Materiales y reactivos

En todos los experimentos reportados se utilizó Sargassum spp. (sargazo) recolectado en Puerto Morelos, Quintana Roo (20° 50′ 44.1′′ N, 18 86° 52′ 35.5′′ O), en junio de 2020. El sargazo se lavó varias veces con agua destilada para eliminar la arena y otras impurezas; se secó en un horno de convección a 50 ºC durante 6 horas y después se almacenó a 4 ºC, en bolsas oscuras de plástico para protegerlo de la luz, hasta su posterior uso.

La sal precursora fue ácido cloroaúrico de grado analítico (HAuCl₄∙3H₂O, 99, 995% de base metálica) adquirida de Sigma-Aldrich. Para la preparación del buffer de Sorensen, se mezcló una proporción adecuada para obtener una solución de pH 7 de dihidrógeno fosfato de sodio (NaH₂PO₄, reactivo ACS, < 99%) y fosfato de sodio (Na₂HPO₄, reactivo ACS) 0.2 M. Los reactivos se adquirieron de Macron Fine Chemicals TM. Además, para la determinación electroquímica, se adquirió cloruro de mercurio (II) (reactivo ACS, > 99.5%) de Sigma Aldrich. Todos los extractos, soluciones y diluciones fueron preparados con agua desionizada.

Preparación del extracto de Sargassum spp. y síntesis verde de nanopartículas

El extracto de Sargassum spp. se preparó mediante un método de infusión. El sargazo previamente almacenado se molió utilizando una licuadora de uso doméstico, hasta obtener un polvo fino, el cual fue homogeneizado utilizando un tamiz de malla 40.

Para la preparación del extracto se colocaron dos gramos del polvo de sargazo en un vaso de precipitados y se agregaron 50 mL de agua destilada. La mezcla se homogeneizó mediante agitación magnética a 80 ºC durante 90 minutos y, posteriormente, se dejó enfriar a temperatura ambiente. La fase líquida se separó por filtración utilizando papel filtro Whatman #41. El extracto obtenido se almacenó a 4 ºC en un vial ámbar hasta su posterior uso.

La síntesis de nanopartículas de oro (NPs-Au) consistió en mezclar la solución precursora (HAuCl₄) con el extracto de sargazo (Figura 1). La concentración de la solución precursora y el volumen de extracto fueron los parámetros experimentales evaluados. En primer lugar, se varió la concentración de la solución de HAuCl₄ en 3 mM, 5 mM y 7 mM; el volumen de extracto y precursor utilizado inicialmente fue de 1 mL para los tres experimentos. En el segundo parámetro evaluado, el volumen de extracto se varió en 0.25 mL, 0.5 mL y 0.75 mL contra 1 mL de solución de HAuCl₄ a 7 mM.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 1 Esquema de preparación de las NPs-Au utilizando extracto de sargazo como agente reductor. 

Caracterización de NPs-Au

Las NPs-Au se caracterizaron por diferentes técnicas. El análisis de espectroscopía ultravioleta-visible (UV-Vis) se realizó utilizando un espectrofotómetro UV-6000 (METASH Instruments Co. Ltd., Shanghai, China) para determinar la presencia de nanopartículas. Los espectros se registraron desde 300 nm hasta 800 nm usando celdas de cuarzo. La naturaleza cristalina y el tamaño del cristal se evaluaron por difracción de rayos X empleando un difractómetro Ultima IV (Rigaku Corporation, Tokio, Japón). La radiación utilizada fue Cu Kα, y el rango de 2θ grados fue desde 20 hasta 80º. La morfología y el tamaño de partícula se analizaron en un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo frío SU8230 (Hitachi Ltd., Tokio, Japón) con un voltaje de aceleración de 1 kV. Finalmente, se sugirieron los compuestos orgánicos involucrados en la reducción y estabilización de NPs-Au con base en los enlaces determinados por la técnica de espectroscopía FT IR utilizando un espectrómetro Spectrum Two FT-IR (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA).

Desarrollo y caracterización del sensor de Hg²⁺ base CNT-SPE + NPs-Au

Las mediciones electroquímicas se realizaron utilizando un conector boxer como interfaz entre los electrodos serigrafiados (SPE) y el potenciostato BioLogic VP-50 (Bio-Logic Science Instruments, Seyssinet-Pariset, Francia) utilizando ECLab como software de adquisición. Los electrodos de carbono serigrafiados (CNT-SPE, Tipo: 110-CNT), se compraron de DropSens (Oviedo, Asturias, España) y están constituidos por nanotubos de carbono de pared múltiple funcionalizados con grupos carboxilo (MWCNT-COOH). La celda electroquímica consta de MWCNT-COOH / Carbón, Carbón y Plata, como electrodo auxiliar y de referencia, respectivamente.

La superficie del electrodo de trabajo serigrafiada CNT-SPE se modificó primero mediante una activación/oxidación electroquímica (CNT-SPE/Ox) mediante voltamperometría cíclica de -1.0 V a +1.0 V a 100 mV/s durante 100 ciclos sobre una gota (50 μM) de ácido sulfúrico (H₂SO₄, 0.5M). Para agregar las NPs-Au, se realizó una modificación adicional utilizando el método de vaciado por gota (drop casting). Se colocó una gota de 20 microlitros de NPs-Au, con una concentración equivalente de 15 μg/μL (previamente dispersos por sonicación por 5 minutos) en el electrodo de trabajo, luego se protegió para evitar la contaminación por contacto con el aire, hasta secarse por 24 horas. El procedimiento tiene como objetivo generar en primera instancia fracciones hidroxilo, carbonilo y carboxilo los cuales se unen a los compuestos orgánicos que recubren las NPs-Au a través de enlaces de hidrógeno y/o enlaces covalentes. Un esquema del sensor descrito se muestra en la Figura 2.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 2 Esquema de oxidación y posterior modificación de electrodos con nanotubos de carbonoelectrodos serigrafiados (CNT-SPE) mediante la técnica drop-casting utilizando las NPs-Au obtenidas por síntesis verde usando extracto de sargazo para el montaje de un sensor para la detección y cuantificación de Hg²⁺. 

Para el análisis de detección de mercurio, se colocó una gota de 50 microlitros del buffer de Sorensen (pH = 7) en la superficie CNT-SPE con y sin NPsAu para registrar las respuestas de voltametría de pulso diferencial (DPV) y cíclica (CV). Los experimentos de DPV se realizaron a una velocidad de exploración de 5 mV/s y una amplitud de pulso de 70 mV en el rango de -0.2 a 0.4 V, para CV se usó una ventana de potencial de -1V a +1V por dos ciclos y 50 mV/s como velocidad de barrido, luego de eso, una muestra de Hg²⁺ disuelta en el buffer fue analizada. Se aplicaron estas condiciones para analizar las siguientes concentraciones de mercurio: 20, 25, 30, 35 y 40 µM; diluido en el buffer para crear la curva de calibración. Como muestra real, una cantidad conocida de agua destilada fue contaminada con mercurio y posteriormente diluida en el buffer de Sorensen para su análisis; se colocó una gota de 50 𝜇L de esta muestra sobre el sensor electroquímico y fue examinada bajo las mismas condiciones experimentales previamente descritas.

Caracterización de NPs-Au

Las nanopartículas de oro (NPs-Au) sintetizadas se caracterizaron mediante espectroscopía UV-Vis al exhibir una banda de absorción causada por el fenómeno de resonancia de plasmón superficial. Para NPs-Au, dicha banda está entre 500 y 600 nm. La posición, intensidad y forma de la banda se relacionan con el tamaño, la morfología y la concentración de las nanopartículas. La Figura 3a muestra los espectros UV-Vis de las NPs-Au sintetizadas con variaciones de la sal precursora (3, 5 y 7 mM). El tamaño promedio de las nanopartículas es similar en las tres muestras debido a que no se observan cambios significativos en la posición de las bandas. La Figura 3b muestra la relación existente entre el valor de absorbancia y la concentración de la sal precursora. Como se puede observar, a medida que aumenta la concentración de sal, también aumenta la intensidad de la banda de absorción, lo cual significa un aumento de la concentración de nanopartículas.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 3 a) Análisis por espectroscopía UV-Vis de las variaciones de la sal precursora y b) el cambio en la absorbancia al variar la sal precursora a una longitud de onda de 554 nm. c) Análisis por espectroscopía UV-Vis de las variaciones de volumen sal : extracto a 7mM y b) cambio en la longitud de onda y absorbancia de acuerdo con las variaciones de volumen sal : extracto. 

Otro parámetro experimental importante, es la cantidad o volumen de extracto de sargazo usado para la síntesis. Los resultados dependen directamente del tipo y composición del extracto. Hay algunos reportes en los que el aumento del volumen de extracto mejora las características de las nanopartículas (^{Singh et al. 2019}). Sin embargo, en muchos estudios se ha reportado un comportamiento contrario (^{Satpathy et al., 2020}; ^{Usman, Aziz y Noqta, 2019}). Es decir, el aumento en el volumen del extracto conduce a la síntesis de nanopartículas con varias morfologías y tamaños debido al mal control de la reacción. La Figura 3c muestra los espectros de las NPs-Au obtenidos variando el volumen de extracto de sargazo, donde se observan cambios en intensidad, pero más importante, cambios en longitud de onda. La Figura 3d muestra la relación que existe entre la variación de longitud de onda, absorbancia, y volumen de sargazo. Lo primero que se observa es que conforme se aumenta el volumen se presenta un corrimiento hipsocrómico, implicando que el tamaño de las partículas disminuye. Además, cuando el extracto de volumen se aumentó a 0.5 mL, la banda de absorción muestra un incremento significativo en la intensidad, el cual vuelve a disminuir cuando se utilizaron 0.75 mL, esto implica que 0.5 mL corresponde al volumen óptimo de síntesis; logrando así, a este volumen, la mayor eficiencia de la síntesis. Por tanto, se seleccionó la muestra correspondiente a las nanopartículas sintetizadas con 0.5 mL de extracto de sargazo para su posterior caracterización y análisis electroquímico.

La Figura 4 muestra el patrón de difracción de rayos X de las NPs-Au sintetizadas con extracto de sargazo. El difractograma muestra cuatro reflexiones ubicadas a 38.19º, 44.36º, 64.61º y 77.60º correspondientes a los planos (111), (200), (220) y (311), respectivamente. Estos picos fueron indexados con la tarjeta JCPDF 04-0784 y pertenecen al oro con una estructura cúbica centrada y el parámetro de red estimado fue de 4.07 nm, lo cual, está de acuerdo con los datos de estructura de oro reportados en la literatura. Se usó el diagrama de Williamson-Hall para estimar el tamaño de los cristalitos usando el FWHM de todos los picos de difracción. El tamaño medio de los cristales se estimó en 13.80 ± 1.79 nm. Estos resultados confirman la presencia de oro como única fase cristalina y el papel de los compuestos orgánicos del extracto de sargazo en las nanopartículas sintetizadas.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 4 Análisis por difracción de rayos X de las NPs-Au sintetizadas utilizando extracto de sargazo. 

El análisis FT-IR se llevó a cabo para determinar los compuestos orgánicos involucrados en la síntesis de NPs-Au. Los espectros del extracto (línea naranja), el sobrenadante obtenido después del lavado (línea verde) y de las NPsAu sintetizados (línea azul) se muestran en la Figura 5. A pesar de que las 3 señales son muy similares, las bandas muestran un claro cambio en intensidad.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 5 Análisis FT-IR de NPs-Au y extracto de sargazo antes y después de la síntesis de estas. 

El extracto de sargazo muestra varias bandas características relacionadas con compuestos fenólicos. La señal ubicada en 3240 cm^-1 corresponde al estiramiento O-H. Las bandas de 2920 cm^-1 y 1440 cm^-1 corresponden al estiramiento C-H y a la flexión C-H, respectivamente. Las bandas ubicadas en 1604 cm^-1 y 1498 cm^-1 corresponden a enlaces aromáticos C = O. Las bandas de 1360 cm-1 y 1319 cm^-1 están relacionadas con la flexión O-H, en los grupos alcohólico y fenólico, respectivamente. La banda alrededor de 1250 cm^-1 corresponde al estiramiento C-O en anillos aromáticos. La banda alrededor de 1035 cm^-1 está relacionada con el estiramiento CO-O-CO. Finalmente, las bandas de 894 cm^-1 y 800 cm^-1 se atribuyen a la flexión C = C.

El sobrenadante y las NPs-Au mostraron espectros relativamente similares, aunque presentan menos bandas y también diferentes intensidades entre ellos. Por ejemplo, la banda de 1182 cm^-1 es más clara en este espectro y corresponde a un estiramiento C-O. Asimismo, la intensidad de la banda presentada en 1706 cm^-1 aparece mientras la banda en 1604 cm^-1 tiene menor intensidad, ambas correspondientes al estiramiento C = O, debido a la interacción de un grupo aceptor de electrones como el oro o mediante enlaces intramoleculares de hidrógeno entre moléculas del extracto después de la reacción con la sal de oro, lo cual explica el porqué esta frecuencia es de mayor intensidad en el sobrenadante que en las NPs-Au. Por otro lado, la banda en 1498 cm^-1 correspondiente al enlace aromático C = O desapareció. Estos cambios confirman que los compuestos fenólicos del sargazo están involucrados en la reducción del oro y su estabilización, resultando en la formación de nanopartículas con un recubrimiento orgánico.

La Figura 6a muestra las micrografías SE-SEM del electrodo serigrafiado comercial de nanotubos de carbono (CNT-SPE) después de ser modificado y funcionalizado con las NPs-Au. La imagen muestra CNT entrelazados, cubiertos por una clase de película y en zonas específicas algunos aglomerados. Dichos aglomerados corresponden a cúmulos de NPs-Au. La Figura 6b muestra una imagen de colores formada por la mezcla de micrografías de electrones secundarios (SE-SEM) y electrones retrodispersados (BSE-SEM) realizadas sobre una muestra de NPs-Au. Es claro dentro de la micrografía que todas las nanopartículas están recubiertas por un compuesto orgánico (color verde) del extracto de sargazo, y las formas poliédricas de las nanopartículas (color rojo) se exhiben con mayor detalle, así como sus rangos de tamaño (entre 80 y 100 nm), como se muestra en el histograma de la Figura 6c.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 6 Micrografías de: a) electrones secundarios (SE); b) electrones retro dispersados más secundarios (BSE+SE) que muestran el tamaño y la morfología de las NPs-Au sintetizadas con extracto de sargazo, y, c) distribución del tamaño de las NPs-Au. 

Análisis para la detección de mercurio utilizando CNT-SPE/Ox+NPs-Au

En primera instancia se realizó una comparación entre el electrodo previamente oxidado/activado (CNT-SPE/Ox) y su modificación utilizando las NPsAu (CNT-SPE/Ox/Au). En la Figura 7a se puede observar la comparación de una solución de 30 µM de mercurio en ambos electrodos, CNT-SPE/Ox y CNT-SPE/Ox/Au, donde se muestra una diferencia notoria entre ambos análisis, al no existir ningún tipo de señal de oxidación o reducción cuando se utiliza el electrodo CNT-SPE/Ox; mientras que cuando se utiliza la modificación con NPs-Au (CNT-SPE/Ox/Au) se puede observar en el análisis claramente una señal de reducción, que corresponde a la presencia del oro.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 7 a) Voltamograma cíclico superpuesto a 30 μM de Hg²⁺ en CNT-SPE/Ox y CNTSPE/Ox/Au; b) voltamograma cíclico superpuesto de 30 μM de Hg²⁺ y de electrolito (buffer de Sorensen) en CNT-SPE/ Ox/Au. 

En la Figura 7b se muestra el análisis voltamperométrico por medio de voltametría cíclica (CV) de una solución de mercurio 30 µM y el blanco correspondiente a una solución del buffer de Sorensen. Se puede observar que en la solución de mercurio existe la ausencia de algunas señales de oxidación y reducción que se encontraban en el blanco, esto permite corroborar que las señales de reducción que se tienen en el análisis de mercurio corresponden a la reducción de la superficie de las NPs-Au que se encuentran en la modificación del electrodo CNT-SPE/Ox/Au.

Para corroborar las últimas observaciones, se realizó un análisis adicional por medio de la técnica de voltametría de pulso diferencial (DPV) a los electrodos CNT-SPE/Ox y CNT-SPE/Ox/Au utilizando la solución de 30 µM de mercurio como se puede observar en la Figura 8a.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 8 a) Voltamograma de pulso diferencial (DPV) superpuesto a 30 μM de Hg²⁺ en CNTSPE/Ox y CNT-SPE/Ox/Au, y, b) mecanismo propuesto para la formación de la amalgama. 

De la misma manera en que se podía observar en la gráfica de CV, existe una diferencia en el análisis de la solución de mercurio 30 µM debido a que, cuando el electrodo de nanotubos de carbono es únicamente oxidado (CNTSPE/Ox), tiene una señal ubicada en -167 mV y en el momento en que es modificado con las NPs-Au (CNT-SPE/Ox/Au), la señal descrita desaparece y se puede observar una nueva, en potenciales más positivos, con una mayor corriente, en -36 mV; esta señal, como se podrá observar más adelante, es proporcional a la concentración de la solución de mercurio; esto refuerza la idea de que la detección del mercurio se da, principalmente, a través de su interacción con la superficie de las NPs-Au reducidas, ya que el Hg²⁺ se transfiere desde la solución en bulto hacia el electrodo modificado (CNT-SPE/Ox/Au) difundiéndose en él y formando una amalgama como se puede ver en la Figura 8b.

Además, se realizó un análisis adicional de los procesos de superficie que ocurren en el electrodo mediante el estudio de exploración del efecto de la velocidad potencial. La Figura 9a muestra el voltamograma cíclico superpuesto a diferentes velocidades de barrido, en presencia de mercurio 30µM; la Figura. 9b presenta la dependencia de la corriente de pico catódico, a diferentes velocidades de barrido (hasta 100 mV·s^-1), donde se observa un comportamiento linealmente proporcional, característico de un sistema para sustancias adsorbidas superficialmente en el electrodo. Como se mencionó anteriormente, el mercurio se adsorbe en la superficie de CNTSPE/Ox/Au, esto se refuerza al observar la relación lineal entre log(I_p) y log(v) en la Figura 9c, dado un valor de pendiente de 0.9785 y un coeficiente de correlación de r² = 0.992, el valor de la pendiente confirma que el proceso de adsorción del electrodo se controla ya que se acerca al valor teórico de 1 (^{Karthika et al., 2019}).

Nota: Todas las gráficas se realizaron en CNT-SPE/Ox/Au utilizando el buffer de Sorensen.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 9 a) Voltamogramas cíclicos de una solución de Hg²⁺ a 30 μM a diferentes velocidades de barrido; b) gráfica de la corriente máxima de reducción frente a la velocidad de barrido potencial; c) gráfica del logaritmo de la señal potencial de reducción contra el logaritmo de la velocidad de barrido, y, d) potencial del pico anódico frente a logaritmo de la velocidad de barrido. 

Además, es posible determinar la irreversibilidad del sistema observando la respuesta voltamperométrica del mercurio con solo presentar la regresión lineal entre E_p y log(v) la cual muestra una buena linealidad dada una pendiente de 80 y un coeficiente de correlación de r² = 0.90 y concuerda con lo expresado en la ecuación de la teoría de Laviron:

donde 𝛼 es el coeficiente de transferencia, 𝑘⁰ es la constante de velocidad heterogénea estándar para la reacción, 𝑛 el número de electrones, 𝑣 la velocidad de barrido y 𝐸⁰ el potencial redox estándar y el resto de los símbolos tienen su significado habitual.

Por la expresión de Bard-Faulkner (Ecuación 2), donde E_p es el pico de potencial y E_p /2 es el pico de ancho en el medio de la corriente; y el hecho de que la reducción de mercurio implica la transferencia de un electrón (𝑛 = 1), el coeficiente de transferencia se puede calcular como 𝛼 = 0 ,4, que es cercano a 0.5, lo cual significa que el porcentaje de energía empleada en la reacción electroquímica de reducción y oxidación es equitativa.

Finalmente, se realizaron las mediciones analíticas para la detección de mercurio en el CNT-SPE/Ox/Au y la Figura 10a muestra la respuesta de voltametría de pulso diferencial superpuesta de Hg²⁺ en diferentes concentraciones, donde se puede observar la señal anteriormente descrita de oxidación alrededor de -36 mV que aumenta su corriente con respecto a la concentración, este pico se utilizó para la detección y cuantificación de Hg²⁺ en muestras reales. Además, se puede notar que, en la concentración más baja, aparece otro pico de oxidación alrededor de -110 mV, que va desapareciendo a medida que aumenta la concentración, esta señal pertenece al buffer utilizado para el experimento. El límite de detección (LOD) para Hg²⁺ se estimó en 2.38 𝜇M (0.477 ppm), aunque no se ha alcanzado el LOD para un ensayo de Hg²⁺ de la regulación de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en agua potable (30 nM) (^{Poulin, Gibb y Prüss-Üstïm, 2013}), esta técnica permite detectar mercurio en solución acuosa con una técnica portátil y de bajo costo sin utilizar materiales costosos o procesos de preparación complicados; por ejemplo, el máximo permitido de Hg²⁺ para el consumo humano dictado por la Comunidad Europea 93/351/EEC, establece un límite promedio de 500 𝜇g/kg peso húmedo de Hg²⁺ en pescado (^{Ebdon et al., 2002}), en cambio, el LOQ fue de 3 𝜇M. La importancia de detectar las concentraciones de mercurio a las que están expuestos los seres vivos radica en que plantas y animales absorben con gran facilidad compuestos orgánicos/inorgánicos de mercurio, ocasionando bioacumulación en la cadena alimenticia, esto se puede ver reflejado en que los seres humanos pueden absorber y acumular mercurio en sus tejidos debido a la dieta y ocasionar problemas como sordera, dolor de cabeza, hipertensión, desórdenes neurológicos, daños irreversibles en el cerebro e incluso la muerte (^{Lim, Kim y Woo, 2021}). Cuando se analizó la muestra real de agua corriente contaminada con una cantidad conocida de mercurio (5 𝜇M), se obtuvo una corriente de 2.7 mA, que se detectó por DPV, y remplazando en la ecuación de la curva de calibración, resultó en una concentración de 5.26 𝜇M; por lo que estuvo bien correlacionada con la contaminación realizada. Se han propuesto otros sensores electroquímicos con valores de LOD y LOQ bajos, pero con algunas desventajas. Por ejemplo, los electrodos modificados con nanopartículas de bismuto mejoran la sensibilidad para la detección de metales pesados, sin embargo, son fácilmente hidrolizados tanto en medio alcalino como neutro, requiriendo previamente una optimización en el parámetro experimental especificado en el pH, potencial de deposición y tiempo (^{Frena et al., 2011}).

Nota: Para las mediciones se utilizó el buffer de Sorensen y una velocidad de barrido de 5 mV/s; con una amplitud de pulso de 70 mV.

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 10 a) Voltamograma de pulso diferencial (DPV) a la respuesta electroquímica de Hg²⁺ en diferentes concentraciones, y, b) su curva de calibración. 

La Figura 11a muestra la micrografía SE-SEM de CNT-SPE/Ox/Au utilizada para la detección de Hg²⁺. Como se puede observar en la imagen, la superficie está completamente cubierta por la solución y no se aprecian CNT, lo cual indica la saturación del electrodo. La micrografía BSE-SEM de la Figura 11b muestra la presencia de puntos brillantes que están asociados con los metales Au⁰ y Hg²⁺. En la muestra, el Hg²⁺ se ubica uniformemente en el sitio de las NPs-Au, corroborando la alta interacción metalófila entre el Hg y el Au. La Figura 11c muestra el espectro de rayos X de dispersión de energía (EDS) del CNTSPE/Ox/Au con Hg²⁺, confirmando la presencia de Au⁰ y Hg²⁺. Como se informó anteriormente y como se observó en CV y DVP, el Au⁰ presente en la superficie de las NPs-Au interactúa selectivamente con el Hg²⁺ y confirma la formación de una amalgama Au-Hg (^{Thakur, Mandal y Banerjee, 2018}).

Fuente: Elaboración de los autores.

Figura 11 a) y b) micrografías del electrodo CNT-SPE/Ox/Au utilizado para la detección de mercurio, y, c) espectro EDS de las muestras.