Materiales y métodos

Los sitios y la metodología de muestreo de las plantas sintomáticas, el aislamiento y obtención de cultivos monospóricos, la extracción de ADN, la identificación molecular y las pruebas patogenicidad de los aislados en cumplimiento con los postulados de Koch se describieron y publicaron por ^{Rentería-Martínez et al. (2018}). En total se identificaron 25 aislados de Fusarium falciforme, cinco de F. brachygibbosum y dos F. oxysporum.

Clasificación de morfotipos. Los morfotipos de cada especie se establecieron con base en el tipo de crecimiento, coloración del micelio y pigmentación del medio de cultivo. Las determinaciones se realizaron en un aislado representativo de cada morfotipo.

Morfología y velocidad de crecimiento de las colonias. Las características macroscópicas de las colonias (tasa de crecimiento del micelio, color de la colonia y pigmentación) se evaluaron en medio PDA. La tasa de crecimiento de cada aislado se determinó tomando un disco de 8 mm de diámetro de colonias de 7 días de desarrollo en PDA y colocándolo al centro de otra placa con PDA. Las placas se incubaron a 27 °C y se midió diariamente el diámetro de la colonia en dos direcciones perpendiculares hasta que el cultivo cubrió completamente la placa. Se evaluaron cinco repeticiones por cada aislado. Se registró la morfología de las colonias y la pigmentación aérea del micelio (^{Nelson et al., 1983}).

Análisis de las características microscópicas. Los diferentes morfotipos se cultivaron en agar hojas de clavel (CLA), de acuerdo con ^{Fisher et al. (1982}). Para promover la formación de clamidosporas, se utilizó agar de suelo (SA), según ^{Klotz et al. (1988}). Los cultivos en CLA y SA se incubaron en las mismas condiciones: 25 °C, 12 h luz /12 h oscuridad durante dos semanas.

Las preparaciones microscópicas en portaobjetos se examinaron con un microscopio de luz compuesto (VELAB^TM). Para observar y medir el tamaño de los conidios, fiálides y clamidosporas se tomaron fotografías a 40X y 100X, luego se analizaron utilizando el software TSView, versión 6.2.4.5. Se midió la longitud y el ancho de cincuenta macroconidios y cincuenta microconidios seleccionados al azar de cada aislado.

Análisis estadístico. Los datos de longitud y ancho de macroconidios y microconidios fueron sometidos a un análisis de varianza y separación de medias por la prueba de Tukey (α<0.05), utilizando el programa JMP v5.0.1a.

Resultados

Clasificación de morfotipos y velocidad de crecimiento. Los 25 aislados de F. falciforme se agruparon en tres morfotipos (Ff-14, Ff-49 y Ff-50), los cinco aislados de F. brachygibbosum en cuatro (Fb-8, Fb-9, Fb-41 y Fb-67) y los dos de F. oxysporum en uno (Fo-38). En el Cuadro 1 se presentan las velocidades de crecimiento y las características macroscópicas observadas en los morfotipos de F. brachygibbosum, F. falciforme y F. oxysporum en PDA. La Figura 1 evidencia la presencia de los cuatro morfotipos patogénicos de F. brachygibbosum, encontrados en los campos de sandía en Sonora.

Características microscópicas. En el Cuadro 2 se resume la morfología de las clamidosporas y las células conidiógenas observada en los aislados representativos de cada morfotipo en las tres especies. En todos los casos se observaron clamidosporas redondas intercalares y terminales, principalmente sencillas y dobles; sin embargo, el mayor grosor en la pared de las clamidosporas de los morfotipos de F. brachygibbosum (Figura 2A) parece ser una característica que lo diferencia de F. falciforme y F. oxysporum (Figura 2B-C). En lo referente a las células conidiógenas, los morfotipos de F. falciforme (Figura 2B) se distinguen de los demás, por tener monofiálides más largas y delgadas.

En el Cuadro 3 se presenta la descripción morfológica de los macroconidios y microconidios de los aislados representativos de cada morfotipo. Se observaron algunas diferencias entre las tres especies. Los cuatro morfotipos de F. brachygibbosum presentaron macroconidios delgados y rectos, con tres a cinco septos, las células del centro ligeramente anchas centro y las intermedias curvadas hacia la parte basal. Las células apicales tuvieron ligera forma de gancho y las células basales la forma típica o ligera forma de pie (Figura 3). Los macroconidios de F. falciforme fueron anchos y rectos o ligeramente curvados, pero con el plano ventral y dorsal paralelos en la mayor parte de su longitud, sus células apicales fueron redondeadas y las basales rectas y cilíndricas con el extremo apenas recortado o redondeado (Figura 4B). La forma de los macroconidios de F. oxysporum fue parecida a la de F. brachygibbosum, pero con células basales puntiagudas y en menor cantidad con forma de pie apenas visible (Figura 4C).

Figura 1 Características morfológicas de las colonias de los 4 morfotipos de Fusarium brachygibbosum en PDA. A = Frente B = Fondo 

Figura 2 A-C: Morfología de clamidosporas. A = F. brachygibbosum, B = F. falciforme y C = F. oxysporum. D-F: Morfología de células conidiógenas. D = polifiálides y monofiálides de F. brachygibbosum, E = monofiálide de F. falciforme y F = monofiálides de F. oxysporum.  

Figura 3 Morfología de las macroconidios de los cuatro morfotipos de F. brachygibbosum. A = células apicales con forma ligera de gancho y B = células basales con ligera forma de pie (Fb-8 y Fb-67) y típica forma de pie (Fb-9 y FB-41). 

Figura 4 Morfología de macroconidios y microconidios de las tres especies de Fusarium patogénicas de sandía. A = ma croconidios de F. brachygibbosum, B = macroconidios de F. falciforme y C) macroconidios de F. oxysporum. D = microconidios de F. brachygibbosum, E = microconidios de F. falciforme y F) microconidios de F. oxysporum.  

Los microconidios de F. brachygibbosum fueron ovales y ocasionalmente ovoides, por lo general con un septo, rara vez con dos o ninguno. Los de F. oxysporum fueron ovales elípticos y en forma de riñón sin septos. F. falciforme presentó microconidios con la parte basal trunca, ovales, elipsoides y reniformes, con algunos piriformes y fusiformes, con ninguno, uno o dos septos (Cuadro 3, Figura 4 D-F). La variabilidad de formas no permitió observar diferencias en los microconidios de las diferentes especies; solo la ausencia de septos en todos los microconidios observados en F. oxysporum (Figura 4F) parece ser un rasgo distintivo.

En el Cuadro 4 se observan las medias de largo y ancho de los macroconidios de acuerdo con el número de septos y el promedio de 50 células. El análisis estadístico permitió detectar diferencias significativas en el largo y ancho promedio de los macroconidios entre los aislados; sin embargo, la variabilidad de tamaños dentro de las especies no permitió establecer diferencias entre ellas. Los macroconidios de los morfotipos Fb-8 y Fb-9 no mostraron diferencias significativas en tamaño con respecto a los morfotipos Fo-38 de F. oxysporum. No se detectó diferencia significativa entre el tamaño de los macroconidios de Fb-41, Fo-39 y Ff-49. Tampoco se observó diferencia significativa entre Fb-67, Ff-50 y Ff-14.

El Cuadro 5 presentan las medias de largo y ancho de los microconidios de acuerdo con el número de septos y el promedio de 50 células. Se detectaron diferencias significativas en el tamaño de los microconidios entre los aislados en general, pero no entre especies. Los morfotipos Fb-41, Fb-67 y Fb-9 presentaron los microconidios de mayor longitud, mientras que Fb-8 fue el de menor tamaño.

Discusión

^{Padwick (1945}) describió que F. brachygibbosum crece en PDA desarrollando abundante micelio aéreo, blanco, con tonos rosados y medio de color rojo-sangre. Con microconidios típicos de forma ovoide a fusiforme, o ligeramente curvados cuando son septados, con ninguno, uno, dos o tres septos. Macroconidios dispersos finamente en la superficie del agar, hiperbólicamente curvados, células centrales anchas y de 0 a 5 septos. Células del ápice afiladas y células basales ligeramente afiladas con forma de pie típica. Clamidosporas terminales e intercalares, simples y en cadenas; generalmente unicelulares y globosas, ocasionalmente de 2 células, lisas, granulares. Esta descripción concuerda con los cuatro morfotipos de F. brachygibbosum encontrados en el presente trabajo; sin embargo, el color de las colonias y del medio solo concuerda con lo observado en Fb-67 y no con Fb-8, Fb-9 y Fb-41.

En general el tipo de micelio, el color de las colonias, color del medio de cultivo y la morfología de los macroconidios y microconidios, observados en los trabajos más recientes sobre F. brachygibbosum (^{Al-Sadi et al., 2012}; ^{Mirhosseini et al., 2014}; ^{Renteria-Martinez et al., 2015}; ^{Stack et al., 2017}; ^{Shan et al., 2017}; ^{Xia et al., 2018}), corresponden al morfotipo descrito por ^{Padwick (1945}). En todos estos estudios se registraron colonias blancas que se tornan amarillo claro con tonos rosa o naranja y el medio PDA teñido en rojo brillante. El crecimiento en CLA permitió observar macroconidios de paredes gruesas, un centro abultado con extremos ligeramente curvados (gancho atenuado) y una célula basal típica en forma de pie o ligeramente en forma de pie, en su mayoría con 4 a 5 septos.

El morfotipo de F. oxysporum desarrolló un micelio aéreo blanco que se tornó purpura después de una semana en PDA, similar a lo descrito por ^{Kleczewski y Egel (2011}) acerca de F. oxysporum f.sp. niveum raza 1, aunque sin formación de esporodoquios. Al cultivarse en CLA, las características de clamidosporas, células conidiógenas, macroconidios y microconidios correspondieron a lo señalado por ^{Leslie y Summerell (2006}), para la especie.

El tipo de crecimiento de las colonias en PDA permite distinguir entre los morfotipos de F. brachygibbosum (aéreo) y los de F. falciforme (postrado). La presencia de monofiálides largas y delgadas, mostradas en los morfotipos F. falciforme (^{Summerbell y Schroers., 2002}), es una característica que permite diferenciarlos de F. brachygibbosum y F. oxysporum, los cuales desarrollaron monofiálides más cortas. La forma de los macroconidios de F. falciforme es otro rasgo que lo distingue de las otras especies. Similar a lo reportado por ^{Chehri et al. (2015}) los macroconidios de esta especie fueron poliseptados, anchos y rectos o ligeramente curvados, con células apicales redondeadas y células basales con extremos apenas recortados.

La coloración desarrollada en el agar, el tipo de células conidiógenas, además de la morfología y tamaño de los macroconidios pueden hacer que F. brachygibbosum sea identificado erróneamente como F. oxysporum, que es más común en la mayoría de los cultivos de la región; pero la morfología de las clamidosporas, específicamente el grosor de la pared, puede ser una característica distintiva que permita diferenciar entre las dos especies. La morfología de las clamidosporas de F. brachygibbosum correspondió con lo observado por ^{Cao et al. (2018}). Otra característica diferente entre estas especies fue la ausencia de septos en los microconidios de F. oxysporum, mientras que en F. brachygibbosum predominaron los de un septo.

La variabilidad en el tamaño de macroconidios y microconidios entre los morfotipos de una misma especie, no permitió diferenciar entre las tres especies de Fusarium.

Se han reportado diferentes tamaños en los conidios de F. brachygibbosum (^{Xia et al., 2018}; ^{Shan et al., 2017}; ^{Mirhosseini et al., 2014}; ^{Al-Mahmooli et al., 2013};), en la mayoría de los casos de menor tamaño a los observados en el presente trabajo. El tamaño de los macroconidios de F. falciforme fue similar a lo reportado por ^{Chehri et al. (2015}). Por su parte, la morfología y tamaño de los macroconidios de F. oxysporum concordaron con lo señalado por ^{Chehri et al. (2011)}.

Conclusiones

Algunas características, tales como: el grosor de paredes en las clamidosporas, la morfología de los macroconidios, el tipo de células conidiógenas y la presencia o ausencia de septos en microconidios pueden ser distintivas y de utilidad en la identificación de F. brachygibbosum, F. falciforme y F. oxysporum, patogénicas en plantas de sandía en cultivos localizados en Sonora, México. No obstante, es necesario que la identificación morfológica sea corroborada con un análisis molecular.