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Introducción
El ozono (O3) es una molécula compuesta por tres átomos de oxígeno, la cual posee actividad antibacteriana, antiviral y antifúngica; dicha actividad ha sido altamente estudiada desde hace años. De la misma forma se ha evaluado la actividad antimicrobiana de productos que sufren un proceso de oxidación frente a este compuesto, como son el agua ozonizada y los aceites vegetales ozonizados.
Los aceites vegetales ozonizados, se obtienen después de la oxidación generada por el ozono a los ácidos grasos y otras sustancias presentes en los aceites vegetales (Martínez-Sánchez et al., 2012). Durante la reacción de ozonización de los aceites vegetales se producen lipoperóxidos, hidroperóxidos, peróxidos, ozónidos, aldehídos y cetonas (Díaz et al., 2005; Martínez-Sánchez et al., 2012).
Los ácidos grasos poli-insaturados son los más susceptibles a la oxidación durante el proceso (Díaz et al., 2005). El rendimiento de los productos de la ozonización depende de las condiciones de la reacción, como son: la temperatura, el generador de ozono, la concentración de ozono empleada y el tiempo de reacción (Almeida et al., 2013). Los aceites de oliva, sésamo, maní, coco, teobroma, soja y jojoba, son algunas de las materias primas que se han empleado para la realización de estos productos (Meléndez et al., 2008). De la misma forma, en el mercado ya existe diversos productos como es el caso del Oleozon® desarrollado en Cuba a base de aceite de girasol; el Cocozone® elaborado en Inglaterra con aceite de coco; el OOO® producto canadiense elaborado con aceite de oliva y el O2-ZAP® producto estadunidense a base de aceite de oliva (Skalska et al., 2009).
La importancia de los aceites ozonizados radica en que los compuestos presentes en los mismos, pueden actuar como germicidas, agentes de restauración de tejido e inmune-estimulantes (Martínez-Sánchez et al., 2012). Debido a las propiedades de los aceites vegetales ozonizados, estos pueden ser una nueva alternativa para combatir microorganismos patógenos y deterioradores; ya que hoy en día, debido al uso irracional y exagerado de los antibióticos, diversos microorganismos han generado multiresistencia a los mismos; por lo cual es necesario emplear nuevas alternativas, como son los agentes antimicrobianos de origen vegetal. Algunas de las ventajas de este producto son: menor costo respecto a otros antibióticos, no requieren estabilizantes, son de origen natural y que tienen un efecto similar o superior al de antibióticos presentes en el mercado (Sifontes et al., 2015).
El efecto antimicrobiano de los aceites ozonizados se ha atribuido a los ozónidos, peróxidos, compuestos derivados del proceso como el formaldehido y al ozono libre, presente en los aceites (Menéndez et al., 2008; Guinesi, 2011; Iorio et al., 2015). Sin embargo, durante el almacenamiento los aceites ozonizados sufren reacciones de despolimerización, por lo cual esto puede modificar sus propiedades químicas, físicas y microbiológicas (Martínez-Sánchez et al., 2012). Por lo anterior es necesaria la realización de estudios para establecer la vida útil de estos productos y sus propiedades contra microorganismos específicos, para poder definir su aplicación y uso como medicina alternativa para humanos y animales contra diversas patologías.
Por lo cual, el objetivo de este estudio fue evaluar el poder antibacteriano del aceite de oliva ozonizado contra Listeria monocytogenes.
Material y Métodos
Ozonización del aceite de oliva
Se empleó un aceite de oliva extra virgen comercial, el cuál de acuerdo a lo reportado en su etiqueta contiene 78.5 % de grasas monoinsaturados (omega 9), 7.1 % de grasas poli instaurados (Omega 3 y 6) y 14% de grasas saturadas; 100 ml del aceite de oliva. Se ozonizaron empleado un ozonizador de aceite de dos potencias (OzonoBio3, Modelo AO-5), burbujeándolo por una hora a una concentración de ozono de 50 mg/ml. El ozonizador estaba conectado a un generador de oxígeno (Respironics Everflo, Philips) generando un flujo de oxígeno de 2 L/min.
Para el estudio se empelaron dos aceites de oliva ozonizados, uno después de 6 meses de almacenamiento a 4°C (T1) y otro realizado al momento de realizar el experimento (T2); además se empleó un aceite de girasol ozonizado comercial (OLEOZON®)
Determinación del índice de peróxidos
El índice de peróxido se determinó empleado la tecina reportada por Farmacopedia Británica (British Parmacopeia, 2000); se evaluó el índice de peróxido para los aceites de oliva ozonizado T2 y Oleozon®. Para su realización se colocaron 5g de la muestra en un matraz con 30 ml de una solución ácido acético-cloroformo 2:3. La muestra se agitó hasta disolverse totalmente y se le adicionó 0.5 ml de una solución saturada de yoduro de potasio y se dejó reposar por un minuto. Al finalizar el tiempo se le adicionaron 30 ml de agua destilada y procedió a titularse con tiosulfato de sodio 0.01N, hasta obtener una coloración ligeramente amarilla. Después de obtener dicha coloración, se le adicionó 0.5 ml de una solución indicadora de almidón, y se continuó titulando hasta la aparición de un color azul. Bajo las mismas condiciones se realizó la titulación de un blanco. El índice de peróxido se expresó en mini equivalentes de peróxido en un kg de aceite y se calculó empleando la siguiente formula.
Preparación del inoculo
La cepa de L. monocytogenes se activó transfiriendo 40µL del cultivo, mantenido en congelación a un tubo con 3 ml de caldo soya tripticaseina (CST, Dibico; México) y se incubó durante 24 h a 35°C. Posteriormente se estrió en agar soya tripticaseina (Dibico; México) con 0.6 % de extracto de levadura (Bioxon; México) (ASTEL) y se incubó a las mismas condiciones que el paso anterior. Después de las 24 h, se tomó una azada de la cepa estriada en la caja y se ajustó con solución salina isotónica (SSI), hasta obtener una turbidez equivalente al estándar 3 de McFarland (~ 9 X108 UFC/ml).
Para las pruebas microbiológicas se empleó la suspensión de la bacteria sin diluir, la segunda dilución y la cuarta dilución. Las diluciones decimales fueron realizadas con SSI.
Determinación del efecto antibacteriano por el método de difusión en pozo
El efecto antibacteriano se determinó extendiendo en placas de ASTEL 100µL de las suspensiones bacterianas (~ 9 X108 UFC/mL, 9 X106 UFC/mL, 9 X104 UFC/mL). Posteriormente se dejó secar la caja durante 15 min y se realizaron 4 pozos (8mm de diámetro) por caja; en cada pozo se colocaron 80µL (~70 mg) de los aceites ozonizados: 1) control negativo: aceite de oliva sin ozonizar; 2) T1: aceite de oliva ozonizado almacenado 6 meses a 4°C; 3) T2: aceite de oliva ozonizado al momento y 4) T3: Oleozon® (control positivo). Las cajas se incubaron 24h a 35°C. Transcurrido el tiempo de incubación se midieron los halos de inhibición. El experimento se realizó por cuadriplicado.
Se realizó una ANOVA para evaluar estadísticamente del efecto antimicrobiano, y la prueba Tukey para la comparación de medias; empleando el programa JMP 8.0.
Resultados y Discusión
El índice de peróxido de los aceites ozonizados, se encontró en un rango de 400-490 mmol/kg y 500-800 mmol/kg para el aceite de oliva ozonizado y para el Oleozon®, respectivamente.
El análisis ANOVA del efecto antimicrobiano, mostró que tanto la concentración del inoculo (p<0.0001), como el tratamiento empleado (p<0.0001), tuvo un efecto significativo; obteniendo que ha menor concentración del inoculo, se obtuvo mayores halos de inhibición; y que en todos los casos los aceites ozonizados de oliva, tuvieron una diferencia estadísticamente significativa (p<0.05) respecto al aceite de girasol ozonizado comercial (Oleozon ®), siendo mayor el efecto de este último. La diferencia entre los aceites ozonizados de oliva y el de marca comercial, puede deberse tanto a la materia prima, como al índice de peróxido.
La composición de los ácidos grasos saturados e insaturados de los aceites vegetales, es diferente dependiendo su origen; por lo cual los lipoperóxidos que se generan durante la ozonización, también varían (Díaz et al., 2001).
El aceite comercial está hecho a base de girasol, y los aceites T1 y T2 a base de aceite de oliva. De la misma forma se puede observar que el Oleozon ® tiene mayor índice de peróxido, lo que puede influir en su actividad antimicrobiana. Díaz et al., (2006) observaron el mismo comportamiento al probar aceite de girasol ozonizado con diferentes índices de peróxidos, contra Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis y Escherichia coli; encontrando que a mayor índice de peróxido, existía una mayor actividad antimicrobiana. Por lo cual sería necesario evaluar el aumento del índice de peróxido conforme al tiempo, y determinar el punto de saturación, con la finalidad de poder obtener un aceite ozonizado con mayor actividad antibacterial. Se ha observado que el incremento de 1 a 3 h de ozonización duplica el índice de peróxido (Fernández et al., 2006).
En la Tabla 1 se observan los halos de inhibición (mm) de los diferentes aceites ozonizados a diferentes concentraciones bacterianas. Se observa que ambos aceites de oliva ozonizados no tuvieron diferencias estadísticamente significativas entre sí, lo que indica que el almacenamiento por 6 meses a 4°C no afecta la actividad antimicrobiana del aceite ozonizado. Similar a esto, se ha encontrado que el Oleozon® tiene una estabilidad de 6 meses a temperatura ambiente, y más de un año a temperatura de -10°C a 8°C; después de ese periodo disminuye la actividad antimicrobiana (Sechi et al., 2001). Entre mayor es la temperatura de almacenamiento conforme pasa el tiempo, existe una disminución en el índice de peróxidos, y un aumento en el índice de acidez; pero a temperaturas de -20°C a 4°C no se observan cambios significativos en estos parámetros durante un año (Moureun et al., 2015).
Tabla 1: Efecto antibacterial de los aceites vegetales ozonizados contra L. monocytogenes
| Tratamiento | Diámetro de inhibición (mm) | ||
|---|---|---|---|
| Inoculo: 9x107 UFC/mL | Inoculo: 9x105 UFC/mL | Inoculo: 9x103 UFC/mL | |
| Aceite de oliva ozonizado (T1) | 17.5 ±1.3 b | 26.4 ± 3 b | 34 ± 0.8 b |
| Aceite de oliva ozonizado (T2) | 18.3 ± 2.1 b | 24 ± 1.6 b | 32.25 ± 0.5 b |
| Oleozon ® | 30 ± 0.8 a | 44.8 ± 3.2 a | 50 ± 1.4a |
a, b Cada valor representa el promedio de cuatro replicas ± la desviación estándar. Las letras diferentes expresan diferencia significativa con la prueba Tukey α 0.05
Los ozónidos son uno de los compuestos que se han relacionado con la actividad antimicrobiana de los aceites ozonizados, aunque no son los únicos responsables (Díaz et al., 2001). Estos compuestos durante el almacenamiento y el aumento de la temperatura tienden a descomponerse y formar ácido nonanoico y ácido azelaico; dichos compuestos también tienen efecto antimicrobiano (Moureun et al., 2015); esta puede ser la razón por la cual el efecto antimicrobiano no disminuye. Siendo importante analizar sí los ozónidos o los ácidos tienen mayor efecto, con la finalidad de estandarizar la vida útil y óptima de los aceites ozonizados.
Se han realizado estudios similares contra otros microorganismos, en los cuales se han encontrado diámetros de inhibición superiores (Montrvecchi et al., 2013) e inferiores (Iorio et al., 2015); sin embargo no es posible realizar comparaciones, debido a que los microorganismos empleados no son los mismos, a que en algunos estudios evalúan la cantidad de ozono libre y en otros el índice de peróxidos, y a la concentración y viabilidad del inoculo.
En la Figura 1 se observan los halos de inhibición dependiendo de la concentración.
Conclusión
El aceite de oliva ozonizado mostró un buen efecto antibacteriano contra L. monocytogenes, en todas las diferentes concentraciones de patógeno, a pesar de que a mayor concentración del inoculo se observaron menores halos de inhibición. De la misma forma se determinó que el almacenamiento por 6 meses a temperatura de 4°C del aceite de oliva ozonizado, no afectó su actividad antimicrobiana.
Es necesaria la realización de más estudios, con la finalidad de determinar la vida útil de estos aceites y en base a ellos poder emplearlos en diversas áreas.
