Materiales y métodos

Los ensayos se llevaron a cabo en el Centro de Investigación Hernando Bertoni dependiente del Instituto Paraguayo de Tecnología Agraria (CIHB-IPTA), Caacupé, Paraguay.

Los aislados utilizados, proveniente de las espigas de trigo, fueron identificados morfológicamente según ^{Klaubauf et al., (2014}) e identificados con el marcador molecular específico MoT3 (^{Pieck et al., 2016}). Las evaluaciones previas en materiales de conocida reacción de susceptibilidad y resistencia (Caninde 11 y Milan) confirman su capacidad de infección.

La obtención del inóculo fue lograda mediante la metodología sugerida por ^{Marangoni et al. (2013}). Los pedazos del papel filtro de 0,5 cm de diámetro con aislados conservados, fueron sembrados en placas de Petri con medio de cultivo Agar-Avena (AA) e incubados durante 12 días a 25 °C con fotoperiodo de 12 horas. Posteriormente para forzar la esporulación, se aplastaron los micelios en placa y fueron incubados bajo luz constante por 72 horas.

Las inoculaciones forzadas fueron realizadas en mínimo 6 y máximo 10 espigas por genotipo en el estado fenológico de antesis, utilizando un atomizador 1/5 HP 58 PSI Oilless Airbrush Compressor Kit, a una concentración de 5.10⁴conidios.mL^-1. Se utilizó aproximadamente 0,3 mL de inoculo para cada espiga. Las plantas inoculadas fueron mantenidas bajo condiciones controladas de temperatura (28±2 °C) y humedad (85±5 %), por un periodo de 72 horas para ambos ensayos.

Los TSHs son materiales con amplia variabilidad en cuanto a su reacción a distintas enfermedades. Considerando reacciones diferenciales en P. oryzae, incluso entre aislados viejos y nuevos reportado por ^{Cruz et al., (2016}), se utilizó el valor máximo de reacción (VMR) para clasificar los TSHs y garantizar la reproducibilidad del ensayo. La opción de ponderar el material según el VMR sobre el total de espigas evaluadas permite descartar sesgos por escapes fortuitos a la infección (es decir, plantas susceptibles con reacción nula). Este criterio de clasificación es robusto para selección de materiales según su respuesta a la infección, ya que solo los genotipos con magnitud bajo de VMR muestran resistencia.

Se realizaron dos evaluaciones independientes del trigo sintético. En una primera evaluación, 64 genotipos de TSHs (Cuadro 1), proporcionados por el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT), fueron inoculados con un aislado monospórico (P14ATae039) del hongo P. Oryzae.

En una segunda evaluación, con base a los valores máximos de reacción (VMR) al Brusone en la espiga, 18 materiales fueron seleccionados para una segunda evaluación. Los genotipos seleccionados presentaron VMR de resistentes a moderadamente resistentes y de modo a control de susceptibilidad se incluyeron otros materiales de reacción susceptibles. Para cubrir un mayor rango de variabilidad patogénica, dos aislados virulentos, P14ATae039 y P14YTae031 fueron utilizados en la segunda inoculación.

La reacción de la enfermedad fue evaluada a los 15 días después de la inoculación (DDI), utilizando la escala propuesta por ^{Chavez et al. (2017}) modificada para el VMR de siguiente manera: 0 = Sin infección, 1 = Hasta el 10% de la espiga necrosada (resistente), 2 = Hasta el 40% de la espiga necrosada (moderadamente resistente), 3 = Hasta el 60% de la espiga necrosada (moderadamente susceptible) y 4 = 100% de la espiga necrosada (susceptible). Posterior a este periodo, las espigas de siete genotipos que mostraron resistencia o moderada resistencia en la primera lectura y un testigo susceptible se mantuvieron en condiciones descritas anteriormente, para observar el desarrollo de la infección en espigas para los dos aislados por un periodo de 30 días. Para el progreso de la enfermedad, se utilizó el Diseño Completamente al Azar, cada espiga representa una unidad experimental donde se observó la reacción a los 8, 15, 22 y 30 DDI. El cálculo del valor del área bajo la curva del progreso de la enfermedad (ABCPE) se realizó mediante la función AUDPC (Área Bajo la Curva del Progreso de la Enfermedad, ABCPE) implementada en el paquete agricolae para R versión 3.4.2. Análisis de los datos del ABCPE por aislado se sometieron a un ANOVA y las comparaciones entre medias se realizaron por Test: LSD Fisher Alfa=0,05.

Resultados y discusión

Los datos de la primera infección y la clasificación de los 64 TSHs con base a sus valores máximos de reacción a un aislado (P14ATae039) están presentados en el Cuadro 2.

Con base a la primera evaluación de los trigos sintéticos, más del 10% de los TSHs fueron clasificados como Resistentes (VMR 0-1), un 34% fueron clasificados como moderadamente resistentes o moderadamente susceptibles (VMR entre 2 y 3), y más del 55% como susceptibles (VMR 4).

Al igual que ^{Gul Kazi et al. (2012}) y ^{Das et al. (2015}), las reacciones a enfermedades fúngicas utilizando características fenotípicas se han diferenciado en este estudio. El fenotipado correcto de estos materiales es fundamental para la selección de los TSHs que puedan ser utilizados como progenitores en los programas de mejoramiento y/o en diferentes estudios de caracterización molecular y expresión génica diferencial a la interacción de trigo y P. oryzae.

El VMR de los preseleccionados 18 TSHs, con dos aislados (P14ATae039 y P14YTae031), está graficado en la Figura 1.

Los datos presentados en la Figura 1 muestran que solo uno de los genotipos (TS29) fue resistente a los dos aislados, siete fueron clasificados como intermedios (TS77, TS53, TS101, TS78, TS32, TS22 y TS63), ya que presentan la reacción resistente a moderadamente resistente para uno de los aislados, pero moderadamente resistente a moderadamente susceptibles para el otro. Esta característica de interacción fue reportada por ^{Chávez y Kohli (2018}), donde variedades moderadamente resistentes para un aislado mostraron reacción moderadamente susceptible para el otro. Éste tipo de especificidad de reacciones podría ser explicada probablemente por el flujo genético entre aislados provenientes de distintos huéspedes, lo que le otorga una variación de virulencia a los aislados (^{Gladieux et al., 2018}).

Figura 1 Valores máximos de reacción de 18 TSHs a las infecciones forzadas de dos aislados de P. oryzae. Reacciones al aislado P14ATae039 (P039), y reacciones al aislado P14YTae031 (P031). Caacupé, 2018. 

Los datos presentados en la Figura 2 muestran las diferencias en el desarrollo promedio de la enfermedad entre los genotipos identificados como resistente o moderadamente resistente. Solo tres de los genotipos, TS49, TS53 y TS77 mantuvieron su resistencia o moderada resistencia por el periodo de 30 días. Los materiales TS29, TS73 y TS101 cambiaron su reacción de moderada resistencia a moderada susceptibilidad, cuando el sintético TS78 llegó a ser susceptible a final de 30 días. El TSH TS105, usado como testigo, fue susceptible durante todo su desarrollo. Considerando las reacciones diferenciales que presentan los materiales a los diferentes aislados se analizó el desarrollo de la infección en una segunda instancia y esta presentada en las Figuras 3a y 3b. Los resultados muestran una interacción significativa entre los trigos sintéticos evaluados y los dos aislados de P. oryzae, lo que confirma los resultados de ^{Cruz et al., (2016}), donde los cultivares de Overland y RonL, fueron resistentes para un aislado pero susceptibles para el otro.

Figura 2 El promedio del progreso de la infección a los 8, 15, 22 y 30 DDI en ocho genotipos de trigo sintéticos hexaploides seleccionados. Caacupé, 2018. 

Figura. 3 Evolución de la reacción a la infección y su desarrollo contra aislado P14YTae031 (P031) (a) y P14ATae039 (P039) (b) en ocho trigos sintéticos hexaploides a los 8, 15, 22 y 30 DDI. Caacupé, 2018. 

Los trigos viz. TS29, TS49 fueron relativamente estables en mantener su resistencia o moderada resistencia y otros viz. TS73, TS78 y TS105 fueron moderadamente susceptibles o susceptibles para los dos aislados. Sin embargo, los restantes TSHs viz. TSHs TS53, TS77 y TS101, tienen reacción significativamente diferente entre los dos aislados (Figura 1).

El trigo sintético TS101 fue resistente para el aislado P031, pero susceptible para P039 los trigos TS53 y TS77 fueron de moderadamente susceptible a susceptible para P031, pero resistentes para P039 (Figura 3).

Este resultado es congruente con lo hallado por de ^{Chávez et al. (2018}) quienes observaron interacción de las variedades con distintos aislados de P. oryzae. Esta interacción de genotipos de trigo con diferentes aislados se extiende a un mayor número de aislados bajo estudio (datos no reportados aquí).

Con el objetivo de estudiar el avance de la enfermedad en los trigos preseleccionados, el área bajo la curva del progreso fue calculada para los dos aislados, Cuadro 3.

Si se analizan los datos presentados en el Cuadro 3, en promedio y considerando la interacción trigo por aislado, el avance de la enfermedad para los dos aislados es significativamente diferente. En un estudio similar sobre cuatro aislados de P. oryzae,^{Lule et al. (2014}), no encontraron diferencias significativas en el ABCPE en arroz al interactuar con su hospedero, pero si al comparar entre aislados.

Los datos del área bajo de curva de la enfermedad corroboran la clasificación de los materiales con base al valor máximo de infección, sin tener en cuenta los materiales con reacción diferencial. Solo los trigos sintéticos TS29 y TS49, cambiaron su clasificación en base al valor máximo de infección y área bajo la curva de la enfermedad.

El TS29, clasificado moderadamente resistente por su valor máximo de infección fue considerado moderadamente susceptible por presentar un mayor desarrollo de la enfermedad post posterior a la evaluación de 15 DDI.

La situación del TS49, fue completamente opuesta a la reacción del TS29, y que tuvo un desarrollo mucho más lento para llegar a una menor ABCPE. Esta estrategia de selección mediante ABCPE, para éste patógeno, también fue utilizada por ^{Prabhu et al. (2003}) para clasificar la reacción de seis líneas élites de arroz en un programa de mejoramiento. ^{Jeger y Viljanen-Rollinson (2001}) concuerdan que el progreso de la enfermedad es una estimación más acertada y precisa para la selección de materiales para un programa de mejoramiento o estudios genéticos, permitiendo identificar los materiales más estables en el tiempo.

Considerando la variabilidad genética existente entre las diferentes colecciones de Ae tauschii cruzadas para la obtención de los TSHs, este tipo de reacciones son esperadas. Resultados similares, fueron reportadas por Guz Kazi et al., 2012 y ^{Masood et al., (2016}) en sus estudios sobre reacción a las enfermedades como en características agronómicas y de calidad en general.

En un estudio asociado al genoma completo del trigo, ^{Jighly et al., (2016}) han mapeado regiones conocidas para resistencia múltiples a patógenos fúngicos en una colección de TSHs. Además de identificar la presencia de combinaciones previamente reportadas en trigos harineros, ellos pudieron observar interacciones para varias enfermedades individualmente. Su afirmación que el uso de marcadores para la introducción de resistencias múltiples a las enfermedades desde TSHs puede ser una fuente importante para la creación de las variedades elite es muy válida para el caso actual donde las fuentes de resistencia son muy limitadas.

Cabe mencionar que hasta ahora no se ha identificado marcadores moleculares para la resistencia a P. oryzae que convaliden su presencia en los TSHs. Aunque TS29 y TS49 pueden ser considerados como progenitores para los programas de mejoramiento y pueden ser combinados entre sí, son los genotipos como TS49, los más valiosos para otorgar un mejor grado de resistencia y bajo progreso de la enfermedad hasta final de la infección.

Conclusión

Aprovechando de la amplia variabilidad que existe en los trigos sintéticos hexaploides, nuevas fuentes de resistencia a Brusone en trigos, provenientes de distintos orígenes genéticos, fueron identificados. Estos recursos genéticos representan un gran avance en la búsqueda de mayor variabilidad para resistencia a P. oryzae en trigo, cuya base actual es muy estrecha y que pueden servir como fuente para transferir su resistencia a las futuras variedades a nivel mundial.