El frijol es consumido por el 97 % de la población costarricense, es un grano fundamental para la seguridad alimentaria y nutricional del país, y su producción está principalmente en manos de pequeños productores (<5 ha) (^{Hernández-Fonseca, 2009}; ^{Rodríguez-González y Fernández-Rojas, 2015}). El cultivo enfrenta una serie de limitantes, como las enfermedades, que pueden reducir significativamente la productividad (^{Schoonhoven y Voysest, 1994}). Entre ellas, los patógenos de la raíz como Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Fusarium sp. y Pythium sp. tienen el potencial de causar pérdidas entre un 80 y 100% en rendimiento (^{Singh y Schwartz, 2010}; ^{Méndez-Aguilar et al., 2013}).

La manera más eficiente de combatir los problemas patológicos, y en especial las enfermedades del suelo, es a través de la generación de cultivares resistentes (^{Mendes et al., 2019}). Desde 1995, en Costa Rica se trabaja bajo la metodología de fitomejoramiento participativo, lo que ha permitido generar variedades con mayor resistencia a problemas bióticos y abióticos, alta productividad y mejor adaptadas a las condiciones de pequeño productor (^{Hernández et al., 2018}).

El cambio en el uso de variedades comerciales, las alteraciones en el clima y la incorporación de nuevas áreas de cultivo, han favorecido el progreso de epidemias de pudrición radicular en Costa Rica, asociadas principalmente a Fusarium solani f. sp. phaseoli, Athelia rolfsii (sin. Sclerotium rolfsii) y Macrophomina phaseolina (^{Araya y Hernández, 2003}; ^{Araya y Hernández, 2006}). Sin embargo, la presencia de dichos agentes causales no se ha demostrado, y las publicaciones existentes se basan únicamente en la comparación de síntomas de campo con los reportados en la literatura; no hay referencias de aislamientos ni de identificación a nivel molecular. Debido a lo anterior, el objetivo de la presente investigación fue identificar morfológica y molecularmente los hongos asociados a las pudriciones radicales y marchitez del frijol común en las principales zonas productoras de Costa Rica.

Para este trabajo, se recolectaron 120 plantas en diferentes estados fenológicos (desde plántulas a plantas en llenado de vainas), distribuidas en ocho fincas de la región Brunca (2017 y 2018) al sureste de Costa Rica, y 12 de la región Huetar Norte (2019 y 2020), al norte del país. Se muestreó en parcelas de las líneas experimentales ALS 0536-6 e IBC 302-29, así como de las variedades comerciales Brunca, Cabécar, Chánguena, Guaymí, Nambí y Tayní (^{Hernández-Fonseca y Araya-Villalobos, 2009}; ^{Hernández-Fonseca y Chaves-Barrantes, 2016}).

Se recolectaron tres plantas con síntomas y tres asintomáticas de cada finca. Las plantas asintomáticas se colectaron para aislar hongos endófitos con posible capacidad antagónica. Se tomaron secciones de tejido y se lavaron con agua y jabón, luego se desinfectaron con alcohol al 70% por 1 min y se realizaron aislamientos en medio de cultivo agar-agua-rosa de bengala-cloranfenicol, se incubaron por siete días en oscuridad, entre 23 y 25 °C. Se realizaron cultivos de punta de hifa en agar-agua 30 g L^-1 (3%) y la identificación de morfotipos en papa dextrosa agar (PDA), de acuerdo con las descripciones de ^{Leslie y Summerell (2006}) y ^{Seifert et al. (2011}). Con estos datos se calculó el porcentaje de frecuencia relativa (% FR) de acuerdo con ^{Mueller et al. (2004}), mediante la fórmula: % FR = (número de aislamientos de cada especie/número total de aislamientos) x 100. Se seleccionaron los más frecuentes para realizar la identificación molecular.

El ADN se extrajo con el kit Prepman Ultra y se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con los iniciadores ITS-5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) e ITS-4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) de la región del espaciador interno transcrito del ADN nuclear ribosomal (nrDNA ITS por sus siglas en inglés) (^{Schoch et al., 2012}). Se preparó una reacción de PCR (25 µL) según ^{White et al. (1990}), los productos se enviaron a Macrogen (USA) para su purificación y secuenciación. Las secuencias obtenidas se editaron y alinearon con el uso de Geneious, versión 10.2.3, y se compararon con las disponibles en GenBank por medio del algoritmo BLASTn. Se consideró como identificación positiva de especie si las secuencias obtuvieron similitudes de 100%, como posible especie si obtuvieron 99% (se anotó el sufijo cf.) y si obtuvieron entre 96-98% como especie relacionada (se anotó el sufijo aff.) (^{Hofstetter et al., 2019}). Para el rango de género se consideró una similitud del 97% (^{López et al., 2017}).

Los 155 aislamientos recuperados, tanto de plantas con síntomas como asintomáticos, se clasificaron en nueve morfotipos (Figura 1). Los hongos con mayor porcentaje de frecuencia relativa fueron M. phaseolina (26.7), F. oxysporum (13.6) y A. rolfsii (5.6).

Los hongos recuperados variaron de acuerdo al año y a la región de muestreo. Por ejemplo, A. rolfsii fue posible recuperarlo los cuatro años de muestreo en ambas regiones, mientras que M. phaseolina solo se aisló en el 2019 en la región Huetar Norte (Cuadro 1).

En plantas con síntomas de marchitez, M. phaseolina y F. oxysporum fueron aislados con mayor frecuencia en la variedad Cabécar, mientras que, A. rolfsii se encontró con mayor frecuencia en las variedades Nambí, Brunca y Chánguena (Cuadro 2). En general, se encontró F. oxysporum, F. solani y A. rolfsii como hongos asociados a plantas con problemas de marchitez, en casi todas las variedades comerciales y líneas experimentales muestreadas.

Figura 1 Frecuencia relativa (%) de morfotipos de hongos aislados de plantas de frijol común (Phaseolus vulgaris) en las regiones Huetar Norte y Brunca, Costa Rica durante el año 2017-2020. 

^x Región productora; ^y Año; ^z∈ : plantas con síntomas, ∉ :plantas asintomáticas

Cuadro 1 Frecuencia relativa (%) de morfotipos por región productora, año de recolecta y estado de la planta (con síntoma/sin síntoma) de frijol común (Phaseolus vulgaris). Costa Rica. Año 2017-2020. 

^z∈ : plantas con síntomas, ∉ :plantas asintomáticas, Nd: no dato, no se conoce la variedad.

Cuadro 2 Frecuencia relativa (%) de morfotipos por variedad de frijol común (Phaseolus vulgaris), recuperados a partir de plantas con y sin síntomas de marchitez. Regiones Huetar Norte y Brunca, Costa Rica. Año 2017-2020. 

La secuenciación de la región ITS mostró que los morfotipos de Fusarium se ubicaron en las unidades taxonómicas operativas F. fujikuroi, F. solani y F. oxysporum. El hongo clasificado preliminarmente como M. phaseolina, obtuvo un porcentaje de similitud del 100%. Los aislamientos tentativamente definidos como Penicillium spp. se clasificaron como P. crustosum, P. simplicissimum, Penicillium sp. y Talaromyces pinophilus (Cuadro 3). No se realizó secuenciación del ADN proveniente de A. rolfsii, porque las características morfológicas se consideraron suficientes para su identificación, y coincidieron con las descritas por ^{Kamil et al. (2020}), micelio blanco algodonoso con presencia de fíbulas, tanto en planta como en medio de cultivo PDA y, el desarrollo de esclerocios esféricos de aproximadamente de 1 mm, de coloración blanca al inicio y café claro cuando maduran.

Las especies con mayor frecuencia de aislamiento, M. phaseolina, F. oxysporum y A. rolfsii (Figura 1) están asociadas a pudriciones radicales y marchitez vascular en frijol común alrededor del mundo (^{Xue et al., 2015}; ^{Yesil y Bastas, 2016}; ^{Al-Jaradi et al., 2018}; ^{Sendi et al., 2019}). En Costa Rica fueron reportadas con anterioridad (^{Echandi, 1967}; ^{Araya y Hernández, 2003}; ^{Villalobos et al., 2009}); sin embargo, en ninguno de los trabajos previos se realizó una identificación morfológica o algún análisis molecular para confirmar la identidad del agente patógeno asociado al daño descrito.

Los síntomas observados en campo para la pudrición carbonosa provocada por M. phaseolina, coincidieron con los reportados por ^{Sun et al. (2019}) para esta patología e incluyeron clorosis, marchitez y muerte de plantas adultas con hojas completamente deshidratadas unidas al tallo (Figura 2 A y D), así como decoloración y pudrición en la base del tallo. De acuerdo con ^{Araya y Hernández (2003}), esta especie se presenta con frecuencia en la región Huetar Norte, no así en la región Brunca, comportamiento que se repitió en este estudio (Cuadro 1).

Durante el ciclo productivo del 2019 en la región Huetar Norte se presentaron condiciones de sequía y altas temperaturas, propias de un año bajo influencia del fenómeno del Niño (^{Fernández y Ramírez, 1991}; ^{Alvarado, 2019}), que favorecieron o predispusieron la infección por M. phaseolina (^{Dhingra y Chagas, 1981}), debido a las alteraciones fisiológicas que sufre el hospedante, como reducción de la tasa de transpiración y la conductancia estomática (^{Mayek-Pérez et al., 2002}). Estas condiciones explicarían porque solo en ese año fue posible recuperar dicho patógeno de plantas marchitas en esa región; mientras que, en los demás años de muestreo no fue aislado. Al respecto, en 2018 se tuvieron condiciones lluviosas propias de un año bajo el fenómeno de la Niña (^{Fernández y Ramírez, 1991}; ^{Alvarado, 2018}), y 2017 y 2020 fueron años neutros, según el Instituto Meteorológico Nacional de Costa Rica (^{Alvarado, 2017}; ^{Alvarado, 2020}).

Figura 2 Plantas de frijol común (Phaseolus vulgaris) con síntomas de marchitez de las que se aislaron A) y D) Macrophomi na phaseolina; B) y E) Fusarium oxysporum; C) y F) Athelia rolfsii. Regiones Brunca y Huetar Norte, Costa Rica. 2018-2020.  

Por otro lado, F. oxysporum se aisló a partir de plántulas y plantas adultas, de lesiones longitudinales y hundidas, de coloración rojiza (Figura 2 B y E). Los síntomas en campo se distribuyeron en parches, aunque en ocasiones se encontraron de forma aleatoria. Los daños observados concordaron con los indicados para marchitez por Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (Fop) en varias investigaciones: plantas con retardo de crecimiento, amarillamiento gradual, defoliación y decoloración de tejidos vasculares de raíces y tallos (^{Kendrick y Snyder, 1942}; ^{Schwartz, 1989}; ^{Saremi et al., 2011}; ^{Edel-Hermann y Lecomte, 2019}). La marchitez por Fop se considera una de las principales enfermedades del frijol común a nivel mundial (^{Xue et al., 2015}).

Tanto Macrophomina como Fusarium pueden ser transmitidos por semilla. El último, puede localizarse en la superficie y en el interior, especialmente en los cotiledones (^{Kendrick, 1934}; ^{Singh y Schwartz, 2010}; ^{Marcenaro y Valkonen, 2016}). En esta investigación se aislaron estos patógenos de plantas asintomáticas, lo que podría indicar que se encuentran latentes en la semilla, al igual que lo encontrado por ^{Parsa et al. (2016}), quienes encontraron estos dos hongos de forma endófita en semillas sanas y desinfectadas.

La enfermedad que provoca Athelia rolfsii en frijol es conocida mundialmente como añublo sureño, los síntomas incluyen marchitez y lesiones en la base de la planta, que gradualmente la desecan. Además, frecuentemente, se presenta el desarrollo de micelio grueso, blanco y algodonoso en la lesión, con presencia de esclerocios esféricos de coloración café (^{Abawi y Pastor-Corrales, 1990}; ^{Mahadevakumar et al., 2015}), síntomas y signos observados en esta investigación (Figura 2 C y F). Athelia rolfsii se obtuvo solo de plantas adultas con colapso completo y al igual que Fusarium, presentó distribución agregada.

A partir de los síntomas observados en campo se aislaron los hongos comúnmente descritos en frijol para esas patologías. Sin embargo, es necesario realizar pruebas de patogenicidad para corroborar que son los causantes de las infecciones. Adicionalmente, se debe realizar una identificación molecular más precisa, de los géneros Fusarium, Trichoderma y Talaromyces, con marcadores como EF-1α, rpb2 y el gen de la β-tubulina, especialmente, para resolver con mayor exactitud cuáles especies o formas especiales están presentes. Sobre todo, si se toma en cuenta lo hallado por ^{Marcenaro y Valkonen (2016}), ^{Edel-Hermann y Lecomte (2019}) y ^{Guido-Monge (2020}), que reportan la presencia de otras especies de Fusarium relacionadas con el frijol común. Así como, lo documentado por ^{Otadoh (2011}), ^{Carvalho et al. (2014}) y ^{Abdel-Rahim y Abo-Elyousr (2018}), que indican que Trichoderma y Talaromyces podrían ser agentes de biocontrol.

Las variedades comerciales y líneas experimentales avanzadas muestreadas fueron susceptibles a estos patógenos. Por el potencial de causar pérdidas en rendimiento que éstos tienen (^{Singh y Schwartz, 2010}), el programa de mejoramiento genético de frijol en Costa Rica debe poner mayor atención a estas patologías.

Esta investigación corroboró mediante el aislamiento e identificación molecular basada en ITS, la identidad de los hongos asociados a la marchitez del frijol en las principales zonas productoras de Costa Rica, lo que permite desarrollar mejores estrategias de combate de estos patógenos. Se sugiere realizar trabajos de pruebas de patogenicidad e identificación molecular con marcadores como EF-1α, rpb2 y el gen de la β-tubulina.