Introdução

Com origem no extremo Oriente, a soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma das oleaginosas mais cultivadas no mundo (^{Embrapa, 2011}), sendo considerada base da alimentação de diversos povos, com expansão no Brasil a partir da década de 60 (^{Zancopé et al., 2005}).

No cenário mundial o Brasil nos últimos anos apresentou a segunda maior produção de grãos (^{USDA, 2015}), sendo que a produtividade em 2010 atingiu 7% do produto interno bruto (PIB) brasileiro, e 30% do PIB agrícola (^{Embrapa, 2011}).

Pode-se af irmar, que o crescimento da produção e o aumento da capacidade da soja está diretamente ligada com os avanços científ icos e à disponibilização de tecnologias ao setor produtivo (^{Embrapa, 2011}). Exemplo disso é apresentado por ^{Hungria et al. (2001)} como melhoramento genético associado à seleção de estirpes de bactérias f ixadoras de nitrogênio (BFN). O nitrogênio (N) é responsável pelo acréscimo da produtividade e do teor de proteína das sementes da soja (^{Fagan et al., 2007}), além do papel fundamental no metabolismo vegetal, que demanda alta quantidade de N, nos processos de biossíntese de aminoácidos, clorof ila, ácidos nucléicos e bases nitrogenadas (^{Crawford et al., 2000}).

Normalmente, para se alcançar elevada produtividade na cultura da soja utilizam-se fertilizantes minerais, aumentando os custos de produção e ocasionando maior impacto ambiental (^{Hungria et al., 2005}), sendo necessário entre 300 à 400 kg ha^-1 de N, produzido por meio do petróleo em processo com alto gasto de energia (^{Malavolta e Moraes, 2006}). Após a descoberta do processo de fixação biológica de nitrogêno (FBN) com estirpes responsivas associadasà seleção de cultivares susceptíveis as interações, a soja no Brasil dispensa adubação mineral (^{Döbereiner, 1997}).

Atualmente, as bactérias diazotróf icas que intensif icam à produção de soja pertence ao gênero Bradyrhizobium (^{Silva et al., 2011}). Estos microrganismos infectam a planta formando, naturalmente, nódulos em suas raízes. Dentro estes raízes, essas bactérias possuem a capacidade de quebrar a tripla ligação do dióxido de nitrogênio atmosférico (N₂), que não é utilizado pelas plantas, transformando-o em forma disponível (^{Taiz e Zieger, 2013}; ^{Malavolta e Moraes, 2006}). Esse processo pode suprir toda a necessidade de N da planta, dispensando a adubação mineral (^{Taiz e Zieger, 2013}). No entanto, o gasto energético desprovido pelas bactérias neste processo é elevado, podendo levar a bactéria a não realizar este processo quando estiver presente o N mineral no solo, devido a redução da af inidade da leghemoglobina pelo oxigênio (^{Denison e Harter, 1995}). Desta forma, buscam-se novas formas de melhorar a ef iciência da utilização do N pela cultura da soja.

As novas pesquisas em FBN são realizadas com diferentes bactérias em diversas culturas como: milho (^{Novakowiski et al., 2011}); trigo (^{Bécquer Granados et al., 2012}); cana-de-açúcar (^{Schultz et al., 2012}) ou até mesmo forrageiras para formação de pastagem (^{Moreira et al., 2014}). Porém, poucos são os trabalhos que tentam associar dois gêneros diferentes de FBN em cultivos da soja. Neste contexto, bactérias diazotróf icas do gênero Azospirillum merecem atenção, pois além da FBN, podem produzir compostos promotores de crescimento ou estimular a produção endógena da planta desses compostos (^{Rodrigues et al., 2012}), sendo denominados associativas facultativas, pois proliferam-se na superfície das raízes, podendo penetrar no vegetal (^{Döbereiner e Baldani, 1982}). Alguns destes compostos já foram detectados, produzidos na interação planta-microrganismo, tais como: a auxina ácido 3-indolacético (AIA) (^{Crozier et al., 1988}), citocininas (^{Cacciari et al., 1989}), ácido giberélico (^{Bottini et al., 1989}), além de outros compostos indólicos (^{Crozier et al., 1988}).

O aumento da quantidade de compostos promotores de crescimento pode auxiliar o desenvolvimento e produtividade das plantas (^{Vassilev et al., 2006}; ^{Figueiredo et al., 2010}; ^{Araujo et al., 2012}), pois, observou-se sistemas radiculares mais desenvolvidos em plantas de soja que receberam inoculação nas sementes com Bradyrhizobium japonicume e Azospirillum brasilense (^{Bárbaro et al., 2009}). Da mesma forma, maiores valores médios de massa seca de parte aérea foram verif icados em plantas de feijão que receberam inoculação de Azospirillum brasilense nas sementes (^{Gitti et al., 2012}), enquanto que, a produtividade dê plantas de milho (^{Lana et al., 2012}), feijão (^{Gitti et al., 2012}), e soja (^{Bárbaro et al., 2009}) foram incrementadas pela inoculação de sementes com Azospirillum brasilense.

Neste contexto, plantas de soja com maior nodulação apresentam valores mais elevados de compostos promotores de crescimento vegetal, pois auxinas e citocininas elevam o desempenho dos nódulos (^{Anollés, 1997}; ^{Fei e Vessey, 2004}). Contudo, informação de respostas de cada genótipo são escassos na literatura, necessitando estudos para cada espécie (^{Cassán et al., 2009}), principalmente nas particularidades relacionadas à promoção de crescimento pelo Azospirillum brasilense aliado a Bradyrhizobium japonicum. Ao considerar que alterações nos componentes biométricos e de produção podem ser indicativos do efeito da associação entre bactérias diazotróf icas, ensaios em vaso podem acelerar a seleção de estirpes e cultivares responsivas a interação entre planta e microrganismo.

Desta forma, este trabalho teve por objetivo avaliar o desenvolvimento de dois genótipos de soja em casa de vegetação submetidos à inoculação de bactérias diazotróf icas dos gêneros Bradyrhizobium e Azospirillum.

Material e métodos

O experimento foi conduzido entre outubro de 2011 à fevereiro de 2012, em casa de vegetação, na Estação de Horticultura e Cultivo Protegido “Prof. Dr. Mário César Lopes” pertencente ao Núcleo de Estações Experimentais da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, Campus de Marechal Cândido Rondon /PR. A estação experimental está localizada nas coordenadas geográf icas 54º 22’ W, 24º 46’ S, com altitude média de 420 metros. O clima da região, de acordo com a classif icação de Köppen é do tipo Cfa mesotérmico úmido subtropical de inverno seco, com chuvas bem distribuídas durante o ano e verões quentes. O trabalho foi avaliado apenas no estádio R8 escala de Ferh, sendo avaliado em três etapas, em planta no vaso, os componentes de produção e avaliações em laboratório.

Empregou-se delineamento experimental em blocos casualizados, aplicada a esquema fatorial 2 × 4, com quatro repetições. O primeiro fator foi composto por dois genótipos de soja [BMX Turbo e Coodetec 250 (CD250)]. A cultivar BMX Turbo apresenta porte médio, com hábito de crescimento indeterminado, e ciclo de 115 diase a cultivar CD 250, possui porte médio, com crescimento indeterminado e ciclo de 110 dias. Já o segundo fator foi formado por nitrogênio (N) e bactérias do gênero Bradyrhizobium japonicum e Azospirillum brasilense isolados ou em associação [T1‑testemunha sem inoculação e com N; T2 - inoculação com Bradyrhizobium japonicum (Semias 5079 e 5080) sem N; T3 - inoculação com Azospirillum brasilense (Ab-V5 + Ab-V6) sem N; T4 -Bradyrhizobium japonicum (Semias 5079 e 5080) + Azospirillum brasilense (Ab-V5 + Ab-V6) sem N].

A dose de nitrogênio fornecido no T1 foi de 240 kg ha^-1 conforme recomendação de ^{Hungria et al. (2001)} para produção de 3000 kg ha^-1, adicionando-se 40% da dose no momento da semeadura e o restante no estádio V₂ da cultura da soja.

A parcela experimental foi constituída de duas plantas cultivadas em um vaso de polietileno, cilíndricos, com 20 cm de altura e 10 cm de raio, com volume de 6 L^-1, sendo utilizado como substrato 6 kg terra argilosa, proveniente de horizonte A de Latossolo Vermelho Eutroférrico de textura muito argilosa (^{Embrapa, 2013}), com as seguintes características químicas: pH (H₂O): 5.00; P disponível (Mehlich^-1): 11.78 mg dm^-3; K (Mehlich^-1):0.26 cmolc dm^-3; Ca⁺² (KCl 1 mol L^-1): 3.82 cmolc dm^-3; Mg⁺² (KCl 1 mol L^-1): 0.86 cmolc dm^-3 e Al⁺³ (KCl 1 mol L^-1): 0.10 cmolc dm^-3; H+Al (acetato de cálcio 0.5 mol L^-1): 4.92 cmolc dm^-3; saturação de bases: 4.94 cmolc dm^-3; V: 50.10%, matéria orgânica: 16.40 g dm^-3. O solo foi previamente peneirado para retirada de torrões e maiores impurezas.

O número total de parcelas foi 32 unidades experimentais, sendo que a correção do solo foi realizada 60 dias antes da semeadura, elevando-se a saturação de bases para 70%, segundo recomendação para a soja para o respectivo tipo de solo (^{Embrapa, 2011}). A adubação de base foi realizada segundo a recomendação de ^{Embrapa (2011)}.

As sementes de soja foram inoculadas duas horas antes da semeadura, ocorrida no dia 26 de outubro de 2011. A dose utilizada foi 60 mL do inoculante Simbiose Nod para cada 100 kg de sementes, sendo a mesma dosagem adotada para a inoculação de Azospirillum brasilense, utilizando o produto Graminante. A homogeneização dos tratamentos foi realizada em sacos de polietileno.

Realizou-se a semeadura acondicionando-se 10 sementes em cada vaso. Em seguida os vasos foram cobertos com feno, sendo irrigados diariamente. Após a emergência e estabelecimento da cultura foi realizado o desbaste, restando duas plantas por vaso para completar o ciclo de desenvolvimento. Foram mensuradas as seguintes variáveis: (I) biométricas, especif icamente diâmetro de coleto (mm), altura de plantas (cm), massa da matéria seca de parte aérea e de vagens (g^-1), conforme (^{Fioreze et al., 2011}); (II) componentes da produção, sendo número de vagens,número de grãos por vagem e produtividade por planta (g planta^-1), ambas avaliações realizadas no período de maturação plena da cultura correspondente ao estádio R₈ (^{Fehr e Caviness, 1977}) e (III) amostras da parte aérea e dos grãos foram utilizadas para determinar os níveis de N, as quais foram submetidas à moagem em moinho do tipo Willey (tamanho e determinado pelo método da digestão sulfúrica e destilação em sistema semi-micro Kjeldahl (^{Embrapa, 2009}).

A análise estatística dos resultados obtidos foi executada com auxílio do programa Sisvar (^{Ferreira, 2011}), de modo que os dados foram submetidos à análise de variância e, no caso de efeito signif icativo, utilizou-se o teste Tukey a 5% de probabilidade para diferenciação das médias.

Resultados e discussões

Na Tabela 1 se apresenta o diâmetro de coleto, altura de planta, massa seca de parte aérea (MSPA) e massa seca de vagens (MS Vagens) de diferentes cultivares de soja, submetidos a inoculação com bactérias diazotróf icas, em casa de vegetação. Constatou-se que houve efeito signif icativo da interação entre tratamento e cultivares para todas as variáveis avaliadas (P < 0.05), com exceção de número de grãos por vagens (Tabelas 1, 2 e 3).

Para diâmetro de coletos diferentes tratamentos não apresentaram diferença entre si, apenas foi observado diferença entre as cultivares dentro do tratamento testemunha. O diâmetro de coleto é uma variável importante, pois na região onde o trabalho foi realizado se tem grande incidência de ventos, podendo ocorrer tombamento das plantas, acarretando em perdas tanto durante o desenvolvimento da cultura, reduzindo a perda de f lores e redução do enchimento de grãos devido ao maior auto sombreamento da população, quanto dif icultando o processo de colheita devido ao contato do molinete com as plantas acamadas, levando a debulha precoce na plataforma, e perdas durante a alimentação da colhedora.

Quanto à altura de plantas houve efeito dos tratamentos, apenas para a cultivar Turbo, onde a testemunha apresentou menores média e os maiores valores médios nas plantas inoculadas com A. brasilense. Este resultado mostra que a atuação hormonal desse organismo é positiva (^{Crozier et al., 1988}; ^{Reis Junior et al., 2008}). Contudo, os resultados não diferiram dos tratamentos com B. japonicum e associação entre as bactérias diazotróf icas, o que pode ser considerado positivo, pois o resultado obtido se assemelha as tecnologias atualmente utilizadas no Brasil e no mundo. ^{Bashan e Holguin (1997)} relataram que f itormônios, principalmente o ácido indol-acético (AIA), excretados por Azospirillum desempenham papel essencial na promoção do crescimento de plantas em geral, principalmente ao apresentar-se superior à testemunha, a qual possui fornecimento de nitrogênio.

Na Tabela 1 também é possível observar os resultados encontrados para massa seca de parte aérea, sendo constatado resultado diferenciado entre as cultivares estudadas. Segundo ^{Reis et al. (2000)}, a ausência de resposta à inoculação das sementes com bactérias diazotróf icas tem sido atribuída ao uso de linhagens inadequadas. Assim, a inoculação da cultivar Turbo com a associação de B. japonicum + A. brasilense obeteve médias superiores. ^{Reis Junior et al. (2008)} atribuíram a maior massa seca de plantas as substâncias promotoras de crescimento produzidas pelas bactérias. Porém, efeito oposto foi observado na cultivar CD250, onde os tratamentos com presença de A. brasilense exibiu médias inferiores. O resultado apresentado pela cultivar CD250 é semelhante ao encontrado por ^{Zilli et al. (2010a)}, onde a aplicação de 200 kg ha^-1 de N produziram maior massa seca de parte aérea ao inocular com B. japonicum.

Para a massa seca de vagens, a cultivar Turbo apresentou média inferior no tratamento com A. brasilense. Entretanto, tal resultado não era esperado, uma vez que esta cultivar apresenta grãos normalmente de maior tamanho e peso (peso de mil sementes de 232 g^-1, contra 149 g^-1 da CD 250) (^{Brasmax, 2012}; ^{Coodetec, 2011}).

Na Tabela 2, tem-se os resultados da variável número de vagens, onde o tratamento B. japonicum obteve valores superiores quando inoculado na cultivar CD 250, esse fato pode estar ligado ao aporte de N e fornecimento pela simbiose, onde o mesmo é exigido em grande quantidade na manutenção e formação das vagens pela cultura da soja, visto que, normalmente nessa fase se tem redistribuição do N na planta (^{Ryle et al., 1979}). Desta forma, plantas que apresentam condições f isiológicas e nutricionais adequadas, mantém suas vagens; o que não ocorre em plantas que não acumulam nutrientes suf icientes, abortando vagens das partes mais def iciências de nitrogênio. Esse fato pode ser observado no acúmulo de N de parte aérea, sendo menor para o tratamento com maior número de vagens, diretamente relacionado à redistribuição do nitrogênio. ^{Imsande e Schmidt (1998)} também ressaltam que a partir do estágio de desenvolvimento de vagens ocorre decréscimo da concentração de N na fração vegetativa da planta, pois o N é remobilizado para as vagens e sementes. Para a cultivar Turbo, apenas a testemunha apresentou maior número de vagens e os demais tratamentos obtiveram médias inferiores.

O número de grãos por vagens não apresentou diferença signif icativa entre os tratamentos e cultivares. Tal resultado era esperado, uma vez que esta característica da soja é constante e semelhante para a maioria dos cultivares, devido ao grande melhoramento genético. Assim, como é uma característica def inida durante o desenvolvimento da planta, diferentes tratamentos não proporcionam efeito.

No acúmulo de N na parte aérea das plantas, não foi identif icado efeito signif icativo entre as cultivares como relatado na Tabela 2, sendo apenas contatado para o tratamento testemunha na cultivar Turbo, onde esse apresentou menor acúmulo de N na parte aérea, provavelmente relacionado com maior número de vagens obtido nesse tratamento, exigindo maior teor de nitrogênio. O mesmo efeito pode ser observado no acumulo de N no grão onde a testemunha teve maior média para ambas as cultivares, porém sem diferenciar dos tratamentos com inoculação, mostrando que a f ixação biológica é ef iciente no suporte de N para as plantas. Este resultado corrobora com os encontrados por ^{Zilli et al. (2010a}, ^b). O efeito do Azospirillum é positivo, onde mesmo sem nodulação, supri a demanda de N da planta. Possivelmente este resultado esteja relacionado com o substrato utilizado, o qual não foi esterilizado, tendo a presença natural de B. japonicum, contribuindo com a FBN, sendo ponto expressivo pois a combinação em doses corretas pode maximizar a ef iciência da f ixação biológica.

A produção por planta se apresentam na Tabela 3. Os resultados não foram positivos por parte das bactérias do gênero Azospirillum no cultivar Turbo, porém na cultivar CD250 proporcionou médias superiores. Aguardava-se esta diferença entre cultivares, baseada na descrição de ^{Reis et al. (2000)}, devendo-se buscar cultivares que sejam responsivas a associação com diazotróf icos. A ausência de resposta da cultivar Turbo pode estar relacionada com o que é mencionado na literatura que mostra uma inconsistência dos resultados quando se utiliza a A. brasilense em soja, visto que essa se estabelece na superfície da raiz, e ocasionalmente penetra nas raízes. Assim a literatura reporta que o uso de bactérias que se estabelecem nas raízes gera resultados que podem ser muito variados, devido poder sofrer a ação de fatores externo do solo como outras bactérias que ali competem por recursos podem limitar as respostas da planta. Uma vez que bactérias do gênero Azospirillum podem sobreviver tanto em condições endofíticas como associativa próximas as raízes (^{Baldani et al., 1997}), assim ^{Sturz e Nowak (2000)} sugerem que, se as bactérias fossem somente endofíticas, a inconstância dos resultados seria menor, uma vez que não estariam expostas condições do solo e ambiente, ou também não estariam sujeitas á competição por nutrientes na rizosfera (^{Mariano, 2001}).

Conclusões