Artículos científicos

 

Geminivirus Transmitidos por Mosca Blanca (Bemisia tabaci) en Tomate, en el Valle Agrícola de Culiacán, Sinaloa

 

Geminivirus Transmitted by White Fly (Bemisia tabaci) in Tomato, in the Agricultural Valley of Culiacan, Sinaloa

 

Ofelia Yadira Lugo Melchor, Roberto Guzmán Uriarte, Raymundo Saúl García Estrada y Josefina León Félix

 

Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C., Unidad Culiacán, Apdo. Postal 32-A, Culiacán, Sin., CP 80129, México. Correspondencia: ljosefma@ciad.mx

 

Recibido: Abril 05, 2011
Aceptado: Mayo 21, 2011

 

Resumen

Sinaloa es uno de los principales productores de tomate en México, sin embargo, su producción se ha visto afectada por enfermedades relacionadas con la presencia de geminivirus transmitidos por mosca blanca, ocasionando fuertes pérdidas económicas. En el presente trabajo, se identificaron y caracterizaron los geminivirus presentes en plantas de tomate, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) anidada y posterior análisis de secuenciación. De 507 muestras de plantas analizadas, 197 presentaron síntomas y 310 no los mostraron; se encontraron un total de 134 muestras positivas, que corresponden a 99 (73.8%) que presentaron síntomas y 35 (26.2%) que no los presentaron. De las 134 muestras positivas detectadas por PCR anidada, 64.2% presentó el virus TYLCV, 22.4% SLCV, 6.7% correspondieron a variantes de otros virus (STLCV AV1, PHYVV, CuLCrV segmento A y B) y 3.7% no se identificó el tipo de geminivirus. La PCR anidada permitió detectar los geminivirus transmitidos por mosca presentes en plantas de tomate, tanto con síntomas como sin ellos, y su posterior secuenciación permitió determinar los diferentes tipos de geminivirus presentes, así como nuevas variantes de geminivirus y virus que no habían sido reportados previamente en tomate.

Palabras clave: Solanum lycopersicum, diagnóstico molecular, reacción en cadena de la polimerasa.

 

Abstract

Sinaloa is one of the main tomato producer states in Mexico; however, its tomato production has been seriously affected by diseases related to the presence of geminivirus transmitted by whitefly, causing great economic losses for the state. in this study, geminivirus present in tomato plants were identified and characterized by nested polymerase chain reaction (PCR) and later sequencing analysis. A total of 507 plants were analyzed, from which, 197 plants showed symptoms of the presence of geminivirus and 310 plants did not show any symptoms of the presence of geminivirus. After analysis, 134 samples were found positive, 99 (73.8%) corresponding to plants that presented symptoms, and 35 (26.1%) without symptoms. From the 134 positives samples detected by nested PCR, 64.2% belonged to TYLCV, 22.4% to SLCV, 6.7% were variants of other viruses (STLCV AV1, PHYVV, CuLCrV segment A and B) and 3.7% contained geminivirus whose type was not identified. The nested PCR allowed detection of geminivirus transmitted by whitefly in tomato plants with, and without symptoms. Posterior sequencing analysis allowed to determine the different types of virus, as well as, new variants of geminivirus which has not been previously detected in tomato plants.

Keywords: Solanum lycopersicum, molecular.

 

Los Geminivirus representan un factor limitante en la producción mundial de varios cultivos incluyendo maíz, yuca, frijol, calabaza, cucurbitáceas y tomate, producidos en las zonas tropicales y subtropicales del mundo (Bisaro, 1996). La amplia distribución mundial del cultivo de tomate, así como la fácil adaptación y la rápida reproducción de Bemisia tabaci (mosca blanca), ha ocasionado pérdidas devastadoras en esta hortaliza (Morales y Anderson, 2001). En Estados Unidos, la estimación de las pérdidas causadas por geminivirus en tomate alcanzan a alrededor del 20% de la producción, pero en República Dominicana, Cuba, México, Guatemala, Honduras, Nicaragua, Costa Rica, Venezuela y Brasil, los daños son mayores, oscilando entre 30 y 100% de pérdidas en el rendimiento, además de los costos de control de la mosca blanca (Czosnek, 2007).

La distribución global de geminivirus está directamente relacionada con el vector polífago, Bemisia tabaci, se estima que esta especie de mosca blanca es capaz de tomar alrededor de 500 plantas como hospedero alrededor del mundo (Morales y Anderson, 2001) y se ha encontrado con una invasividad de hasta 200 km de radio (Deying et al., 2006).

En México, a los geminivirus se les ha asociado con numerosas enfermedades en cultivos de importancia económica como frijol (Phaseolus vulgaris), tomate (Solanum lycopersicum), chile (Capsicum annuum), calabaza (Cucurbita spp.), entre otros, y son transmitidos a través de la mosca blanca. Los daños por virus se pueden incrementar rápidamente en los cultivos cuando no se cuenta con un diagnóstico certero, oportuno y confiable, razón por la cual los productores en muchos casos no manejan de manera adecuada las estrategias de control para estas enfermedades.

Los Geminivirus constituyen la familia más grande, diversa y económicamente importante de los virus de ADN de plantas (Rojas et al., 2005). La familia Geminiviridae se clasifica en cuatro géneros definidos con base en el vector que los transmite, al hospedero que infecta, y a su estructura genómica (Mastresvirus, Curtovirus, Topocuvirus y Begomovirus) (Fauquet et al., 2003). Dentro del grupo más ampliamente diversificado y distribuido se encuentran los Begomovirus, los cuales infectan principalmente plantas dicotiledóneas y son transmitidos por la mosquita blanca. El genoma de los Begomovirus es generalmente bipartita a excepción del Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV) (Lazarowitz, 1992). Los componentes genómicos son denominados como ADN-A y ADN-B con tamaño molecular que oscila entre 2.7 y 3.0 kb, respectivamente (Yadava et al., 2010). Ambos componentes están organizados en unidades de transcripción divergentes separados por una región intergénica (RI), la cual contiene el origen de la replicación del virus y dos promotores que dirigen la transcripción genética en direcciones opuestas, con excepción de una secuencia de la RI de aproximadamente 200 pb, que se encuentra en ambos ADN virales y es denominada como región común (RC) (Hanley et al., 2000). Los dos componentes son completamente diferentes, el ADN-A contiene toda la información que se requiere para la replicación y formación de la cápside del virus, mientras que el componente B, codifica para las proteínas involucradas en el movimiento viral de célula a célula, en el rango de hospederos y en el desarrollo de los síntomas en la planta (Hou et al., 1998). Las técnicas moleculares basadas en amplificar regiones conservadas de los componentes genómicos A y B de los geminivirus, ha permitido diseñar nuevos oligonucleótidos que son utilizados como método de diagnóstico como es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que permiten la detección cualitativa y semicuantitativa de bajas semicuantitativa de bajas concentraciones de geminivirus, aún cuando se utilicen extractos crudos de material vegetal, por lo que el método ha permitido la detección más oportuna de este tipo de virus, así como la identificación de sus nuevas variantes. Lo que permite encaminar nuevos trabajos para mejorar el diagnóstico molecular.

Por ello, el objetivo del trabajo fue identificar y caracterizar la presencia de geminivirus transmitidos por mosca blanca, en cultivos de tomate del Valle de Culiacán, Sinaloa, durante el ciclo agrícola 2006-2007, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa anidada y la secuenciación de los fragmentos de ADN amplificados.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo de plantas de tomate. La toma de muestra de las plantas de tomate se llevó acabo por barrido total de dos campos agrícolas, ubicados en el Valle de Culiacán. El campo agrícola #1 se encuentra localizado bajo las coordenadas 24°46'16.42"-107°31'23.49", el campo agrícola #2 se encuentra localizado bajo las coordenadas 24°46 '07.09''-107°34 '17.05 ' ', cada campo se encuentra seccionado en tablas de aproximadamente 300 m de largo y 90 m de ancho, dichas tablas fueron seccionadas en cuadros de tal manera que se pudiese observar la forma en que la mosca blanca infecta a cada campo agrícola. La toma de muestra se realizó en los meses de octubre de 2006 a abril de 2007, con una frecuencia quincenal de tal forma que se alcanzara a cubrir en su totalidad cada campo, con un total de 507 muestras analizadas, de las cuales 301 correspondieron al campo agrícola #1 y 206 muestras para el campo agrícola #2. La toma de muestra se realizó durante la floración hasta la etapa de producción del cultivo de tomate y consistió en recolectar aproximadamente 10 g de la parte superior de las hojas más jóvenes de la planta con sintomatología y dos muestras más de 10 g cada una, de plantas aparentemente sanas y vecinas a las plantas con síntomas de virus. Las muestras fueron recolectadas en bolsas de plástico estériles y transportadas a temperatura ambiente al Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimentos (LMAA) del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD), Coordinación Culiacán.

Extracción de ADN genómico de plantas. Se empleó la metodología utilizada por Green y Thompson (1999), con modificaciones para la obtención de mejores resultados. Se trituraron 0.5 g de tejido vegetal en un mortero, se agregó nitrógeno líquido para facilitarla ruptura de la célula y la molienda, una vez que se obtuvo un polvo fino se añadieron 3 mL de buffer de extracción de bromuro de cetil trimetil amonio, CTAB (Tris 100 mM, pH 8; NaCl 1.4 M; EDTA 50 mM, pH 8; CTAB 2.5%; PVP 1%; 2-mercaptoetanol 0.2%), se homogenizó y se tomó 1 mL del homogenizado, se incubó a 65°C durante 30 min. Transcurrido el tiempo de incubación, se centrifugó a 16,000 x g por 5 min. Se tomaron 700 μL del sobrenadante en un tubo Eppendorf y se agregó un volumen igual de cloroformo alcohol isoamílico (24:1) (SIGMA), se centrifugó a 16,000 x g por 10 min y se repitió de nuevo. El sobrenadante obtenido fue colocado en un tubo Eppendorf estéril, se agregaron 3.5 μL de ARNasa (Promega) y se incubó a 37°C por 30 min. Una vez trascurrido el tiempo de incubación se precipitó el ADN con 0.8 volúmenes de isopropanol (Faga-Lab), se incubó en hielo por 5 min y se centrifugó a 16,000 x g por 10 min. Se eliminó el sobrenadante con cuidado para evitar traerse la pastilla de ADN, una vez que se obtuvo la pastilla se lavó con 450 μLde etanol al 70% (SIGMA), se centrifugó por 2 min y se eliminó el etanol remanente, se dejó secar un tiempo no mayor de 15 min y se resuspendió el ADN en 40 μL de agua nanopura estéril grado inyectable (Laboratorios PISA), por último, se almacenó a -20°C para posteriores análisis.

Amplificación de ADN viral por PCR anidada. La detección de geminivirus se realizó mediante PCR anidada, con el sistema de detección GoTaq PCR Core Systems 1 (Promega, Corp. Madison WI, USA). La primera ronda de amplificación consistió en usar 2 μL de ADN viral, colocándolos en una mezcla de PCR (MgCl₂ 3 mM, dNTPs 0.4 mM, buffer GoTaq ADN polimerasa 1X, GoTaq ADN polimerasa 1 U, oligonucleótidos sentido y antisentido 0.4 μΜ y el resto de agua) a un volumen final de 25 L. El genoma viral fue amplificado por PCR mediante los oligonucleótidos PAL1v1978 (5'-GCATCTGCAGGC C C ACATYGTCTTYCCNGT-3') y PAR1c715 (5'-GATTT CTGCAGTTDATRTTYTCRTCCATCCA-3') que amplifican una región conservada del componente A de los virus, amplificando una parte del gen Rep, toda la región intergénica y una porción del gen CP, además, permite la amplificación de dos grandes regiones genómicas, que juntas cubren la totalidad del genoma A de los Begomovirus (Rojas, 1994). La amplificación se llevó a cabo en un termociclador de gradiente (Mastercycler, Eppendorf), bajo las siguientes condiciones: 94°C 2 min, 35 ciclos (94°C 1 min, 55°C 1 min y 72°C 1 min) y un paso final a 72°C por 10 min. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, se consideró positiva cuando se observó una banda de 1400 pb (Figura 1A). La segunda ronda de amplificación consistió en utilizar 2 μL, de producto de PCR de la primera ronda, colocándolos en una mezcla de PCR (MgCl₂ 3 mM, dNTPs 0.4 mM, buffer Taq ADN polimerasa 1X, GoTaq ADN polimerasa 1 U, oligonucleótidos sentido y antisentido 0.4 μΜ y el resto de agua) a un volumen final de 25 L. Se utilizaron como oligonucleótidos a RepMot (5'- GAGTCTAGAGGATANGTRAGGAAATARTTCTTGGC -3') y CpMot (5-CGCGAATTCGACTGGACCTTA C ATGGNCCTTCAC-3'), los cuales fueron diseñados para amplificar regiones conservadas de los genes Rep y CP con una amplificación directa sobre la región intergénica, la cual varía de 600 pb para los Begomovirus de América y 750 pb (Figura 1B) para los Begomovirus de Europa (De la Torre et al., 2003) y sus condiciones de amplificación fueron las siguientes: 94°C 2 min, 35 ciclos (94°C 1 min, 65°C 1 min y 72°C 1 min) y un paso final de 72°C por 10 min. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% y se consideraron positivas cuando se obtuvo un fragmento de 600 ó 750 pb.

Identificación de TYLCV y SLCV por PCR. Una vez detectados los geminivirus, se llevó a cabo la identificación de TYLCV y SLCV (Virus del enrollamiento de la hoja de calabaza) con el sistema de detección GoTaq PCRCore Systems 1 (Promega, Corp. Madison WI, USA). La ronda de amplificación para TYLCV consistió en utilizar 2 μL de ADN viral, colocándolos en una mezcla de PCR (MgCl₂ 3 Mm, dNTPs 0.4 mM, buffer GoTaq ADN polimerasa 1X, GoTaq ADN polimerasa 1 U, oligonucleótidos sentido y antisentido 0.4 μΜ y el resto de agua) a un volumen final de 25 L. El juego de oligonucleótidos utilizados fue Rep-DGSAR (5'-G A G T C T AGATGCTGACCTCCTCTAGCWG ATCTGCCGTC-3') y YMAC-Rev (5'-G AG T C T AG AG G RTTAGARGCATGHGTAC ATGCCAT-3'), que amplifican la mitad superior de TYLCV y sus condiciones de amplificación fueron las siguientes: 94°C2min, 35 ciclos (94°C 1 min, 65°C 1 min y 72°C 1 min) y un paso final de 72°C por 10 min. Los productos de la amplificación se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 2% y se consideraron positivas cuando se obtuvo un fragmento 1560 pb. En el caso de la amplificación para SLCV se utilizaron las mismas cantidades de la mezcla maestra y las mismas condiciones utilizadas para la identificación de TYLCV, variando solo en el tipo de oligonucleótidos que se utilizaron, REP-SL2150-for (5'-TGGAATTCTKGAC GCGRTTGGYGTCTTTGGC-3') y YMAC-Rev (5'-G AGTC TAGAGGRTTAGARGCAT GHGTACATGCCAT-3') la cual amplifica la mitad superior del genoma de SLCV observándose un fragmento de 1400pb (Argüello et al., 2004).

Análisis de secuencias de ADN. Las muestras positivas para geminivirus restantes que no resultaron positivas para TYLCV ni para SLCV se secuenciaron en el Laboratorio de Biología Molecular del Instituto de Fisiología Celular de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). El fragmento que se secuenció fue aquel que amplificaba regiones conservadas de los genes Rep y CP con tamaños de 600 pb para los Begomovirus de América y 750 pb para los Begomovirus de Europa (De la Torre et al., 2003). Las 12 secuencias obtenidas se compararon en la base de datos del National Center for Biolotechnology Information (NCBI), utilizando el programa BLAST. Las secuencias obtenidas se compararon con las referidas por el programa BLAST y para obtener el porcentaje de identidad se utilizó el programa MEGA4.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Detección de geminivirus por PCR anidada. Se analizaron 507 muestras de plantas de tomate para geminivirus, colectadas de dos diferentes campos agrícolas localizados en el Valle de Culiacán, Sinaloa. De ellas 197 presentaron la sintomatología característica de daños relacionados con la presencia de virus y 310 estaban ausentes de síntomas visuales (Cuadro 1). Del total de las muestras analizadas, 134 resultaron positivas, el 73.9% de la muestras positivas presentaban la sintomatología característica para TYLCV, mientras que el 26.1% de las muestras positivas carecían de síntomas (Cuadro 2). Morilla et al. (2005) reportan que no existe una correlación entre la presencia del virus y el desarrollo del síntoma, pero que puede existir una relación entre la concentración viral en los tejidos de la planta con la ausencia de síntomas en el caso de plantas de chiles. Esto indica que esta técnica tiene la sensibilidad suficiente para detectar los virus antes de que presenten la sintomatología.

El 26.3% de las plantas con síntomas resultaron negativas (Cuadro 2), lo que sugiere que estas plantas pudieran presentar alguna fitotoxicidad ocasionada por mosca blanca ya que se caracteriza por causar este tipo de daño o bien por potenciar la dispersión de los geminivirus propiciando la aparición de infecciones mixtas (Bedford et al., 1994; PolsonyAnderson, 1997; Jones, 2003). Otra de las causas que pudieran haberse presentado es que las plantas con síntomas pero negativos, se encontraban infectadas con virus que causan síntomas parecidos a los geminivirus transmitidos por B. tabaci pero que no pertenecen a este grupo, como lo son: Carlavirus, Luteovirus, Nepovirus, Potyvirus, Closterovirus, por lo que es recomendable hacer el diagnóstico de laboratorio para determinar con exactitud el tipo de virus que ocasiona el daño a las plantas (Dardón et al., 1994).

Identificación de TYLCV y SLCV. De las muestras positivas para geminivirus, se identificó la presencia de dos distintas especies de geminivirus pertenecientes al género Begomovirus, el Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV, por sus siglas en inglés) y el Virus del enrollamiento de la hoja de calabaza (SLCV). Se encontró que el 64.2% de las muestras positivas pertenecían al virus TYLCV, el 22.4% pertenecían al virus SLCV y el 6.7% presentaron coinfección con ambos virus (Cuadro 3). Este tipo de infecciones mixtas son comunes en regiones tropicales y subtropicales, además la coinfección entre dos virus en algunos casos es un prerrequisito para que la recombinación pueda ocurrir. Tales infecciones han sido reportadas frecuentemente en cultivos como el tomate en diferentes regiones (Torres et al., 1996; Sánchez et al., 1999; Accotto et al., 2003; Méndez et al., 2003; Ribeiro et al., 2003; Xie y Zhou, 2003; Jovel et al., 2004; Chowda et al., 2005).

El TYLCV es una amenaza a nivel mundial para el tomate y otros cultivos agrícolas (Khan et al., 2007). Recientemente el TYLCV fue reportado en el estado de Sinaloa ocasionando pérdidas importantes en tomate durante la temporada otoño-invierno 2006-2007 (Gámez et al., 2006). Mientras el SLCV se ha encontrado distribuido principalmente en EUA (Arizona, Texas y California) y ha sido reportado en otros países como Guatemala, Honduras, México (Sinaloa y Sonora), Nicaragua y Panamá, infectando distintos hospederos naturales como sandía, melón, azafrán y diferentes especies de calabaza (Schuster, 2004). Sin embargo, no existen reportes que describan el hallazgo en plantas de tomate, por lo que el presente trabajo constituye el primer reporte de este virus infectando un nuevo hospedero; el hallazgo coincide con el hecho de que en la misma región agrícola se siembra también calabaza.

Análisis de secuencias de ADN y su relación con otros geminivirus. Doce de las muestras que amplificaron para geminivirus, pero no amplificaron para TYLCV ni para SLCV, fueron secuenciadas y comparadas con otras secuencias de geminivirus reportadas en el GenBank del NCBI, mediante BLASTn para identificar a qué tipo de geminivirus corresponden. Las secuencias denominadas GEM#CIADCLN fueron las obtenidas de este trabajo. Las secuencias GEM301CIADCLN, GEM78CIADCLN y GEM298CIADCLN mostraron una similitud del 100% con el Virus del enrollamiento de la hoja amarilla del tomate (TYLCV Guasave y TYLCV Sinaloa), este grupo de secuencias presentan un 99% de similitud con GEM71CIADCLN y con el segmento A del Virus de la hoja enrollada de las cucurbitáceas (Curcubit leaf curl virus, CuLCrV). Las secuencias GEM13CIADCLN, GEM 1 2 CI AD CLN, G E Μ 3 5 C I A D C L N, GEM23CIADCLN y GEM15CIADCLN presentan una similitud de l99.9 % con el Virus chino del tomate de Sinaloa (Chino del tomate virus isolate Sinaloa, CdTV) y del 99.1% con el grupo de secuencias GEM301CIADCLN, GEM78CIADCLN y GEM298CIADCLN. Las secuencias GEM34CIADCLN y GEM48CIADCLN presentan una similitud del 99.9% con la del Virus de la vena amarilla del chile huasteco de Sinaloa (Pepper huasteco yellow vein virus, PHYVV). La secuencia GEM22CIADCLN presenta una similitud del 99.7% con el Virus de la hoja enrollada de la calabaza (Squash leaf curl virus, SQLCV) y del 97.4% comparado con los otros grupos de secuencias (Figura 2). El análisis de secuencias muestra una relación cercana con algunos Begomovirus que han sido reportados anteriormente en plantas de tomate, entre ellos, TYLCV y CdTV, dichos virus han sido reportados recientemente por coinfectar no solamente plantas de tomate sino también plantas de chile (Cárdenas et al., 2010). Por lo que es importante continuar con el monitoreo de estos virus ya que pueden infectar uno o varios cultivos y ocasionar pérdidas en éstos.

 

CONCLUSIONES

Mediante la técnica de PCR anidada se detectó la presencia de geminivirus en muestras de plantas de tomate con o sin síntomas en los campos agrícolas del Valle de Culiacán, durante el ciclo agrícola 2006-2007. Los geminivirus identificados corresponden al Virus del enchinamiento de la hoja amarilla del tomate (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) y Virus del enchinamiento de la hoja de calabaza (Squash leaf curl virus, SLCV).

El SLCV, no se ha reportado en plantas de tomate. Mediante PCR anidada y posterior secuenciación se identificaron los virus TYLCV Guasave, TYLCV Sinaloa, CuLCrV segmento A, y variantes de los virus STLCVAV1, PHYVV y CuLCrV segmento B. La presencia de más de un virus infectando a las plantas de tomate, complica la identificación basado solo en síntomas visuales, por lo que es de gran importancia contar con metodologías como la PCR para dar diagnósticos precisos, que permitan tomar las acciones pertinentes a cada problema.

 

AGRADECIMIENTOS. Los autores agradecen al Dr. Gerardo Argüello Astorga por el apoyo metodológico para la detección de geminivirus, al Dr. Osvaldo López Cuevas y a la Q.F.B. Célida Martínez Rodríguez por su asistencia técnica.

 

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