Materiales y Métodos

Sitio de estudio. Se delimitó un bloque de 0.5 ha en un huerto comercial, compuesto por 30 ha de limón persa de cuatro años de edad ubicado en Tizimín, Yucatán y con presencia de la enfermedad desde 2010. El manejo agronómico incluyó riego por goteo, fertilización, poda y control químico de D. citri.

Evaluación de síntomas y severidad. La evaluación de severidad se realizó en 388 árboles con una escala aritmética. Dicha escala consideró las clases: 0=sano, 1=25, 2=50, 3=75 y 4=100 %. El porcentaje de severidad se calculó con la división del dosel del árbol en cuatro secciones de 25 %. La severidad total (Sevt) por árbol fue la suma del porcentaje de cada sección (s) _. Donde s= 1-4.

Diagnóstico y cuantificación de la concentración de CLas mediante PCR cuantitativo. El tejido vegetal se colectó en Marzo de 2011, época favorable para la multiplicación de la bacteria y expresión de síntomas. Cada muestra consistió de ocho hojas, se separaron muestras por secciones sintomáticas y asintomáticas en árboles enfermos. Del mismo modo se muestrearon árboles sanos como testigos. El análisis molecular consistió en el aislamiento de ADN con DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen (r)) para 100 mg de tejido vegetal con el protocolo del fabricante. La detección y cuantificación se realizó en un termociclador Biorad(r) CFX96, con sonda TaqMan(r) e iniciadores específicos para CLas que amplifican una porción del gen 16S rDNA, así como una sonda e iniciadores para la enzima citocromo-oxidasa (COX) como control interno de la reacción. (^{DGSV-CNRF, 2008}; ^{Li et al., 2006}).

Para la cuantificación del número de copias genómicas de CLas en las muestras, se generó una curva de calibración externa. Se utilizó el fragmento del gen 16S rDNA clonado en un plásmido PGEM-T (r) Promega(r)). El plásmido se purificó y cuantificó por uv-espectrofotometría (Nanodrop 1000) y se realizaron diluciones seriales; estas se sometieron a amplificación con tres repeticiones por concentración y se utilizó una regresión logarítmica para estimar la concentración de CLas (y) donde y = (-6.221) * LN(Ct) + 27.409.

La determinación de la relación de la severidad de síntomas con la concentración bacteriana, se realizó mediante el ajuste de un modelo cuadrático.

Evaluación de variables morfológicas y organolépticas en frutos. Los frutos se colectaron, etiquetaron y se conservaron en refrigeración a 4°C hasta su evaluación entre el segundo y quinto día después de la cosecha. Las variables morfológicas medidas fueron peso por fruto (gr), diámetro ecuatorial (DE), diámetro polar (DP), grosor de cáscara (GC) (mm) y volumen de jugo (VJ) (mL) de 10 frutos por tratamiento. Las variables organolépticas se midieron en el jugo extraído de los frutos, principalmente se determinó la concentración de grados Brix con un refractómetro digital (Palette(r)), pH con un potenciómetro (HACH(r)), y acidez titulable con el método de fenolftaleína (^{Helrich, 1990}).

Análisis estadístico. El experimento consistió en un diseño de bloques con tratamientos apareados, árboles sanos (T1) adyacentes a árboles enfermos, de los cuales se diferenciaron ramas asintomáticas (T2) y sintomáticas (T3). Se seleccionaron 32 árboles distribuidos en seis bloques en sub-repeticiones incompletas con cuatro, seis y ocho árboles. Los bloques se seleccionaron en forma dirigida a focos de enfermedad. Esta metodología es análoga a la empleada por ^{Cristóbal et al. (2006)} para reducir la variabilidad de los datos por efectos de intensidad y periodos de infección, fertilidad de suelo y manejo agronómico del huerto. Para la evaluación de las variables morfológicas y organolépticas, en cada árbol se colectaron 10 frutos en T1, T2 y T3. Las medias de cada variable por árbol se organizaron por tratamientos, severidad y bloque para un ANOVA y comparación de medias con Tukey (P=0.05). Los análisis se realizaron con SAS V9.0. Adicionalmente, se realizó un análisis correlativo de pérdidas con 10 árboles por cada clase de severidad (50 árboles), para así incrementar la variabilidad del efecto de producción en función del daño. Previo al análisis correlativo, se detectaron posibles observaciones fuera de tendencia y se excluyeron. Los valores de cada variable evaluada y el porcentaje de severidad de cada árbol se ajustaron independientemente a distintos modelos correlativos.

Resultados y Discusión

Descripción de los síntomas de HLB en limón persa. Los frutos de limón persa que se evaluaron en este estudio carecieron de los síntomas característicamente atribuibles a HLB como los que se indicaron previamente para cítricos dulces (^{Bassanezi et al., 2009}) y para limón mexicano, como maduración irregular y caída de frutos (^{Robles-González et al., 2013}), lo anterior se registró aún en frutos provenientes de árboles con severidad del 100%.

En el presente estudio los síntomas de HLB se detectaron en hojas de limón persa, sin un patrón de distribución en el dosel de los árboles. Los síntomas que se observaron (Figura 1) iniciaron con moteados difusos (A) que aumentaron de tamaño hasta definirse claramente y formar manchas angulares internervales (B), las cuales se distorsionan en puntos cloróticos que invaden la lámina foliar (C). En plantas con infección severa se observa engrosamiento y acorchamiento de la nervadura central (D) con un aspecto coriáceo; finalmente se apreció un amarillamiento medianamente intenso y generalizado en la lámina foliar (E) sin llegar a la abscisión como sucede en limón mexicano y cuyos síntomas ocurren con mayor velocidad (^{Robles-González et al., 2013}). En naranja dulce, estos síntomas son menos intensos ya que el amarillamiento generalizado de la lámina foliar ocurre en poca frecuencia y no se observa defoliación de las mismas (^{Esquivel-Chávez et al., 2012}). Estos autores también indicaron esta tendencia en síntomas histológicos, lo que sugiere que en México los cítricos agrios exhiben síntomas con mayor velocidad, intensidad y generalización en el dosel que los que se registraron en otros países (^{Bové, 2006}; ^{Brlansky et al., 2009}).

Figura 1 Síntomas de HLB en limón persa (C. latifolia) confirmados como positivos por PCR cuantitativo. (A) Moteado difuso; (B) Manchas angulares; (C) Manchas angulares y puntos cloróticos; (D) Engrosamiento y acorchamiento de nervadura; (E) Amarillamiento generalizado de la lámina foliar; (F) Frutos de rama sintomática con amarillamiento asociado a HLB; (G) Fruto de rama sana. Tizimín, Yucatán, 2011. 

Diagnóstico y cuantificación de la concentración de CLas en limón persa. Se confirmó por PCR en tiempo real la condición sanitaria de los árboles seleccionados como sanos y enfermos. Los árboles infectados mostraron diferentes concentraciones de CLas, de manera preliminar se detectó que la intensidad de los síntomas inducidos está en función de la concentración bacteriana. La asociación de la concentración de CLas y la severidad se demostró con el ajuste a un modelo de correlación cuadrático y= 1.1736+0.774x-0.0057x², R²= 0.91 (Figura 2).

Figura 2 Correlación de la severidad del HLB en limón persa vs concentración de CLas (número de copias del gen 16S rDNA estimada por PCR en tiempo real, en árboles sanos y enfermos con distinto grado de severidad de HLB). La línea y el modelo representan el ajuste mediante una regresión cuadrática. 

La relación de la concentración bacteriana con la severidad de HLB sugiere que la expresión de síntomas posee una relación directa con el incremento de inóculo de la bacteria en la planta, lo cual explica que a mayor severidad exista mayor efecto negativo en la producción de limón persa (Figura 4). Esto confirma los resultados obtenidos con PCR de punto final en los cuales la detección es exitosa solo en muestras con síntomas evidentes de la enfermedad (^{Teixeira et al., 2008}); o lo contrario, como lo es la dificultad de realizar detecciones en infecciones latentes, cuando la concentración bacteriana es baja (^{Li et al., 2008}).

Figura 3 Comparación de medias de peso (A), diámetro ecuatorial (B), diámetro polar (C), grosor de cáscara (D), volumen de jugo (E), pH (F), Grados Brix (G) y acidez titulable (H) evaluadas en frutos de limón persa (C. latifolia) provenientes de árboles sanos y de ramas sintomáticas y asintomáticas de árboles positivos a CLas. Para cada variable, barras con al menos una letra en común son estadísticamente iguales Tukey (P= 0.05). Las líneas en las barras representan el error típico. 

Figura 4 Correlación entre severidad de HLB y variables morfológicas: peso (A), diámetro ecuatorial (B), diámetro polar (C), grosor de cáscara (D) y volumen de jugo (E); y organolépticas pH (F), Grados Brix (G) y acidez titulable (H), de frutos de limón persa (C. latifolia). La línea y el modelo representan el ajuste mediante una regresión cuadrática. 

Estimación de pérdidas con análisis de varianza. Las variables peso, diámetro ecuatorial y polar, grosor de cáscara, volumen de jugo y pH fueron estadísticamente mayores en árboles sanos (T1) con respecto a frutos de ramas sintomáticas (T3) (Tukey, P=0.05) (Figura 3). Estos resultados muestran que la concentración bacteriana, aún en una infección reciente (15 meses), influye negativamente en las variables morfológicas y organolépticas que se evaluaron. En este efecto influye el patrón productivo del limón persa, ya que en los árboles, los frutos se concentran en ramas con crecimiento secundario en la parte externa del dosel aún con crecimiento activo (^{Agustí et al., 1995}; ^{Davies y Albrigo, 1994}).

Las variables de grados Brix y acidez titulable no fueron estadísticamente distintas entre T1 y T3. No se observó diferencia entre frutos de ramas asintomáticas y sintomáticas (T2 y T3), excepto en la variable diámetro, probablemente porque el efecto fisiológico no depende únicamente del alojamiento de CLas en el floema del tejido analizado, sino en la interferencia de la movilización de fotoasimilados por alojamiento de CLas en ramas primarias (^{Esquivel-Chávez et al., 2012}). Entre T1 y T3 la mayor reducción fue en peso con 17.31 % y volumen de jugo con 18.62 %. En grosor de cáscara fue de 12.2 %, diámetro polar 10 % y diámetro ecuatorial 6.2 %. En el caso de las variables organolépticas solo se observó reducción en pH con 6.4 % (Cuadro 1).

^ℓ Valores con al menos una letra en común en las columnas son estadísticamente iguales (Tukey, p≤0.05).

^ℓℓ Factor T1 (sano), T2 (asintomático) y T3 (sintomático) fueron confirmados por PCR en tiempo real.

^ℓℓℓ El porcentaje se calculó con la diferencia de medias entre frutos de árboles sanos y de ramas sintomáticas. *DE=Diámetro Ecuatorial, DP=Diámetro Polar, GC= Grosor de Cáscara, VJ= Volumen de Jugo.

Cuadro 1 Efecto de Candidatus Liberibacter asiaticus en variables morfológicas y organolépticas de frutos de limón persa (C. latifolia). 

La reducción en las variables peso y volumen de jugo se explica por la relación fisiológica directa entre ellas, ya que a mayor peso de fruto mayor es el volumen de jugo (^{Davies y Albrigo, 1994}). El efecto de CLas en T3 en comparación con T1 (Cuadro 1) se traduce en pérdidas en la producción del 17.3 % por año productivo, más de lo que ^{Salcedo et al. (2010)} estimaron en ausencia de la enfermedad, ya que en su estudio indicaron que ocurrirían pérdidas del 17.6 % en cítricos agrios y 52.7 % en naranja dulce hasta después de cinco años del ingreso de CLas a México. Además, dichos investigadores explicaron que el mayor impacto productivo del HLB sobrevendría en naranja dulce; esta observación posiblemente obedeció a la falta de información de escenarios epidémicos en cítricos agrios y a que se utilizaron datos de epidemias en naranja dulce para fines comparativos.

En Brasil, ^{Bassanezi et al. (2009)} detectaron pérdidas en peso entre 17.5 % (Valencia temprana y 42.3 % (Valencia tardía) por efecto de Candidatus Liberibacter spp. En esta región la enfermedad es endémica, lo que implica una exposición prolongada de los árboles a la infección bacteriana, ya que la detección se realizó en 2004. En el presente estudio, las pérdidas detectadas fueron similares a Valencia temprana (17.3 y 17.5 %) aun cuando la plantación evaluada presentó solamente un periodo de 6-15 meses de exposición a la infección bacteriana, por lo que las pérdidas en periodos de exposición y desarrollo de la enfermedad similares a los de Brasil podrían ser mayores en limón persa, máxime cuando la severidad de los síntomas visuales e histológicos son más intensos que los que se indican para naranja dulce (^{Esquivel-Chávez et al., 2012}). Adicionalmente, la mayor frecuencia de brotación vegetativa de los cítricos agrios permite periodos de infección prolongados e incremento de la bacteria, debido a la asociación con infestaciones frecuentes de vectores infectivos (^{Grafton-Cardwell et al., 2013}; ^{Hall et al., 2013}; ^{Robles-González et al., 2013}).

Estimación de pérdidas con modelos correlativos. La asociación de la severidad del HLB con variables morfológicas y organolépticas se confirmó con el ajuste a modelos cuadráticos correlativos (Figura 4). A pesar de la selección apareada de árboles sanos y enfermos para evitar efectos de variabilidad en fertilidad del suelo y manejo agronómico, fue necesario eliminar datos aberrantes los cuales se asociaron con árboles de bajo vigor (12/50); no obstante lo anterior, se mantuvo un número de árboles en observación aún superior al que utilizaron en un estudio similar ^{Bassanezi et al. (2009)} donde se estudiaron de 14 a 21 árboles por periodo de cosecha y variedad.

Las variables que mostraron mayor correlación con la severidad fueron las morfológicas ya que se ajustaron a los modelos cuadráticos. Los modelos obtenidos en el presente estudio fueron los siguientes: Y_PESO =217.21-4.1958x+0.0288x², (R²=0.86); Y_DC =106.75-1.92x+0.014x², (R²=0.87); Y_DP =131.7-2.30x+0.0169x², (R²=0.87); Y_GC =6.56-0.12x+0.0008x², (R²=0.85); Y_VJ =645.4-11.7x+0.09x², (R²=0.82). En las variables organolépticas solo pH se ajustó con el modelo Y_pH =2.17-0.0117+9E-05x², (R²=0.83). Grados Brix y acidez titulable no se asociaron significativamente con la severidad y tampoco se encontró un efecto claro de la bacteria sobre estas. Esto posiblemente se debió a la fisiología de frutos de limón persa, los cuales tienden a acumular bajas concentraciones de azucares y que por la naturaleza de los desórdenes fisiológicos inducidos por CLas, se requiera un periodo de infección más prolongado para inducir una alteración detectable en estas variables (^{Davies y Albrigo, 1994}). La variabilidad de los datos de producción debido al vigor de árboles por efectos multifactoriales de manejo se observó en un estudio similar con naranja dulce realizado en Brasil, donde la dispersión de los datos en la correlación del peso de frutos con severidad del HLB fue alta con coeficientes de determinación bajos (R²=0.4) (^{Bassanezi et al., 2011}); sin embargo, en ese estudio se combinaron cosechas de diferentes años (2004-2007) con periodos distintos de endemicidad (periodo de infección), lo anterior se evitó en nuestro estudio donde se obtuvo una mejoría sustancial en los coeficientes de determinación de los modelos generados.

En una infección sistémica o crónica como la que induce CLas, las pérdidas que se obtuvieron en este estudio (17.3 %) pueden aumentar con el tiempo a consecuencia del debilitamiento paulatino y muerte productiva del árbol (^{Da Graca, 1991}; ^{Gottwald et al., 2007}; ^{Bassanezi et al., 2011}). En nuestro estudio, se estimaron pérdidas en limón persa en un monto de 17.3 % después de 15 meses de ocurrir la infección; es predecible que ante la falta de medidas efectivas para el control del patógeno, anualmente el deterioro incrementará hasta probablemente superar los registros de pérdidas indicados para naranja (^{Bassanezi et al., 2011}) y llegar hasta la muerte del árbol. Por otra parte, en un proceso epidémico del HLB se requieren varios ciclos de infección para alcanzar una incidencia del 100 % de los huertos. Es necesario que los modelos de pérdidas integren esta consideración para evitar sobreestimar los impactos de la enfermedad (^{Salcedo et al., 2010}).

Conclusiones

A quince meses de la detección de Candidatus Liberibacter asiaticus en un huerto de limón persa (C. latifolia) de la región de Tizimín, Yucatán, México, se encontró que el HLB produjo un efecto perjudicial en el tamaño, grosor de cáscara, pH, volumen de jugo y peso de los frutos. En las últimas dos variables, se encontró la mayor reducción con 18.62 y 17.31 %, en frutos de árboles con HLB en comparación con frutos de árboles sanos, en un ciclo productivo. La reducción en peso implicó una pérdida en producción de 2.4 toneladas/ha, la cual estuvo en función del incremento de la severidad del HLB en el dosel del árbol (R²=0.8-R²=0.87), y de la concentración bacteriana, la cual se estimó por PCR cuantitativo. Este estudio constituye la primera evidencia cuantitativa del efecto de Candidatus Liberibacter asiaticus en limón persa, bajo la condición de reciente ingreso en México.