INTRODUCCIÓN

En la actualidad, existe una creciente preocupación pública por el trato que reciben los animales cautivos y domesticados, incluidos los salvajes, de laboratorio, de granja, de trabajo, de zoológico y de compañía (^{Webb et al., 2019}). El bienestar animal es una cuestión compleja y polifacética con dimensiones científicas, éticas, sociales, religiosas, culturales, políticas y económicas. Según el American College of Animal Welfare: "El bienestar animal se refiere al estado del animal. La evaluación del bienestar incluye la consideración de la salud, el comportamiento y la función biológica del animal"; por lo tanto, cualquier cosa que contribuya o demerite el estado normal de un animal afecta su bienestar (^{Castle et al., 2016}). Por otro lado, la salud se refiere al estado de los sistemas del cuerpo que combaten los patógenos, el daño tisular o los trastornos fisiológicos; en otras palabras, es el estado de un animal en relación con sus intentos de hacer frente a la patología. Como tal, es un componente importante del bienestar animal (^{Broom, 2011}).

El proceso inflamatorio es un síndrome común a numerosas situaciones patológicas de los mamíferos. Da lugar a la respuesta local o sistémica del organismo frente a estímulos externos nocivos de tipo microbiano, químico o físico. La finalidad es eliminar el agente causante, así como, reparar el tejido dañado y mantener la homeostasis. Este proceso puede dividirse en dos fases: aguda, caracterizada por vasodilatación local y aumento de la permeabilidad capilar; y crónica, caracterizada por una mayor respuesta inmunitaria, degeneración tisular y fibrosis (^{Kumawat et al., 2012}). Durante la respuesta inflamatoria, se sintetizan y secretan mediadores pro y antiinflamatorios. Se trata de sustancias que tienen un efecto directo sobre las células inflamatorias y los vasos sanguíneos o que intervienen en reacciones que generan compuestos que actúan sobre estas células. Entre los mediadores inflamatorios y las vías celulares se encuentran las citocinas (por ejemplo, los interferones, las interleucinas y el factor de necrosis tumoral α), las quimiocinas (por ejemplo, la proteína 1 quimio-atrayente de monocitos), los eicosanoides (por ejemplo, las prostaglandinas y los leucotrienos) y el potente factor de transcripción κB que modula la inflamación (^{Azab et al., 2016}). La mayoría de estas moléculas se derivan de los componentes fosfolípidos de las membranas celulares, que se liberan como resultado de su destrucción (^{Kumawat et al., 2012}).

A lo largo de los milenios, las plantas medicinales han sido utilizadas para el cuidado de la salud humana y animal, debido a que poseen una gran diversidad de metabolitos secundarios como terpenos, alcaloides y flavonoides que poseen diversas propiedades biológicas (^{Mayer et al., 2014}; ^{Miara et al., 2019}; ^{Starlin et al., 2019}). Además, la preferencia por el uso de plantas medicinales o fitofármacos obtenidos a partir de ellas, sigue aumentando debido a que carecen de efectos secundarios o estos son mínimos (^{Mayer et al., 2014}; ^{Miara et al., 2014}; ^{Starlin et al., 2019}; ^{Laudato & Capasso, 2013}).

El género Salix, perteneciente a la familia de las Salicáceas, se ha utilizado desde la antigüedad para el tratamiento de la fiebre, el dolor y la inflamación. Para estos fines, la corteza de Salix alba y Salix nigra; las flores de Salix caprea y las partes aéreas de Salix canariensis, demuestran una respuesta antiinflamatoria (^{Drummond et al., 2013}; ^{Gutiérrez et al., 2017}; ^{Sharma et al., 2011}; ^{Gyawal et al., 2013}; ^{Ahmed et al., 2011}).

Salix babylonica, comúnmente conocido como sauce llorón, es la especie más reconocida de los sauces, distribuida en algunas zonas de Asia, Europa y América. Se ha utilizado como planta ornamental y medicinal (^{González-Alamilla et al., 2019}). En la medicina tradicional, la ingesta de una infusión de hojas de sauce llorón permite aliviar el dolor, ya sea reumático, muscular, de cabeza, de oídos, de muelas, entre otros (^{WaizelBucay, 2011}). Así, el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad antiinflamatoria in vivo de un extracto hidroalcohólico de hojas de Salix babylonica e identificar los compuestos responsables de esta actividad.

MATERIALES Y MÉTODOS

RESULTADOS

Análisis histológico

La aplicación tópica de TPA durante 6 horas, indujo una respuesta inflamatoria aguda a nivel de la dermis de la oreja de los ratones y se observó un marcado aumento de la población de neutrófilos (Figura 1). No se observaron cambios en la epidermis. Además, cuando sólo se aplicó acetona (vehículo del TPA), no se observó esta reacción, sino que se mantuvo el aspecto normal de la dermis, especialmente entre las fibras de colágeno y los fibrocitos/fibroblastos. Del mismo modo, la aplicación de indometacina, extracto hidroalcohólico de Salix babylonica (HESB) y fracción de acetato de etilo (EAFSB) obtenida de HESB, inhibió una respuesta inflamatoria aguda, evidenciada por la escasa población de células inflamatorias, particularmente neutrófilos, asociadas a la dermis de la piel de la oreja (Figura 2).

Figura 1 Piel de la oreja de ratón. H-E. 100x (a) y 400x (b). Efecto del TPA, sin adición de antiinflamatorios. Hay un marcado aumento de neutrófilos en la dermis (flechas, representativas de al menos 40 células en el campo)  

Figura 2 Piel de la oreja de ratón. H-E. 400x. Aplicación de la fracción orgánica del extracto hidroalcohólico de S. babylonica. Como puede observarse, la presencia de células inflamatorias en la dermis es mínima (flecha) 

DISCUSIÓN

Según el Código Terrestre de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), por bienestar animal se entiende el estado físico y mental de un animal en relación con las condiciones en que vive y muere. Los principios rectores que informan el trabajo de la OIE sobre el bienestar de los animales terrestres incluyen las "Cinco Libertades"; que describen las expectativas de la sociedad respecto a las condiciones que deben experimentar los animales cuando están bajo control humano, a saber: libres de hambre, desnutrición y sed; libres de miedo y angustia; libres de estrés térmico o incomodidad física; libres de dolor, lesiones y enfermedades; y libres de expresar patrones normales de comportamiento (^{OIE, 2019}).

La inflamación, respuesta de un organismo a una irritación o lesión, se caracteriza por enrojecimiento, calor, hinchazón y dolor. Los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) se utilizan para el tratamiento de enfermedades inflamatorias. Estos compuestos afectan a la función o producción de prostaglandinas. En medicina veterinaria, los AINE se utilizan para controlar, entre otras dolencias, el dolor y la inflamación asociados a la artrosis en perros y caballos; así como, para el dolor postoperatorio en perros y gatos. Sin embargo, existen riesgos potenciales asociados al uso de AINE, como úlceras/perforaciones gastrointestinales y toxicidad hepática y renal (^{Mathews et al., 2014}). Por lo tanto, la búsqueda de nuevos compuestos con una reacción antiinflamatoria, sin los efectos secundarios de los AINE, es de vital importancia para el mantenimiento del bienestar animal. El uso de plantas medicinales es una alternativa para el tratamiento del dolor y la inflamación en animales.

Se ha demostrado que las plantas son fuentes muy ricas de metabolitos de interés estructural y biológico. Se ha evaluado la actividad biológica potencial de menos del 10% de la biodiversidad mundial, y muchos más compuestos líderes naturales útiles esperan ser descubiertos (^{Gyawali et al., 2013}). Además, el interés mundial por los productos a base de plantas ha crecido considerablemente. El ganado vacuno, los caballos, las ovejas, las cabras y los cerdos representan alrededor del 70 % de los animales tratados con remedios a base de plantas, seguidos de las aves de corral (9,1 %), los perros (5,3 %) y los conejos (4,3 %) (^{Laudato & Capasso, 2013}).

En cuanto al uso de plantas para el tratamiento del proceso inflamatorio en animales, Geranium robertianum, Artemisia abrotanum, Brassica oleracea, Avena sativa, Anagallis arvensis, Linum usitatissimum, Scrophularia canina, Hypericum perforatum, Achillea millefolium y Buxus sempervirus se utilizan para tratar o prevenir la mastitis en el ganado vacuno debido a su efecto antiinflamatorio (^{Mayer et al., 2014}; ^{Laudato & Capasso, 2013}). Además, el Aloe spp. se ha utilizado para el tratamiento de la inflamación, los dolores y el picor en varios animales; mientras que el diente de león y las semillas de lino se han empleado para el tratamiento de la inflamación de las glándulas perianales en perros (^{Laudato & Capasso, 2013}). Rosa canina, Matricaria chamomilla, Glycyrrhiza glabra, Aegle marmelos, Asparagus racemosus Wild, Argemone mexicana Linn, Datura metal Linn, Eclipta prostrata Linn, Moringa oleifera Lamk, Syzygium cumini, Allium cepa, Nerium oleander L, Anayclus davatus, Mentha pulegium L, Lawsonia inemis L, Olea europaea L, Ziziphus lotus L, Ruta graveolens y Ziziphus jujuba Linn, se utilizan para el tratamiento de diferentes enfermedades inflamatorias en ovinos, bovinos, caprinos, conejos y aves de corral (^{Miara et al., 2019}; ^{Laudato & Capasso, 2013}; ^{Verma, 2014}).

El género Salix se ha utilizado en el tratamiento de la artritis; dolores menstruales, dentales y de espalda; fiebres e inflamaciones. Los sauces pertenecen a la familia Salicaceae y los registros de su uso medicinal se remontan a unos 6.000 años (^{Drummond et al., 2013}; ^{Gutiérrez et al., 2017}; ^{Gyawali et al., 2013}). Salix babylonica ha demostrado actividad antihelmíntica, antiséptica, analgésica, antipirética, antipalúdica, antioxidante, anticancerígena, astringente, antifúngica y antibacteriana (^{González Alamilla et al., 2019}; ^{Abdel Wahab et al., 2018}). En este trabajo se evaluó la actividad antiinflamatoria del extracto hidroalcohólico de hojas de S. babylonica y se encontró que inhibió la inflamación en un 66,92 ± 3,20 %, sin diferencias estadísticas significativas con respecto al fármaco de referencia, indometacina (Tabla 1).

Existen algunos reportes respecto al efecto antiinflamatorio de extractos obtenidos de otras especies de Salix; por ejemplo, ^{Gyawali et al. (2013)}, que evaluaron la capacidad antiinflamatoria de un extracto metanólico de corteza de Salix alba utilizando el modelo de edema de pata inducido por formalina en ratas, y encontraron una inhibición de la inflamación del 74 % a una dosis de 93,5 mg/Kg. Asimismo, un extracto acuoso de partes aéreas de S. canarensis, obtenido por infusión, a una dosis de 105 mg/Kg, provocó una inhibición de la inflamación del 78% en el mismo modelo (^{Gutiérrez et al., 2017}). Por otro lado, ^{Ahmed et al., (2011}) evaluaron los efectos antiinflamatorios de los extractos metanólico e hidroalcohólico de flores de S. caprea a 400 µg/mL, utilizando el método de estabilización de membranas de glóbulos rojos humanos (HRCB), y encontraron que este extracto mostró un 66,78 y 60,49 % de protección de membranas, respectivamente. Sin embargo, estos resultados no pueden ser comparados directamente con los obtenidos en este trabajo para el extracto hidroalcohólico de S. babylonica (HESB), debido a que los extractos evaluados son de diferente polaridad, obtenidos por diferentes métodos y evaluados en diferentes modelos farmacológicos.

Para identificar la naturaleza química de los compuestos activos en el extracto hidroalcohólico de las hojas de S. babylonica, se realizó un procedimiento de bipartición con los disolventes agua y acetato de etilo. Se evaluó la capacidad de la fracción acuosa de SBHE (AFSB) y la fracción orgánica de SBHE (EAFSB) para inhibir la inflamación in vivo. Como se muestra en la Tabla 1, EAFSB (66,92 ± 3,20 % de inhibición de la inflamación (% II)) fue más activa que AFSB (30,64 ± 3,03 %II), sin diferencia estadística significativa con respecto al extracto SBHE, y la dosis efectiva fue tres veces menor. Además, EAFSB no presentó diferencias estadísticas significativas con el fármaco de referencia Indometacina. Estos resultados nos sugirieron que los compuestos antiinflamatorios de Salix babylonica se encontraban en la fracción orgánica.

Previamente, identificamos las flavonas luteolina (Figura 3a) y luteolósido (luteolina 7-Oglucósido) (Figura 3b) como los principales componentes de la fracción de acetato de etilo obtenida por bipartición a partir del extracto hidroalcohólico de las hojas de Salix babylonica (^{González-Alamilla et al., 2019}).

Figura 3 Estructura química de los flavonoides identificados como componentes principales de la EAFSB. (a) luteolina (3′,4′,5,7-tetrahidroxiflavona) y (b) luteolósido (3′,4′,5,7tetrahidroxiflavona-7-Oglucósido) 

La luteolina es una 3',4',5,7-tetrahidroxiflavona, un tipo de flavonoide con un doble enlace entre C2 y C3, y un grupo carboxilo en la posición 4 del anillo C. La luteolina se ha aislado de verduras, frutas y plantas medicinales. Existen informes que evidencian su actividad antioxidante, antimicrobiana, antidiabética, quimioprotectora, quimioterapéutica, neuroprotectora, antialérgica y antiinflamatoria. Además, esta molécula se considera no tóxica (^{González-Alamilla et al., 2019}; ^{Aziz et al., 2018}; ^{Zhang et al., 2018}). En cuanto a las respuestas antiinflamatorias, la luteolina suprime la expresión de citocinas proinflamatorias, incluyendo la interleucina (IL)-6, IL-1β, IL-2, IL-8, IL-12, IL17, TNF-α, interferón (INF)-β, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y aumenta el nivel de la citocina antiinflamatoria IL-10. También inhibe la inducción de la sintasa de oxígeno nítrico (iNOS) y su expresión activa, así como la producción de NO, ROS y quimiocinas. Éstas ayudan a controlar la migración y el posicionamiento de las células inmunitarias, como la quimioquina (motivo C-X-C) ligando 2 (CXCL2), la quimioquina (motivo C-C) ligando 2 (CCL2), CXCL9 y CXCL8 (IL-8). Además, también inhibe la producción y liberación de eicosanoides, prostaglandinas y leucotrienos, así como de moléculas de adhesión proinflamatorias como la proteína-1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1), la molécula-1 de adhesión intercelular (ICAM) y la molécula-1 de adhesión de células vasculares (VCAM). Del mismo modo, previene la vía NF--ĸB, la proteína quinasa B (AKT) y la vía de la proteína quinasa activada por mitógenos (MAPK); la actividad de la hialuronidasa y la elastasa; la estabilización de los mastocitos; la reducción de la permeabilidad vascular; modulación de la fluidez de la membrana celular, enzimas antioxidantes activas e impide que el adenosín trifosfato (ATP) se una a la tirosina quinasa del bazo (Syk) o al proto-oncogén tirosina-proteína quinasa (^{Aziz et al., 2018}; ^{Zhang et al., 2018}; ^{Li et al., 2019}). Además, luteolina 7-O-glucósido (luteoloside) posee actividad antiinflamatoria también, este flavonoide inhibe la liberación de βhexosaminidasa (un marcador de degranulación en mastocitos), leucotrieno C4 (LTC4), producción de NO y PGE2; así como, la actividad enzimática de COX-2 e iNOS. Además, el luteoloside es un potente inhibidor de JNK3, una proteína quinasa de la familia MAPK que se activa potentemente por una variedad de estrés ambiental y citoquinas proinflamatorias (^{Aziz et al., 2018}).

Por otro lado, la aplicación tópica de TPA en las orejas de ratones produjo edema con sus síntomas típicos: hinchazón, aumento del grosor e infiltración de células proinflamatorias como neutrófilos, leucocitos y linfocitos. Estas células son los componentes clave que se infiltran primero en el sitio de la inflamación y promueven las funciones de defensa del huésped y se agregan y se unen a las paredes de los vasos sanguíneos en el rango de 4 a 6 h después de la aplicación de TPA (^{Hernandez-Valle et al., 2014}; ^{Mendes et al., 2016}; ^{Silva et al., 2017}). En el presente estudio, las muestras para el análisis histológico se recogieron 6 h después de la estimulación con TPA, como se muestra en la figura 1. El TPA generó edema, extravasación de fluidos y aumento de neutrófilos en la dermis. Cuando se aplicó indometacina, un fármaco antiinflamatorio esteroideo ampliamente utilizado como validación del modo farmacológico, la inflamación local disminuyó; se observó un resultado similar en los animales que recibieron tratamiento con extracto hidroalcohólico SBHE o EAFSB (fig. 2). En otras palabras, SBHE y EAFSB indujeron la misma respuesta en comparación con el fármaco de control. En conclusión, el análisis histológico de las orejas de ratón teñidas con H-E muestra que Salix babylonica suprime la infiltración de células en el lugar de la inflamación inducida por TPA.

CONCLUSIONES

El extracto hidroalcohólico SBHE de hojas de Salix babylonica y sus fracciones AFSB y EAFSB muestran actividad antiinflamatoria, siendo EAFSB la fracción más activa. Anteriormente, informamos de que el análisis químico de la fracción EAFSB mediante HPLC reveló la presencia de los flavonoides luteolina y luteolósido (luteolina-7-Oglucósido) como compuestos principales. En consecuencia, el efecto antiinflamatorio mostrado por las hojas de S. babylonica podría atribuirse a la presencia de esos compuestos antiinflamatorios. El análisis histológico de las orejas tratadas con S. babylonica sugiere que éstas regulan a la baja la migración de neutrófilos patógenos hacia el lugar de la inflamación, disminuyendo la producción de citoquinas inflamatorias.

Finalmente, nuestros resultados muestran que S. babylonica son capaces de disminuir la inflamación y podrían servir como una valiosa alternativa para el tratamiento de procesos inflamatorios en animales.

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.