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Introducción
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa ocasionada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) que afecta principalmente a los pulmones al provocar una respuesta inflamatoria granulomatosa necrotizante; sin embargo, cualquier sitio extrapulmonar puede ser afectado.1 Aunque la incidencia de TB ha disminuido de manera gradual (1.5% por año) en el período del 2000-2013; hoy constituye un serio problema de salud pública a nivel mundial, principalmente en países en vías de desarrollo, aunque también afecta en menor medida a países desarrollados.2 En el 2013 se registraron 9 millones de casos nuevos y 1.5 millones de muertes alrededor del mundo.2 Después de la infección con virus de inmunodeficiencia humana (VIH), la TB ocupa la segunda causa de muerte por una enfermedad infecciosa en todo el mundo.2
El desarrollo de la enfermedad refleja la estrategia evolutiva que Mtb ha empleado durante su interacción con la respuesta inmune en animales y humanos con la finalidad de asegurar su transmisión a otros huéspedes.1 En este sentido se sabe que existe variabilidad en el espectro clínico de la infección por Mtb entre humanos y que el 90% de los sujetos infectados con Mtb desarrolla una infección latente asintomática mientras que aproximadamente el 10% restante de individuos infectados con Mtb desarrollará la forma activa de la enfermedad.3,4 Hasta el momento no se han dilucidado por completo los factores que influyen en la progresión a la enfermedad activa;5-7 si bien se sabe que existen factores de riesgo para la reactivación de TB, entre ellos están la infección por VIH, inmunosupresión por otras causas como el uso de glucocorticoides y biológicos como anti-TNF, desnutrición, alcoholismo, cáncer, edad avanzada, diabetes y falla renal.8-10 En la mayoría de los casos se desconoce la causa específica de reactivación, pero se sabe que el componente genético del huésped tienen una participación importante.11,12 La importancia de los factores genéticos que determinan susceptibilidad a TB ha sido estudiada extensamente por medio de diferentes métodos tales como: estudios de casos y controles, estudios funcionales de genes candidatos de susceptibilidad y estudios de asociación del genoma completo (GWAS).13,14 La identificación de genes del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) asociados con susceptibilidad o resistencia a TB sugirió posibles marcadores genéticos para predecir el desarrollo de la enfermedad.15-20 No obstante, dichos marcadores genéticos son insuficientes para explicar el amplio espectro de variación en la respuesta inmune ante la infección por Mtb. El estudio de polimorfismos clave de genes que no pertenecen al MHC como: citocinas y sus receptores,21 la proteína de macrófago 1 asociada con resistencia natural (NRAMP1),22,23 receptor purinérgico P2X724-26 y receptores de reconocimiento de patrones [receptores tipo Toll (TLR)27,28 y receptores de lectina que unen manosa (MBL)29,30] ampliaron el panorama respecto algunos genes candidatos importantes en la progresión de la enfermedad.
Otros polimorfismos de genes de citocinas que han sido identificados como candidatos en la susceptibilidad a TB son: IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α).31-39
Existen algunos estudios de polimorfismos del gen de IL-17 en diferentes poblaciones del mundo que hasta el momento han mostrado resultados discordantes. El objetivo de nuestro estudio fue investigar si el SNP -197 G>A de IL-17A se asocia con susceptibilidad genética a TB pulmonar activa (TBA) en población mexicana a través de un estudio de casos y controles. También nos propusimos evaluar el efecto funcional del genotipo del polimorfismo -197G>A en la producción de IL-17A frente a diferentes estímulos micobacterianos.
Material y métodos
Población de estudio
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de 30 pacientes con TBA y 30 individuos con tuberculosis latente (TBL) en el Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosío Villegas de la Ciudad de México entre enero del 2015 y diciembre del 2016. Los pacientes con TBA fueron mayores de 18 años, con diagnóstico de tuberculosis pulmonar confirmado por clínica, estudios radiológicos, baciloscopia (BAAR) y cultivo positivo para Mtb. De manera simultánea se obtuvieron las muestras de individuos con TBL, los cuales tuvieron un resultado positivo a las pruebas de ensayo de liberación de IFN-γ (QuantiFERON-TB Gold In-Tube) y a la aplicación de derivado proteínico purificado (PPD). Todos los individuos con TBL tuvieron pruebas positivas de ensayo de liberación de IFN-γ (QuantiFERON-TB Gold In-Tube) y resultado positivo a la aplicación de PPD. Los criterios de exclusión para los participantes fueron la presencia de comorbilidades como enfermedades autoinmunes, cáncer e infección por VIH.
Todos los participantes del estudio fueron considerados mestizos mexicanos, sin antecedentes heredofamiliares de ancestros extranjeros al menos por dos generaciones. El estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Ética en Investigación y de Investigación del Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Ismael Cosío Villegas y sólo se incluyeron individuos que firmaron carta de consentimiento informado.
Extracción de DNA y genotipificación del polimorfismo -197G>A de IL-17ª
Se aisló DNA de sangre periférica anticoagulada en tubos con EDTA por medio de columnas de afinidad QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAamp Genomic DNA Isolation Mini Kit; Qiagen, Shanghai, China) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de genotipificación del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) rs2275913 de la región promotora (-197G>A) de IL-17A se llevó a cabo por discriminación alélica con sondas TaqMan en reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR). La amplificación se realizó bajo las siguientes condiciones: desnaturalización inicial a 94 oC por 5 minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94 oC por 45 segundos, alineamiento a 62 oC por 60 segundos y extensión a 72 oC por 60 segundos, y extensión final a 72 oC por 10 minutos en un termociclador StepOne (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Producción de IL-17A e IFN-γ por células mononucleares de sangre periférica cultivadas con antígenos de Mtb
Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) anticoagulada con ácido-citrato-dextrosa (ACD) por centrifugación con un gradiente de densidad. Se cultivaron 5X105 CMNSP en medio RPMI 1640 con L-glutamina suplementado con suero fetal bovino al 10% por duplicado en placas de 48 pozos. Las células se estimularon con antígenos de micobacterias: ESAT-6, CFP-10, pared celular de H37Rv, pared celular de la cepa HN878 y medio de cultivo RPMI como control negativo. La concentración final de los antígenos fue de 5 μg/mL. Las células estimuladas se incubaron durante 72 horas a 37 oC y 5% de CO2. Las células fueron cosechadas al tercer día, se aisló el sobrenadante y se congeló a -20 oC hasta su uso. Se midió la producción de citocinas en los sobrenadantes de las diferentes condiciones experimentales, utilizando un panel múltiple de la vía Th17 con el método de luminometría con el equipo BioPlex-200 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).
Análisis estadístico
Los resultados fueron analizados con el paquete computacional SPSS (versión 21) y GraphPad Prism (versión 6.00 for Mac, Grapd Pad Software, San Diego California, USA, www.graphpad.com. Se realizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, de acuerdo con la distribución de las variables continúas se reportaron como frecuencia y desviación estándar (DE). El nivel de producción de citocinas se reportó como mediana y rango intercuartil (IQR). Las variables categóricas se expresaron con porcentajes. Para comparar la frecuencia de genotipos y alelos entre casos y controles se utilizó la prueba de χ2. Primero se comparó la diferencia en la producción de citocinas en ausencia de estímulos entre casos y controles por medio de la prueba de Mann-Whitney. Después se utilizó el análisis de varianza de un factor (ANOVA de una vía) para comparar la producción de citocinas dentro de cada grupo con los diferentes estímulos y en el caso de existir diferencia entre medias, se usó la prueba a posteriori de comparación múltiple de Tukey. Se realizó la prueba de Mann-Whitney para comparar dentro de cada grupo con cada estímulo, la diferencia en producción de IL-17A por cada genotipo. Para todos los análisis se consideró un valor de p de dos colas < 0.05 como estadísticamente significativo.
Resultados
Se incluyeron en el estudio 60 individuos: 30 casos con TBA (33% mujeres y 67% hombres) y 30 individuos con TBL (67% mujeres y 33% hombres). El promedio de edad en el grupo de TBL fue de 39.3 ± 13 años, mientras que en los casos con TBA fue 38 ± 10 años. El índice de masa corporal (IMC) fue significativamente mayor en el grupo de sujetos con TBL en comparación con pacientes con TBA (p < 0.0001) (Tabla 1).
El polimorfismo -197G>A de IL17A no se asocia significativamente con la susceptibilidad a TBA, pero sí influye en la producción de IL-17A en sujetos infectados con la forma activa de la enfermedad
Los resultados de la distribución de genotipos y alelos del polimorfismo rs2275913 de IL17A se muestran en la Tabla 2. El genotipo predominante en ambos grupos fue el homocigoto para guanina (GG) con 66% en controles y 70% en casos, el genotipo heterocigoto (GA) se encontró en el 30% entrambas poblaciones. Asimismo, se analizó la distribución alélica registrando para el alelo guanina un 85% en casos y 82% en controles, para el alelo adenina se obtuvo 15% en casos y 18% en controles. No se encontró diferencia significativa en la distribución genotípica y alélica entre casos y controles (p = 1.0, p = 0.8565, respectivamente).
Tabla 2 Frecuencias génicas y genotípicas del polimorfismo -197A>G de IL-17A en pacientes con TBA y sujetos con TBL.
F: frecuencia; ns: no significativo.
La producción de IL-17A en forma basal, es decir, en ausencia de estímulos micobacterianos fue significativamente mayor por parte de células de pacientes con TBA comparado con células de sujetos con TBL (p = 0.007) (Figura 1A). La mediana (IQR) de IL-17A fue de 27.2 y 51.2 pg/mL para los grupos de TBL y TBA, respectivamente.
Figura 1 Producción de IL-17A por CMNSP. A) Casos y controles sin estímulo. B) Ante ESAT-6, CFP-10, HN878 y H37Rv en cada grupo. C) Influencia del genotipo en cada estímulo en controles. D) Influencia del genotipo en cada estímulo en casos. Las diferencias significativas son indicadas por una línea con el valor de p.
Al evaluar la producción de IL-17A dentro de cada grupo frente a los diferentes estímulos micobacterianos, las células de sujetos con TBL mostraron una mayor producción de esta citocina tras el estímulo con la pared celular de la cepa H37Rv. Sólo se encontraron diferencias significativas al comparar los niveles de L-17A inducida por H37Rv, en relación con la producción inducida por el antígeno CFP-10 (p = 0.007) (Figura 1B). Se observó una mayor producción de IL-17A en células de pacientes con TBA estimuladas con el antígeno HN878, si bien sólo se alcanzó diferencia significativa al compararla con la producción de IL-17A por células estimuladas con el antígeno CFP-10 (p = 0.003) (Figura 1B).
El polimorfismo rs2275913 no influyó en la producción de IL-17A en células de individuos con TBL después de estimular con los antígenos ESAT-6, HN878 y H37Rv. No obstante, se encontró una mayor producción de IL17A en cultivos de células de individuos homocigotos G/G, en relación con células aisladas de sujetos heterocigotos A/G estimuladas con CFP-10 (p = 0.004) (Figura 1C). En el grupo con TBA la influencia del genotipo fue evidente tras la estimulación con HN878 y H37rv. Sin embargo, sólo se observó diferencia significativa con HN878, en el que sujetos heterocigotos A/G tuvieron mayor producción de IL-17A en comparación con los sujetos con genotipo GG (p = 0.008) (Figura 1D).
La estimulación con antígenos de Mtb induce alta producción de IFN-γ por células de pacientes con TBA
El grupo con TBA mostró mayor producción de IFN-γ en ausencia de estímulos de manera significativa al compararlo con el grupo de TBL (p = 0.029) (Figura 2A). La mediana (IQR) de IFN-γ fue de 17.3 (10.1-32.0) y 25.8 (20.6-39.2) pg/mL para los grupos de TBL y TBA, respectivamente. Al analizar la producción de esta citocina con diferentes estímulos no se encontraron diferencias significativas en el grupo de TBL, mientras que en los pacientes con TBA se encontraron diferencias significativas entre: ESAT-6 y HN878 (p = 0.008); ESAT-6 y H37rv (p = 0.014); CFP-10 y HN878 (p = 0.001) y finalmente entre CFP-10 y H37rv (p = 0.002) (Figura 2B).
Discusión
Se han descrito ampliamente las funciones de las citocinas Th17 en el control de la respuesta inmune contra Mtb.40-42 Los polimorfismos en genes de citocinas, en particular las relacionadas con el control de la respuesta contra micobacterias, pueden alterar sitios de reconocimiento para factores de transcripción y, por ende, afectan la activación transcripcional y conllevan a niveles alterados de citocinas.43 Diversos estudios han involucrado la participación de IL-17A en la inmunopatogénesis de TB, por esta razón se ha promovido el estudio de variaciones en sus genes con la asociación a esta enfermedad. El SNP rs2275913 ubicado en la posición -197G>A del gen de IL-17A se localiza dentro de un motivo de unión al factor nuclear activado de células T (NFAT), el cual parece actuar como regulador importante del promotor de IL-17.44,45
En el presente trabajo se estudió la asociación de las variaciones en la posición -197G>A del gen de IL-17A con TBA en un reducido grupo de pacientes mexicanos atendidos en un hospital de tercer nivel.
El primer estudio de casos y controles donde se evaluó la correlación entre polimorfismos del gen de IL-17 y TBA fue hecho en población china.46 El estudio reportó diferencia en la distribución del genotipo CT entre casos y controles, asociando positivamente al genotipo CT del SNP rs763789 (IL-17F) con TBA y tuberculosis extrapulmonar (TBEP), mientras que el genotipo TT tuvo un papel protector. No relacionaron al SNP rs2275913 (IL-17A) con TBA ni con TBEP.46 Otro estudio realizado también en población china examinó en forma similar la relación de SNPs del gen de IL-17 y TBA.47 Se observó que los individuos portadores del genotipo AA del SNP rs2275913 y del genotipo CC del SNP rs763780 se asociaron con riesgo incrementado de TBA [OR = 2.20 (IC 95%: 1.35-3.60) y OR = 1.99 (IC 95%: 1.05-3.87) respectivamente].47 Recién se ha reportado SNPs en IL-17A e IL-6 con un efecto protector en el desarrollo de TBA en población al sur de Brasil.48 Fueron incluidos 366 participantes en quienes encontraron mayor presencia del alelo A del SNP rs2275913 en el grupo control al compararlo con los casos (p = 0.004). Por medio de un modelo de regresión logística encontraron riesgo disminuido para el desarrollo de TBA entre sujetos con genotipo AA y portadores del alelo A [OR = 0.12 (IC 95%: 0.02-0.64) y OR = 0.29 (IC 95%: 0.14-0.58) respectivamente].48 Por otra parte, en población al norte de India se reportó un estudio con falta de asociación de los SNPs rs2275913 y rs763780 con la susceptibilidad a TBA. Este mismo grupo de trabajo tampoco encontró asociación entre los niveles séricos de IL-17 A y F con los genotipos que estudiaron.49 Otro estudio realizado con población caucásica al norte de España, además de buscar asociación entre el SNP rs2275913 y TBA evaluó los niveles séricos de IL-17A.50 Este último trabajo encontró asociación entre sujetos con el genotipo GG y portadores del alelo G con riesgo incrementado a TBA [OR = 1.59 (IC 95%: 1.09-2.31) y OR = 1.40 (IC 95%: 1.06-1.86) respectivamente]. Respecto a los niveles séricos de IL-17A, encontraron mayor concentración en el grupo de casos en comparación con los controles (p < 0.0001). Sin embargo, no hallaron diferencias significativas en la producción de IL-17A después de estimular sangre total con ESAT-6, CFP-10 y PHA al compararlo con sangre no estimulada. Tampoco encontraron diferencias en los niveles de IL-17A en suero ni en plasma estimulado entre sujetos con TBA portadores de diferentes genotipos.50 En un trabajo previo se estudió una población indígena de Oaxaca, México, en la cual describimos una asociación significativa entre el genotipo GG del polimorfismo rs2275913 del IL-17A con la susceptibilidad a TBA (Domingo R, et al., manuscrito en preparación). Los resultados de nuestro trabajo no mostraron diferencias significativas en la distribución alélica ni genotípica del SNP rs2275913 de IL-17A en la población estudiada, la cual tiene un origen étnico diferente, ya que proviene de población del centro del país y con un componente amerindio menor. Además, la falta de asociación en este estudio también puede deberse principalmente al reducido tamaño de la población, en comparación con el gran número de participantes incluidos en los trabajos previamente descritos.
Respecto a los estudios in vitro realizados en este trabajo, se encontró mayor producción de IL-17A en CMNSP de sujetos con TBA en ausencia de estímulos al compararlos con los controles. Lo cual es esperado debido a todas las funciones proinflamatorias que cumplen en la defensa del huésped contra la micobacteria.51 Se evaluó la producción de IL-17A en el grupo de sujetos con TB latente ante diferentes estímulos micobacterianos y los niveles de citocina fueron mayores en el estímulo con pared celular de Mtb HN878 de la familia W-Beijing en comparación con el antígeno clásico de Mtb CFP-10. La cepa de Mtb HN878 en modelos de infección experimentales se le considera hipervirulenta, resultado del incremento en la mortalidad y el exacerbado daño inmunológico que ocasiona.52 Se estudió la relevancia funcional del SNP rs2275913 al comparar la producción de IL-17A por cada genotipo ante los diferentes estímulos dentro de cada grupo. Cabe destacar que los sujetos portadores del alelo A en el GA tuvieron mayores niveles de IL-1A en comparación con el genotipo GG. Estos hallazgos podrían ser explicados por el papel protector que IL-17 tiene en la inmunidad contra la infección por Mtb HN878.53
Mtb posee la habilidad para inducir respuestas inmunes de tipo Th1 y Th17. El papel protector de IFN-γ es bien conocido y consiste esencialmente en inducir respuestas celulares que admiten el reclutamiento de células inflamatorias, y la producción de mediadores importantes en el control de macrófagos infectados con Mtb y que faculta la maduración de granulomas con capacidad funcional que permitan contener la infección por Mtb.40 En el mismo contexto IL-17A, entre otras citocinas y quimiocinas, también contribuye en la formación del granuloma inducido por la infección micobacteriana.54 Una respuesta excesiva por IL-17 se asocia con la patogénesis de afecciones respiratorias crónicas mediadas inflamación neutrofílica y remodelado de la vía aérea.54,55 El balance en la producción de mediadores inflamatorios como IFN-γ, en respuesta a Mtb, y los factores que regulan los procesos inflamatorios así como las moléculas de la vía IL-23/IL-17 es determinante para un control eficaz del crecimiento de Mtb.51
Consideramos que se necesitan más estudios funcionales in vitro y en modelos experimentales de animales que permitan dilucidar el papel que las variaciones en el gen de IL-17 desempeñan en la susceptibilidad a TB.
