Aislamiento de cepas bacterianas de plantas ornamentales enfermas

De cada planta enferma, se tomó una muestra de 0.1 g de la base de tallos o de hojas con alguna mancha necrótica. Se lavaron con agua de la llave y se desinfectaron con una solución de hipoclorito de sodio 2 % por 1 min y se enjuagaron con agua destilada por 2 min removiendo el agua excedente con papel absorbente estéril. Cada muestra se colocó en una caja Petri con agar papa dextrosa (PDA), las muestras así tratadas se incubaron a 25 °C por 48 h. Las bacterias crecidas en este medio se re-aislaron tomando masa bacteriana con un asa de siembra y se depositaron en cajas Petri con medio NBY con nistatina a 28 °C por 48 h. Los cultivos puros se guardaron en una solución de glicerol-agua destilada 80 %, a -80 °C.

Obtención de ADN bacteriano y amplificación con PCR

De las colonias bacterianas obtenidas de las plantas ornamentales desarrolladas crecidas y aisladas en medio sólido NBY-N por 48 h a temperatura ambiente (25-28 °C), se tomó una muestra de masa bacteriana con el asa de siembra y se transfirió a un tubo con 2 mL de medio líquido NBY. Los tubos se incubaron en agitación por 12 h a temperatura ambiente. Al término del período de incubación, se tomó 1 mL de la suspensión obtenida, la cual se centrifugó en tubos Eppendorf a 13 000 rpm durante 1 min. Posteriormente, el sobrenadante se decantó y la pastilla se resuspendió en agua destilada estéril para la extracción de ADN. La extracción se realizó con un paquete de PCR (Wizard Genomic DNA Purification Kit, Promega®, Cat. A1120) siguiendo el protocolo del fabricante. La extracción e integridad del DNA se verificó en un gel de agarosa a 1 %.

Los iniciadores de la reacción de PCR fueron rP2 (5' ACGGCTACCTTGTTACGACTT 3') y fD1 (5' AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3') para la amplificación de un fragmento del gen 16S rDNA (Weisburg et al., 1991), el DNA genómico se usó como templado. La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Techne® PHC-3), en un volumen final de 25 μL, los cuales contenían buffer 1 X, 200 μM de dNTP's, 1,5 μM de MgCl₂, 0,4 μM de cada oligonucleótido, 1 U de enzima GoTaq (Promega, Cat. M8295) y 1 μg de DNA genómico. El programa de PCR consistió en un paso inicial de desnaturalización a 94 °C por 5 min, seguido por 35 ciclos de 94 °C por 15 s, 55 °C por 15 s y 72 °C 15 s,y un paso final de 72 °C por 5 min. El análisis de la PCR se llevó a cabo por electroforesis en gel de agarosa a 1.2 % a 80 V por 35 min, utilizando 5 μL de cada muestra. El gel fue teñido con bromuro de etidio (0.5 μg/mL) y observado en un transiluminador.

Secuenciación de las cepas bacterianas

Todas las reacciones de PCR dispuestas para secuenciación se trataron con DNA Clean & Concentrator ^TM-25 Kit de Zymo (Cat. D4033). Posteriormente, se cuantificó el DNA en un nanodrop (Epoch, BioTek). La reacción de secuenciación consistió en 10 ng de DNA por cada 100 pb, 1 μL de oligo (10 pmol), en un volumen final de 16 μL. La secuenciación se llevó a cabo en el Instituto de Biotecnología de la UNAM, con el equipo Perkin (Elmer/Applied Biosystems Modelo 3730), mediante el método Taq FS Dye Terminator Cycle Sequencing Fluorescence-Based.

Las secuencias obtenidas se analizaron con el programa Chromas Lite® y posteriormente, con BLAST (The Basic Local Alignment Search Tool: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)parasualineamiento con la base de datos del GenBank del National Center for Biotechnology Information (NCBI). De los valores cuantitativos observados, sólo se consideraron los de mayor identidad (Cuadro 1).

De las plantas ornamentales muestreadas y con síntomas de necrosis en hojas y tallos, se obtuvieron 12 aislamientos bacterianos, la mayoría de los cuales se caracterizaron por tener color blanco o crema y solo una mostró pigmentos de color rojo. Después de secuenciarlas (Figura 1) se identificaron ocho especies: Kosakonia oryzae, Pectobacterium cypripedii, Burkholderia tropica, Serratia marcescens, Pantoea dispersa, Erwinia cypripedii, Pantoea agglomerans y Erwinia rhapontici (Cuadro 1).

Figura 1 Fragmento amplificado de 1,500 pb del gen 16S con los oligos rP2 y fD1 con PCR. 1. Marcador de peso molecular #SM1373 (Fermentas); 2. Control negativo (reacción de PCR con agua destilada estéril); 3. Control positivo (templado del genoma de Clavibacter sp.); 4. K. oryzae; 5. K. oryzae; 6. P. cypripedii; 7. B. tropica; 8. S. marcescens; 9. E. rhapontici/Pantoea dispersa; 10. P. dispersa; 11. P. cypripedii; 12. P. agglomerans/P. cypripedii; 13. P. cypripedii; 14. B. tropica; 15. B. tropica. 

Las especies bacterianas identificadas fueron: Kosakonia oryzae, Pectobacterium cypripedii, Burkholderia tropica, Serratia marcescens, Erwinia rhapontici, Pantoea dispersa, Pantoea agglomerans y Pectobacterium cypripedii. La mayoría de los géneros identificados excepto Burkholderia, pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, que comprende varios géneros de bacterias patógenas importantes de humanos, animales y plantas (^{Hauben et al., 1998}; ^{Young y Park, 2007}). Por otra parte, Burkholderia pertenece a la familia Burkholderiaceae. Este género es conocido por su adaptabilidad a diversos hábitats tales como sedimentos de agua fresca, tejidos de plantas, animales y seres humanos. También se usa para promover el crecimiento de plantas, biocontrol de patógenos de plantas, fitorremediación y degradación xenobiótica (^{Paganin et al., 2011}).

K. oryzae con sinónimos Enterobacter guangdongense, Enterobacter oryzae (^{UniProt Taxonomy, 2014}), se ha reportado como una bacteria que fija nitrógeno en las raíces de arroz (^{Peng et al., 2009}), y por el momento no se tiene reportada como fitopatógena. En este mismo sentido, la bacteria Burkholderia tropica, también es considerada fijadora de nitrógeno, con importantes aplicaciones agro biotecnológicas como la actividad antifúngica para el biocontrol de hongos fitopatógenos de interés agrícola (^{Tenorio-Salgado et al., 2013}).

P. cypripedii, cuyo nombre anterior era Erwinia cypripedii (^{UniProt Taxonomy, 2014}), produce la enfermedad llamada podredumbre café de las orquídeas (^{Plantwise, 2014}), es una bacteria que afecta plantas como el papayo (Carica papaya) y diferentes tipos de orquídeas, como la zapatilla de dama o sandalia de Venus (Paphiopedilum), y la orquídea var. Luna (Phalaenopsis amabilis) entre otras (^{Plantwise, 2014}). En la que causa manchas foliares de color café oscuro, amarillamientos de hojas, decoloración de tallos, y la muerte de la planta. En el caso de las orquídeas, la enfermedad comienza a manifestarse en forma de pequeñas lesiones húmedas, de color café con aspecto grasiento y ligeramente hundidas (^{Plantwise, 2014}).

También se identificaron dos géneros de Pantoea: P. dispersa y P. agglomerans. La primera tiene potencial para usarse como control biológico contra otras bacterias como Xanthomonas albilineans, la cual produce escaldadura foliar en caña de azúcar (^{Zhang y Birch, 1997}); o contra algunos hongos como Fusarium o Macrophomina, cuando la bacteria se somete a los tratamientos adecuados (^{Gohel et al., 2004}), además actúa como bioestimuladora del crecimiento vegetal (^{Fernández et al., 2008}). Mientras que P. agglomerans, es más conocida por infectar a varios géneros de plantas como Alocasia cucullata, en la cual produce manchas necróticas sobre las hojas y sus márgenes. Las manchas aparecen inicialmente como lesiones irregulares que se agrandan para formar áreas necróticas (^{Romeiro et al., 2006}). En maíz y sorgo causa tizón en la hoja y síntomas de marchitez vascular (^{Morales-Valenzuela et al., 2007}). En cápsulas de algodón infectadas, las fibras no maduran completamente y el tejido de la semilla muestra una coloración marrón (^{Ren et al., 2008}). En arroz causa tizón foliar y pudrición del tallo (^{Lee et al. 2010}). En el nogal (Carya o Juglans) provoca la caída prematura del fruto (^{Yang et al., 2011}). Sin embargo, las dos bacterias pueden comportase como patógenas de humanos (^{Cruz et al., 2007}; ^{Schmid et al., 2003}; ^{Holden et al., 2009}; ^{Cruz et al., 2007}).

En este mismo contexto, Serratia marcescens, otra bacteria identificada en el presente trabajo, se caracteriza por su pigmentación de color rojo debido a la prodigiosina, un pigmento de color rojo brillante que producen ciertas cepas de Serratia (^{Gerber, 1975}). Anteriormente, se consideraba solo como un patógeno oportunista que causa enfermedades en los seres humanos, como cistitis (^{Liu et al., 2004}), conjuntivitis (^{Hume y Willox, 2004}), queratinitis (^{Schaefer et al., 2001}), meningitis (^{Zaidi et al., 1989}) y neumonía (^{Carlon et al., 1977}; ^{Khan et al., 1997}), entre otras. Sin embargo, recientemente algunos informes muestran que esta bacteria puede provocar la enfermedad de la vid amarilla en cucurbitáceas, donde coloniza el floema de las plantas y les produce un aspecto amarillento y marchitamiento del follaje (^{Wick et al., 2001}; ^{Bruton et al., 2003}; ^{Sikora et al., 2012}).

Finalmente, aunque no se observó una diferenciación al 100 % de confiabilidad, de acuerdo a la identificación molecular entre Erwinia rhapontici y Pantoea dispersa, se considera que es necesario completar más pruebas para su correcta identificación. Debido a que mientras P. dispersa no se considera un fitopatógeno, E. rhapontici si lo es, ya que causa la coloración rosa en la cubierta de algunas semillas (^{Schroeder et al., 2002}; ^{Huang et al., 2003a}; ^{Wise et al., 2008}) así como la pudrición de la corona en otras plantas (^{Huang et al., 2003b}).

Conclusiones

Se detectaron ocho bacterias asociadas a plantas ornamentales enfermas en fase de aclimatación in vitro: Kosakonia oryzae, Pectobacterium cypripedii, Burkholderia tropica, Serratia marcescens, Pantoea dispersa, Erwinia cypripedii, Pantoea agglomerans y Erwinia rhapontici. Las tres últimas representan un riesgo fitosanitario.