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Contribución del estudio
Las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis y sus proteínas inducen apoptosis en diferentes células. Mycobacterium bovis y sus extractos proteicos (filtrado de cultivo y extracto soluble) tienen la capacidad de inducir este fenómeno de manera independiente a la activación de la caspasa 3. Sin embargo, se desconoce la identidad de las proteínas en los extractos proteicos. En este estudio se logró identificar por primera vez la presencia de tres candidatos (MPB70, MPB83 y chaperonina de 60 kDa) responsables de inducir apoptosis en macrófagos de origen bovino.
Introducción
La apoptosis es un proceso de muerte celular regulado, ocurre normalmente durante el desarrollo y crecimiento de los tejidos.1 Morfológicamente, las células que mueren por apoptosis se caracterizan por encogimiento celular, condensación de la cromatina (picnosis), fragmentación nuclear (cariorrexis) y cambios como la exposición de la fosfatidilserina hacia el lado externo de la membrana celular, así como la formación de cuerpos apoptóticos -vesículas que contienen elementos celulares-.1-3Mycobacterium bovis es el agente causal de la tuberculosis bovina, esta bacteria forma parte del complejo Mycobacterium tuberculosis. Las micobacterias poseen una pared celular muy compleja compuesta en su mayoría por lípidos como los ácidos micólicos, glicolípidos fenólicos, ManLAM, entre otros; sin embargo, también contienen lipoproteínas.4 Estas moléculas potencialmente son factores de virulencia que permiten la evasión del sistema inmune y la supervivencia de estos microorganismos.
Las micobacterias patógenas utilizan diferentes mecanismos para sobrevivir intracelularmente, por ejemplo, inhiben la acidificación del fagosoma, la fusión del fagosoma con el lisosoma;5 inducen apoptosis, 6 etc. Las especies del género Mycobacterium como M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG y M. avium son capaces de inducir muerte celular en macrófagos. Diferentes investigaciones han demostrado que la inducción de apoptosis en macrófagos de origen humano o murino dependerá de la virulencia de la cepa con la que se infecten dichas células. Asimismo, se ha identificado que las proteínas LpqH (lipoproteína de 19 kDa),7,8 ESAT-6,9 lipoproteína de 38 kDa,10 PE_PGRS33,11 MPT8312 de M. tuberculosis nativas o recombinantes, producidas en M. smegmatis y E. coli tienen la capacidad de inducir apoptosis en macrófagos de origen humano (WBC 264-9C, HEK 293, MDM, THP-1) y murino (RAW262.7, BMDM). Este mecanismo es una defensa del hospedador contra el microorganismo, también el microorganismo lo puede manipular como una forma de evadir la respuesta montada y así diseminarse e infectar otras células.13
En el modelo bovino, se logró identificar por primera vez que M. bovis tiene la capacidad de inducir condensación de la cromatina y fragmentación del DNA en macrófagos bovinos dependiendo de la multiplicidad de la infección, así como del tiempo de infección.6 También se demostró que tanto la bacteria como los extractos proteicos14,15 tienen la capacidad de inducir la condensación de la cromatina y la fragmentación del DNA en un proceso independiente de la activación de las caspasas con la participación del Factor Inductor de Apoptosis (AIF),14 y la Endonucleasa G (Endo G) como molécula ejecutora de este fenómeno.16 Sin embargo, no se conoce la identidad de las proteínas que se involucran en la muerte celular. Por lo tanto, en este trabajo se propuso reconocer la identidad de algunas proteínas en las fracciones del filtrado de cultivo (CFE, por sus siglas en inglés), capaces de inducir apoptosis en macrófagos bovinos.
Los resultados de este estudio demostraron que una fracción proteica de 15-20 kDa (fracción de interés FI) derivada del CFE de M. bovis indujo la fragmentación del DNA en macrófagos. El análisis de la FI mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) pudo identificar la presencia de MPB70, MPB83 y chaperonina de 60 kDa. Esto sugiere que estas proteínas podrían participar en la inducción de apoptosis.
Materiales y métodos
Declaración ética
Los procedimientos realizados en los animales fueron aprobados por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales Experimentales de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia (CICUAE-FMVZ-UNAM) número JAGP- 2002.
Cultivo M bovis AN5
Se cultivó Mycobacterium bovis AN5 en medio Sauton durante ocho semanas en condiciones estáticas a 37 °C. Una vez transcurrido el tiempo de incubación, el cultivo se procesó para la obtención de proteínas del filtrado del cultivo (CFE).
Obtención de proteínas de M. bovis en medio Sauton
Como de describió anteriormente,15 el CFE se obtuvo al filtrar el medio de cultivo utilizando primero papel filtro de poro grueso para separarlo de la biomasa; posteriormente se usaron membranas con poros de 1.2 μm, 0.45 μm y de 0.22 μm (Millipore, Bedford, MA). Una vez que el CFE estuvo libre de bacterias, se precipitó con sulfato de amonio a una saturación del 70 % en agitación a 4 °C durante 12 h; transcurrido este tiempo, se centrifugó a 10 300 × g, 20 min y se colectaron los precipitados de proteínas. Posteriormente las proteínas se dializaron con una membrana de diálisis MWCO 3 500 (Spectra/Por) contra agua destilada durante tres días (se realizaban dos cambios de agua al día); para después dializar contra PBS 1X durante toda la noche. El CFE se almacenó a -20 °C. Para conocer la concentración de proteína en el CFE, la proteína se cuantificó con ácido bicinconínico (BCA) y se elaboraron geles SDS PAGE al 12 % teñidos con azul de Coomassie para visualizar las proteínas obtenidas cargando 15 μg de proteína por carril.
Cromatografía liquida de proteínas mediante exclusión por peso molecular
Mediante cromatografía de exclusión molecular, se fraccionó el CFE usando una columna Hi Load 16/600 Superdex 75PG (G&E) acoplada a un equipo ÄKTA Pure (GE Healtcare) con el buffer recomendado por el fabricante (NaPO4 0.05 mol, NaCl 0.15 mol, pH 7.2), con un flujo de 0.8 mL/ minuto, y se colectaron fracciones de 1.5 mL. La concentración de proteína se determinó para cada fracción con la técnica BCA, y el patrón de proteínas se visualizó en geles de poliacrilamida al 12 %, teñidos con azul de Coomassie.
Obtención de macrófagos derivados de monocitos bovinos
La obtención de monocitos se realizó de acuerdo con el método descrito previamente6,14,15 a partir de sangre periférica de bovinos sanos en un hato libre de tuberculosis bovina. Brevemente, mediante punción yugular, se colectaron 60 mL con 3.5 mL de anticoagulante ACD por cada 30 mL de sangre. Una vez en el laboratorio, la sangre se centrifugó durante 30 min a 1 000 × g a temperatura ambiente (TA). Se separó la capa leucoplaquetaria y se diluyó 1:1 con PBS-Citrato (PBS-C), posteriormente se depositó sobre un gradiente de Histopaque 1077 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); se centrifugó a 1 000 × g, 20 min, TA.
La capa leucoplaquetaria libre de eritrocitos se colectó y se lavó con PBS-C tres veces a 500 × g, 10 min a 4 ºC. Finalmente, las células se resuspendieron en medio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) adicionado con L-glutamina 2 mmol, piruvato de sodio 1 mmol y aminoácidos no esenciales 0.1 mmol (cRPMI) (Gibco BRL, Life Technologies, Grand Island, NY) sin suero, dejando incubar por 2 h a 37 °C y 5% de CO2 para favorecer el pegado celular, transcurrido este tiempo, se cambió de medio añadiendo cRPMI 1640 con 12 % de suero autólogo. Para su diferenciación a macrófagos, las células fueron cultivadas en placas de ultrabaja adherencia durante 12 días a 37 °C y 5 % de CO2 realizando cambios de medio cada tres días.
Incubación de macrófagos con la fracción de interés
Se incubaron 1 × 106 macrófagos en placas de ultrabaja adherencia durante 16 horas con 100 μg/mL de la FI, 25 μg/mL de camptotecina (Sigma Aldrich, MO) como testigo positivo y células sin estimular como testigo negativo, bajo las mismas condiciones de cultivo. Al finalizar el tiempo de incubación, las células se cosecharon y se fijaron con paraformaldehído (PFA) al 1 % durante 15 min a 4 °C. Posteriormente se almacenaron en etanol al 70 % a -20 °C hasta cuando se midió la fragmentación del DNA. Para el ensayo de actividad de caspasa 3, las células se procesaron al finalizar el tiempo de incubación.
Fragmentación del DNA
La detección de la fragmentación del DNA se realizó por medio de la técnica de TUNEL (por su nombre en inglés, Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dU-TP Nick End Labeling), la cual se llevó a cabo utilizando el paquete comercial APO-BrdU TUNEL assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham MA), de acuerdo con lo especificado por el fabricante. Las células contenidas en etanol al 70 % a -20 °C, se lavaron dos veces y después se incubaron con la solución de marcaje de DNA (buffer de reacción, enzima TdT, BrdUTP, agua destilada) durante 1 h a 37 °C, agitando cada 15 min para que las células se mantuvieran en suspensión. Posteriormente, se lavaron y centrifugaron a 300 × g, 5 min, dos veces. Se adicionó el anticuerpo anti-BrdU marcado con fluoresceína y se incubaron por 30 min en obscuridad. El marcaje de las células se detectó por medio de citometría de flujo, en un citómetro ATTUNE NxT (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) donde se contaron como mínimo 10 000 eventos.
Ensayo de actividad de la caspasa 3
Se realizó un ensayo de actividad de caspasa 3 con la FI. En placas de ultrabaja adherencia, se incubaron 1 × 106 macrófagos con 100 μg/mL de la FI, 25 μg/mL de camptotecina (Sigma Aldrich, MO) como testigo positivo y células sin estimular como testigo negativo, durante 16 h a 37 °C y 5 % de CO2. Trascurridas las 16 h, las células se lavaron con 1 mL de PBS 1X y se añadieron 115 μL de buffer de lisis (10 mmolTris-HCl, 10 mmol NaH2PO4, 130 mmol NaCl y tritón × 100 al 1 %), se incubaron por 15 min a 4 °C; posteriormente se añadieron 100 μL buffer de reacción (40 mmol HEPES, 1 mol DDT, 10 mmol AcDEVD-AM) y se incubaron durante 5 min a TA. Finalmente, se determinó la fluorescencia en un rango de 380/430-460 nm durante 20 min en un lector de microplacas de detección múltiple Synergy HT Bio Tek.
Electroforesis de doble dimensión
La FI se desaló con buffer de fosfatos + CHAPS para someterse a isoelectroenfoque. A la muestra se le añadió deoxicolato de sodio (DOC) 0.02 %, se mezcló en vórtex y se dejó incubar 15 min a TA. Posteriormente se añadió ácido tricloroacético (TCA) al 10 %, se incubó 1 h a TA. Transcurrido el tiempo de incubación, la muestra se centrifugó por 10 min a 18 000 × g a 4 °C; se decantó el sobrenadante y se añadió acetona previamente enfriada a -20 °C, se mezcló en vórtex y se mantuvo en hielo por 15 min, agitando cada 5 min. La muestra se centrifugó por 10 min a 18 000 × g a 4 °C. Se decantó el sobrenadante, los remanentes de acetona se absorbieron con papel filtro y se dejó secar el pellet por no más de 5 min para facilitar la resuspensión. El pellet se resuspendió en 150 μL de buffer de rehidratación con 1.5 μL de ditiotreitol (DTT) 50X y 1 μL de anfolitas durante 1.5 h a 37 °C en agitación constante.
La rehidratación de las tiras (ReadyStrip IPG Strips, Biorad, pH 4-7 de 7 cm) se llevó a cabo de forma pasiva por 16 h con 125 μL de buffer de rehidratación. El isoelectroenfoque se realizó a 20 °C de acuerdo con el siguiente programa: 100 V-169 150 V/h, 300 V-200 V/h, por gradiente 1000 V, 300 V/h, 5 000 V 4 500 V/h, por pasos 500 V-2 000 V/h en un equipo IPGphor III (GE). Una vez focalizadas las tiras, se almacenaron a -70 °C hasta su uso. Para la segunda dimensión, las tiras se equilibraron con buffer de equilibrio (BE), agregando 20 µL de DTT 10X por cada 2 mL de buffer. Cada tira se equilibró con 2 mL de BE por 20 min a TA en agitación constante (1 mL BE/10 min, se decantó y añadió 1 mL BE/10 min). Previo a la rehidratación de las tiras, se prepararon geles de 10 × 10.5 cm con un espesor de 1.5 mm a una concentración del 12 %; finalmente los geles fueron teñidos con azul de Coomassie.
LC-MS
Se realizó Cromatografía líquida-Espectrometría de masas (LC-MS) para identificar las proteínas en la FI. El análisis se llevó a cabo con un cromatógrafo de líquidos Eksigent nanoLC 425 acoplado al espectrómetro de masas AB Sciex TripleTOF 5 600+. La búsqueda con base en los datos se realizó con el software ProteinPilot 5.0.1 de AB Sciex.
Resultados
Fraccionamiento de las proteínas de M. bovis AN5 por cromatografía líquida
El CFE fue fraccionado a través de cromatografía de exclusión por peso molecular. Para ello se obtuvieron cinco picos detectables a una absorbancia de 280 nm (Figura 1A). Las fracciones proteicas obtenidas en el pico cuatro mostraron un perfil electroforético similar, por lo que se decidió realizar un pool de las fracciones cuyo peso molecular se encontraba entre 15 y 20 kDa correspondiente a las fracciones 51-60 FI. Los perfiles proteicos del CFE se determinaron por SDS PAGE al 12 % y teñidos con azul de Coomassie (Figura 1B).
Fragmentación del DNA y ensayo de actividad de caspasa 3
La fragmentación del DNA de los macrófagos bovinos después de 16 h de incubación con la FI fue evaluada por la técnica de TUNEL. El porcentaje de fragmentación del DNA de los macrófagos incubados con la FI fue del 48.63 ± 9.03 %, mientras que el del control negativo fue 7.30 ± 1.63 % (Figura 2A). La muerte celular de los macrófagos sucedió en ausencia de la activación de la caspasa 3 (Figura 2B).
Figura 2 (A) Porcentaje de fragmentación del DNA y (B) actividad de la caspasa 3 en macrófagos bovinos (106) estimulados con 100 μg/mL de la FI, testigo positivo camptotecina (20 μg/mL), testigo negativo, células sin tratamiento. Los resultados se expresan con (A) media y error estándar de tres experimentos independientes (P = 0.1272) y (B) unidades relativas de fluorescencia (URF) de tres experimentos independientes (P = 0.0001) comparados con el control negativo.
2D PAGE y LC MS
El análisis mediante 2D PAGE nos permitió observar 25 puntos de proteína que se distribuyen en un peso molecular de 12-23 kDa, de los cuales la mayor parte de las proteínas tienen un punto isoeléctrico entre 4.1 y 4.9 (Figura 3). El Cuadro 1 muestra las proteínas que se identificaron en la banda secuenciada.
Figura 3 2D PAGE fracción de interés 15-20 kDa del CFE de M. bovis. 12 % gel, pH 4-7M; la flecha muestra la localización de las proteínas identificadas por LC-MS.
Cuadro 1 Proteínas identificadas de la fracción proteica P1 del CFE de M. bovis por LC-MS
| Proteína | Gen | ID | Función/localización | Identidad H37Rv | kDa | PI | Longitud (aa) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MPB70 | mpb70 | Mb2900 | Proteína de secreción. Lipoproteína de superficie celular | 100 | 19.07 | 4.54 | 193 |
| Miembro de la familia mpt70/mpt83. | |||||||
| MPB83 | mpb83 | Mb2898 | Proteína de secreción. Induce la expresión de MMP9 mediante la estimulación de TLR1/TLR2 en humanos | 100 | 22.07 | 4.73 | 220 |
| Chaperonina de 60 kDa | groEl1 | Mb3451c | Plegamiento de proteínas junto con su cochaperonina GroES. Permite la encapsulación de sustratos de proteínas no nativas y acelera el plegamiento de las Proteínas | 100 | 56.72 | 4.74 | 539 |
ID: Identificador
PI: Punto isoeléctrico
Discusión
En esta investigación, mediante FPLC de exclusión por peso molecular, se realizó el fraccionamiento del filtrado de cultivo (CFE) de Mycobacterium bovis y se demostró que un grupo de proteínas cuyo peso molecular se encuentra entre 15 y 20 kDa (FI) inducen la fragmentación del DNA de forma independiente a la activación de caspasa 3. Mediante LC-MS se logró identificar la presencia de MPB70, MPB83 y chaperonina de 60 kDa. La caracterización del proteoma y del secretoma de M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, así como del PPD y filtrados de cultivo bajo diferentes condiciones de cultivo, ha permitido identificar la presencia de proteínas altamente antigénicas con capacidad de estimular linfocitos T. También se ha demostrado que el perfil proteico cambia, reflejándose en la virulencia y el desenlace de la enfermedad en el hospedador.17-25 El empleo de 2D PAGE y MC-LS ha permitido que estas proteínas sean empleadas en el desarrollo de técnicas diagnósticas más sensibles y específicas, así como para el desarrollo de vacunas.18,23,26,27
Nuestros resultados se basan en el uso de estas técnicas para proponer posibles candidatos proteicos que, además de ser antigénicos, inducen la muerte celular de macrófagos bovinos. Alito et al., (2003)28 a través de cromatografía de intercambio aniónico obtuvieron de 3 a 4 picos de elusión con proteínas de diferentes pesos moleculares cuyo efecto fue medido en los linfocitos T. Nuestro método de fraccionamiento se basó únicamente en la separación por peso molecular, lo que nos permitió obtener una banda de interés cuyo peso molecular se encontró entre 15 y 20 kDa (FI).
Diversas investigaciones han demostrado que las bacterias pertenecientes al complejo Mycobacterium tuberculosis son capaces de inducir muerte celular a través de diferentes vías como ferroptosis,29 apoptosis dependiente de caspasas,10 apoptosis independiente de caspasas,30 estrés del retículo endoplásmico,31 así como necroptosis32 en macrófagos de origen humano y de ratón. Vega-Manríquez et al. (2007)14 demostraron que tras la incubación de macrófagos bovinos durante 16 y 24 h con CFE no se activaron las caspasas 8, 9 y 3, y al utilizar el inhibidor general de caspasas Z-VAD-FMK, el resultado se confirmó. En la presente investigación, se demostró que la FI no activó a la caspasa 3, lo que coincide con lo reportado previamente en el modelo bovino.
Esta información es significativa ya que algunas especies del complejo Mycobacterium tuberculosis activan las caspasas cuando inducen apoptosis en macrófagos de diferentes orígenes.33 Este resultado sugiere que Mycobacterium bovis trata de interferir con la apoptosis inhibiendo la activación de las caspasas. Sin embargo, los macrófagos bovinos activan una vía alterna de apoptosis independiente a la de la activación de las caspasas. Finalmente, la inducción de apoptosis ayuda al control de crecimiento intracelular de la micobacteria.16 MPB70 y MPB83 se han estudiado ampliamente respecto a su localización y a la respuesta inmune que desencadenan en los animales; son dos proteínas homologas con el 60 % de identidad a nivel de aminoácidos (MPB83 respecto de MPB70),34 pero las codifican diferentes genes.
Estas proteínas presentan el dominio FAS 1 o βIgH3, que se ha descrito como un dominio de adhesión, por lo que se ha sugerido que la interacción de este dominio con proteínas que posean receptores para este dominio podría explicar el tropismo de la micobacteria hacia ciertos tejidos.35 Ju-Ock Nam et al., 200836 desarrollaron un polipéptido que posee un dominio FAS 1, el cual demostró la capacidad de inducir apoptosis en células endoteliales; por lo que además de la idea de que las micobacterias tienen cierto tropismo hacia algunos tejidos debido a la presencia del receptor, este tropismo podría estar participando en la señalización de muerte celular de los macrófagos.
La chaperonina de 60 kDa está considerada dentro de la familia de las proteínas de choque térmico. Puede fungir como chaperona para el plegamiento de enzimas involucradas en la síntesis de los ácidos micólicos.37 Este agregado proteico se sobre expresa bajo diferentes condiciones de estrés, incluso cuando los microorganismos se encuentran infectando un hospedero.38 La inducción de apoptosis en PBMC por la chaperonina de 60 kDa se ha reportado en infecciones con Mycoplasma gallisepticum debido a su interacción con anexina 2.39 En el caso de Mycobacterium bovis, sería el primer reporte de inducción de muerte celular en macrófagos por esta proteína. Esta proteína se considera dentro de la familia de proteínas de choque térmico. Ahora bien, la proteína recombinante Hsp70 de M. tuberculosis induce 32.7 ± 11.63 % de fragmentación del DNA en macrófagos bovinos.15
Las proteínas de choque térmico han sido asociadas en la inducción de apoptosis a través de la generación de ROS en la mitocondria y existe evidencia que la chaperonina de 60 kDa junto con la chaperonina de 10 kDa se involucran en la señalización de la activación de la caspasa 3, así como en la asociación de estas moléculas con Bax, cuyo resultado es la activación de la apoptosis. En nuestro modelo, mostramos que quizá la chaperonina de 60 kDa activa el fenómeno a través de un mecanismo diferente en los macrófagos bovinos.40 Dentro de las limitantes del estudio tenemos que nuestros resultados no pueden precisar si la fragmentación del DNA se debe a la acción de las proteínas individuales o a la actividad del consorcio proteico. También es importante considerar el tiempo de cultivo, porque los perfiles de proteínas entre cultivos jóvenes y viejos es diferente, por lo que es necesario verificar si estas proteínas se encuentran a menores tiempos de cultivo in vitro y si juegan algún papel en la interacción patógeno-hospedador in vivo.
