., 2015}; ^{Sarmast y Salehi, 2021}). Por lo tanto, esto permitiría el desarrollo de los explantes o plántulas dentro de los contenedores de cultivo sin presentar síntomas de etileno. Además, se ha demostrado que las NPsAg pueden ser agregadas al medio de cultivo sin requerir esterilización en autoclave (^{Tung et al., 2021b}). Esto permite la reducción de costos de energía ocasionados por esterilización. En la Figura 5 se observa el efecto de las NPsAg sobre el desarrollo in vitro de papa.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 5 Efecto de las nanopartículas de plata sobre el desarrollo in vitro de papa después de cuatro semanas de cultivo. a) 0, b) 25, c) 50, d) 100 y e) 200 mg L^-1 de NPsAg. 

Además de las NPsAg, algunas nanoestructuras y nanopartículas como el dióxido de silicio (SiO₂-NPs), cobre (Cu-NPs) y nanotubos de carbono (CNTs) pueden llegar a tener un efecto favorable sobre el desarrollo en plantas, también conocido como efecto hormético (^{Iavicoli et al., 2018}; ^{Acharya y Pal, 2020}; ^{Jalal et al., 2021}; ^{Sorcia-Morales et al., 2021}). Las plantas, para su óptimo desarrollo requieren pequeñas cantidades de metales esenciales (Fe, Mn, Zn, Cu, Mg, Mo y Ni) y no esenciales (Cd, Sb, Cr, Se), muchos de estos iones actúan como cofactores, que son necesarios para la acción de una enzima; sin embrago, la presencia en exceso puede conducir a una reducción o inhibición del crecimiento en plantas. La hormesis en las plantas puede ser inducida por factores físicos o químicos como irradiación, temperatura, gases, iones metálicos y herbicidas (^{Agathokleous et al., 2019}; ^{Jalal et al., 2021}).

Efecto hormético de las NPsAg durante la micropropagación

Además de sus propiedades antimicrobianas e inhibición de los síntomas de etileno, recientemente se ha demostrado que las NPsAg tienen gran influencia en la germinación, crecimiento y desarrollo de las plantas (^{Ma et al., 2010}; ^{Spinoso-Castillo et al., 2017}; ^{Hu y Xianyu, 2021}; ^{Tung et al., 2021b}). El efecto hormético o también llamado hormesis se caracteriza por estimular el desarrollo a concentraciones bajas e inhibición a concentraciones altas. El estímulo sobre el desarrollo depende de las características fisicoquímicas de las nanopartículas a utilizar como el tamaño, forma, agente estabilizante (recubrimiento) y concentración del metal (^{Agathokleous et al., 2020}; ^{Jalal et al., 2021}). Además, cada tipo de nanopartícula debe ser evaluada para cada especie de planta. Esto debido a que no se puede generalizar un efecto esperado de las nanopartículas a una concentración determinada. Se ha reportado que algunos tipos de nanopartículas pueden inducir hormesis en plantas (^{Spinoso-Castillo et al., 2017}). En trabajos previos a través de técnicas de CTV, se ha demostrado el efecto hormético en un rango de concentraciones de 25-200 mg L^-1 de NPsAg en especies como vainilla (V. planifolia), caña de azúcar (Saccharum spp.) y estevia (S. rebaudiana) (^{Spinoso-Castillo et al., 2017}; ^{Bello-Bello et al., 2017}; ^{Castro-González et al., 2019}). El efecto para estimular el desarrollo en estas especies se encontró en concentraciones de 25 a 50 mg L^-1 de NPsAg; mientras que el efecto de inhibición del desarrollo ocurrió en un rango de 100 a 200 mg L^-1 de NPsAg. En otras especies, concentraciones menores a 25 mg L^-1 de NPsAg han aumentado el crecimiento y diferenciación in vitro de pasto chino (Pennisetum alopecuroides L.), suculenta (Caralluma tuberculata R.Br.) y rosa (Rosa hybrida L.) var. Baby Love (^{Parzymies et al., 2019}; ^{Ali et al., 2019}; ^{Ngan et al., 2020}). En la Figura 6 se muestra el efecto de las NPsAg sobre la multiplicación in vitro de vainilla (V. planifolia).

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 6 Efecto de las NPsAg sobre la multiplicación in vitro de vainilla (V. planifolia) después de 30 días de cultivo en un sistema de inmersión temporal cada 6 h. a) 0, b) 25, c) 50, d) 100 y e) 200 mg L^-1 de NPsAg. 

Discusión

El uso de la bionanotecnología contribuye a la solución de problemas relacionados con la producción, transformación y conservación de productos en la agricultura (^{Castro-González et al., 2019}; ^{Acharya y Pal, 2020}; ^{Hu y Xianyu, 2021}). De manera general, las NPsAg poseen un gran potencial para su uso en la agricultura; sin embargo, debemos considerar que el tamaño de partícula, forma, agente de recubrimiento, el tiempo de exposición, los niveles de agregación y la concentración de plata podría ocasionar efectos diferentes en plantas (^{Castro-González et al., 2019}; ^{Shaikhaldein et al., 2020}; ^{Jalal et al., 2021}). Además, es importante realizar la caracterización de las NPsAg utilizadas y estudiar los mecanismos de acción fisiológicos, bioquímicos y genéticos a nivel de nanopartículas en plantas. Así como analizar los posibles efectos genotóxico y citotóxico en plantas, debido a que las NPsAg de menor tamaño se internalizan en las células con efectos sobre la división y reparación celular (^{Panda et al., 2016}; ^{Bello-Bello et al., 2018}; ^{Castro-González et al., 2019}). Esto contribuye a determinar sus futuras aplicaciones para la elaboración de nanopesticidas, nanofertilizantes, nanorreguladores del crecimiento, y nanomateriales para mejorar la producción en la agricultura actual (^{Shang et al., 2019}; ^{García‐Sánchez et al., 2021}). La utilización de las NPsAg tiene gran potencial en el CTV para la sanidad vegetal, conservación in vitro de germoplasma, producción de metabolitos, mejoramiento genético biotecnológico y la micropropagación.

Conclusiones

Las NPsAg tienen aplicaciones en la micropropagación para reducir la contaminación de los cultivos in vitro, inhibir los efectos de etileno ocasionados por el cierre hermético de los recipientes de cultivo y promover el desarrollo durante la micropropagación, también conocido como hormesis. Además, las NPsAg tienen una aplicación potencial en agricultura para la eliminación de enfermedades causadas por virus, hongos y bacterias. Sin embargo, se requieren estudios sobre sus efectos genotóxico y citotóxico en plantas cuando son aplicadas a concentraciones elevadas y sus posibles efectos en microrganismos benéficos que habitan en el medio ambiente. Por último, el uso de las NP-sAg podría tener aplicaciones futuras al medio ambiente sobre la reducción de la contaminación del agua y suelo.