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Introducción
Dioscorea L. es un género que incluye alrededor de 630 especies (Govaerts et al., 2018) distribuidas en regiones tropicales y subtropicales, y solo algunos representantes se encuentran en zonas templadas de todo el mundo (Wilkin et al., 2005; Romero-Hernández et al., 2019). La mayor variedad y concentración ocurre en el Neotrópico, con al menos 55% de los taxones conocidos (Govaerts et al., 2007; Couto, 2015).
La gran diversidad morfológica, su naturaleza dioica, el tamaño pequeño de las flores, así como la plasticidad fenotípica en algunas especies de Dioscorea, dificultan su delimitación (Wilkin et al., 2005; Raz, 2016). Esto llevó a que se reportaran complejos taxonómicos sin límites específicos, tornándose en un desafío para su sistemática (Couto et al., 2014; Wilkin y Muasya, 2015; Fraga et al., 2019).
Las especies de Dioscorea se diferencian principalmente por las características del androceo de las flores estaminadas al presentar uno, tres o seis estambres, libres o unidos formando una columna estaminal cilíndrica, piramidal u ovoide que puede o no contener apéndices y estar inserta o no en un disco carnoso (Xifreda y Seo, 2009; Asesor y Bulacio, 2017; Romero-Hernández et al., 2019). Numerosos estudios taxonómicos, incluso la delimitación de especies neotropicales, se han centrado en caracteres morfoanatómicos y polínicos destacando su importancia para comprender las relaciones interespecíficas (Xifreda, 1990, 2000; Couto et al., 2014; Tenorio et al., 2017; Alzer et al., 2019; Da Luz et al., 2020).
Los análisis citogenéticos en Dioscorea de Argentina son escasos (Wulff et al., 2003), solo se registran recuentos cromosómicos para algunas especies del Nuevo y Viejo Mundo. Estos estudios mencionan números básicos x=9 y x=10 (Martin y Ortiz, 1963; Baquar, 1980; Essad, 1984; Bousalem et al., 2006; Viruel et al., 2008) con niveles de ploidía desde 2x hasta 10x para D. althaeoides R. Knuth y D. benthamii Prain & Burkill, respectivamente (Kiangsu Institute of Botany, 1976; Chin et al., 1985). Xifreda (2000) considera que estudios adicionales, como el número cromosómico en especies del Nuevo Mundo, sin duda mejorarían la sistemática infragenérica de Dioscorea.
Entre los caracteres palinológicos que definen al género, la ornamentación de la exina evidencia una variación desde tipos perforados, rugulados, estriados hasta reticulados (Xifreda, 2000; Alzer et al., 2019; Da Luz et al., 2020). Diversos autores difieren al momento de describir mediante microscopía óptica (MO) la ornamentación de la exina en individuos de una misma especie de Dioscorea (Xifreda, 2000; Alzer et al., 2019; Da Luz et al., 2020). Esto demuestra la importancia del uso de la microscopía electrónica (ME) para tales estudios, además de una correcta identificación taxonómica. Por su parte, el tamaño del grano de polen puede variar respondiendo, entre otros factores, al amplio rango geográfico en el que habitan las especies y en donde están sometidas a diferentes condiciones ambientales (Da Luz et al., 2020). Por último, en relación con el número de aberturas, se han reportado granos de polen mono y disulcados (Caddick et al., 1998; Schols et al., 2001, 2003, 2005; Wilkin et al., 2009; Viruel et al., 2010). Sadik y Okereke (1975) sostienen que los estudios polínicos son claves para definir la identidad de las especies y analizar su éxito germinativo.
Dioscorea ayardei Asesor es una especie recientemente descrita, endémica de las Sierras de Calilegua (Jujuy, Argentina), que se caracteriza por la particularidad del androceo de sus flores estaminadas, la cual consiste en una estructura navicular con una sola antera inserta en el centro y tres apéndices dendriformes erectos (Asesor y Bulacio, 2021). El objetivo de este trabajo fue realizar un estudio conjunto de caracteres cromosómicos y palinológicos, que sumados a los morfológicos aporten información complementaria para su correcta delimitación.
Materiales y Métodos
Recolecta de Dioscorea ayardei
El material estudiado proviene de las Sierras de Calilegua, departamento Valle Grande, ubicado al sureste de la provincia Jujuy (Argentina) (Fig. 1). El mismo fue recolectado entre 1500 y 2800 m s.n.m., en el piso altitudinal del bosque montano superior de las yungas y en los pastizales de neblina y arbustales mesofíticos (Oyarzabal et al., 2018; Arana et al., 2021). Para identificar la especie se utilizaron técnicas tradicionales en taxonomía y se consultó bibliografía específica: Grisebach (1842, 1875), Hauman (1916), Knuth (1917, 1924), Castillón (1927), Xifreda (1982a, b, 1983, 1984, 1996), Huber (1998), Govaerts et al. (2007), Xifreda y Seo (2009), Couto (2010, 2015), Jørgensen et al. (2014), Asesor y Bulacio (2021). El material colectado se herborizó y otra parte fue fijada en líquido conservante FAA (1:2:7:10, ácido acético glacial, formaldehído, agua y alcohol) (D’Ambrogio de Argüeso, 1986), para su posterior análisis en el laboratorio. Finalmente, ejemplares de referencia se depositaron en el Herbario Fanerogámico de la Fundación Miguel Lillo (LIL) (Thiers, 2022).
Material estudiado
ARGENTINA. Provincia Jujuy, Valle Grande, Sierras de Calilegua, Puesto Duraznillo, 23°37'35.39''S, 64°53'46.67''O, 2600 m, arbustal mesofítico, 24.II.2015, P. Asesor et al. 115 (LIL); camino a Alto de Calilegua, pasando Quebrada Honda, 23°33'57.30''S, 64°53'46.67''O, 2610 m, quebrada húmeda en pastizal con Alnus acuminata y Polylepis australis, 25.II.2009, E. Bulacio y H. Ayarde 1055 (LIL); Quebrada por Paso Despensa, 23°38'13.89''S, 64°56'24.23''O, 1500 m, arbustal de ecotono, 29.III.2009, E. Bulacio y H. Ayarde 1288 (LIL); Quebrada de Cortaderas, 23°37'07.27''S, 64°54'30.91''O, 2600 m, quebrada húmeda con arbustales bajos, 26.II.2016, E. Bulacio y H. Ayarde 3029 (LIL); Puesto Aguas Blancas, 23°36'01.33''S, 64°54'25.62''O, 2690 m, pastizal, 12.I.2017, E. Bulacio y H. Ayarde 3170 (LIL).
Recuento cromosómico y comportamiento meiótico
Meiosis: Se recolectaron al azar botones florales jóvenes. El material se fijó en Farmer (3:1 alcohol etílico 96° y ácido acético glacial) (Sharma y Sharma, 1965) durante 24 horas y luego se conservó en alcohol etílico 70° a -4 °C. Las anteras se hidrolizaron con ácido clorhídrico (HCl) 1N a 60 °C durante 20 minutos, posteriormente se lavaron en agua destilada. La coloración y el montaje se efectuaron con una gota de hematoxilina propiónica al 2% con cristales de citrato férrico. Se llevaron a cabo recuentos cromosómicos en microscopio (Nikon Eclipse E200, Tokio, Japón) con cámara Moticam (1000, 1.3 MP, Tokio, Japón), sobre diez diacinesis/placas metafásicas y para el análisis de la meiosis se observaron en cada estadio 100 células madre del polen (CMPs) como mínimo.
Fertilidad del polen
La estimación de la viabilidad de los granos de polen y el estado del núcleo se realizaron mediante una selección al azar de diez flores inmediatamente antes de la antesis, que se fijaron en Farmer.
Se empleó la técnica de coloración de Müntzing (Sharma y Sharma, 1965) observándose como mínimo 1000 granos de polen, considerando viables aquellos que resultaron teñidos de color rojo intenso en 2/3 de su contenido.
Para determinar el estado de los núcleos se utilizó el fluorocromo 4’6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de acuerdo con el protocolo de Dewitte et al. (2010). Los núcleos se observaron en 100 granos de polen como mínimo, en microscopio de epifluorescencia (Olympus BX43F, Tokio, Japón; cámara Olympus Q color-5 (5 MP), Tokio, Japón).
Morfología del polen
Se realizaron observaciones en microscopio óptico (MO) (Carl Zeiss Axio LAB A1, Göttingen, Alemania) con cámara Axiocam (ERc5s, Göttingen, Alemania), aplicándose la técnica de Wodehouse (1935), para polen no acetolizado y la de Erdtman (1960) en el acetolizado. A partir de un mínimo de 20 granos de polen, en cada tipo de material, se midieron los siguientes parámetros: diámetro ecuatorial mayor en vista polar (DM), diámetro ecuatorial menor en vista polar (Dme), diámetro polar en vista ecuatorial (DP) y longitud de la apertura (Lap). Para el análisis de microscopía electrónica de barrido (MEB) los granos de polen acetolizados se metalizaron con oro (Dorador, Ion Spotter, JFC 1100 Joel, Japón), de acuerdo con la técnica de Karnovsky (1965). Se utilizó el microscopio electrónico de barrido Zeiss Supra 55VP (Oberkochen, Alemania).
La terminología empleada en la descripción polínica corresponde a Erdtman (1943), Sáenz Laín (2004), Punt et al. (2007), Hesse et al. (2009) y Alzer et al. (2019). Las muestras palinológicas se incorporaron a la Palinoteca del Laboratorio de Palinología de la Fundación Miguel Lillo (PAL-TUC), Tucumán, Argentina.
Resultados
Recuento cromosómico y comportamiento meiótico
Dioscorea ayardei (Fig. 2A) presentó un número gametofítico de n=20II (Fig. 2B). El comportamiento meiótico fue generalmente regular (Fig. 2C); sin embargo, se observaron algunas aberraciones durante las diferentes etapas meióticas. El 4% de las células en metafase I (MI) mostraron 1-4 cromosomas fuera de la placa ecuatorial o un par de univalentes dispuestos al azar en el citoplasma (Fig. 2D), mientras que en metafase II (MII) 2.3% de CMPs presentaron cromosomas fuera de la placa ecuatorial (Fig. 2E).
Figura 2: Dioscorea ayardei Asesor. A. flor masculina; B. diacinesis n=20II; C. células madre de polen (CMPs) en Metafase I (MI) regulares; D. MI con cromosoma fuera de la placa ecuatorial (punta de flecha negra); E. Metafase II (MII) con cromosoma fuera de la placa ecuatorial (punta de flecha negra); F. grano de polen viable e inviable teñidos con Müntzing; G. núcleos en granos de polen teñidos con DAPI, la punta de flecha blanca indica núcleo vegetativo (NV); H. grano de polen acetolizado en vista polar distal; I-J. grano de polen observado en MEB. Escalas: A-G=10μm, H=20μm, I-J=5μm.
Fertilidad del polen
Al estimar la viabilidad de los granos de polen, se observó que 90% de ellos se colorearon con solución de Müntzing, 10% restante corresponde a granos no viables; son translúcidos, presentaron forma alargada y aspecto plasmolizado (Fig. 2H).
La tinción con DAPI reveló dos núcleos bien definidos en 93% de los granos viables en D. ayardei; el núcleo de mayor tamaño corresponde al generativo (NG) y el menor, al núcleo vegetativo (NV), el resto de los granos solamente exhibieron el generativo (Fig. 2G).
Morfología polínica
Dioscorea ayardei presenta mónadas heteropolares, con simetría bilateral, disulcadas, elípticas en vista polar, donde se observan los sulcos. En material acetolizado el tamaño de los granos es pequeño a mediano, con DM de 20.6 (25.7) 29.7 µm y Dme de 14 (16.41) 17.8 µm, mientras que en el no acetolizado se encuentran granos pequeños con DM de 20 (22) 24 µm y Dme de 16.7 (18.3) 21.5 µm. En la exina tectada-columelada de 1-2.4 µm de espesor se puede diferenciar la sexina de 0.4-1.9 µm de la nexina de 0.2-0.8 µm. Con MEB se observa un tectum microreticulado con muros de 0.25-0.5 µm de ancho y lúmenes poligonales irregulares de 0.2-0.7 µm (Fig. 2I, J).
Discusión
Los números cromosómicos básicos de las especies de Dioscorea varían según la región que ocupan en su amplia distribución. Los antecedentes bibliográficos generales reportan números cromosómicos 2n=20-140, con formas diploides, tetraploides, hexaploides, octoploides e híbridos inter e intraespecíficos (Martin y Ortiz, 1963; 1966; Paul y Debnath, 2019). Lewis (1980) propuso como número básico para las especies del Viejo Mundo x=10, mientras que las del Nuevo Mundo son tratadas como poliploides derivados de un ancestro putativo aneuploide con n=9, aunque este número no ha sido registrado hasta el momento.
En la actualidad, se han realizado estudios citogenéticos en 66 especies (16 son sudamericanas), de las 650 que comprende Dioscorea (Goldblatt, 1979; Wulff et al., 2003). La escasa información citológica se debe a la dificultad de llevar a cabo recuentos cromosómicos dado su tamaño pequeño (1-2.5 µm), priorizando estudios en taxones de importancia económica (Martin y Ortiz, 1966). Wulff et al. (2003) y Xifreda y Seo (2009) sugieren x=10 como número básico para las secciones Monadelpha Uline, Centrostemon Griseb. y Cycladenium Uline, aportando los primeros datos para diez especies de Argentina. En este trabajo se reporta por primera vez el número cromosómico gametofítico en D. ayardei, n=20. Nuestros resultados son coincidentes con los obtenidos por Wulff et al. (2003) para D. cienegensis R. Knuth y D. monadelpha (Kunth) Griseb., ambas pertenecientes a la sección Monadelpha y afines a D. ayardei, cuya ubicación dentro de una sección requiere de estudios complementarios, principalmente moleculares.
El comportamiento regular observado en ambas etapas de la meiosis de D. ayardei revelaría el nivel de estabilidad en el taxón. La ausencia o baja frecuencia de anormalidades constituye uno de los factores que se relacionan con su adaptabilidad (Caetano, 2003), tal como lo reflejan los porcentajes de viabilidad potencial polínica. La predominancia de dos núcleos en los granos de polen de D. ayardei da lugar a una alta viabilidad ya que cuentan con las proteínas implicadas en la germinación del tubo polínico, en contraste con los granos mononucleados que carecen de ellas (Zhou y Meier, 2014).
Los análisis palinológicos mostraron que D. ayardei tiene exina microreticulada con sectores en donde los muros pierden continuidad y se produce la fusión de lúmenes dando una apariencia de superficie rugulada. Esta característica coincide con Xifreda (2000), quien mencionó la presencia de polen rugulado-reticulado en especies sudamericanas de las secciones Monadelpha, Centrostemon y Dematostemon Griseb. Mientras que Da Luz et al. (2020) manifestaron que este tipo de ornamentación se encuentra solo en las especies que pertenecen al clado Nuevo Mundo II, propuesto a partir de análisis filogenéticos moleculares (Wilkin et al., 2005; Viruel et al., 2016), el cual agrupa taxones neotropicales de las secciones señaladas por Xifreda (2000).
La abertura disulcada (siguiendo la terminología de Alzer et al., 2019) que presenta D. ayardei coincide con lo reportado por Da Luz et al. (2020), en el análisis polínico de especies neotropicales. Sin embargo, el carácter es poco común en monocotiledóneas puesto que está restringido a familias como Amaryllidaceae y Arecaceae (Schols et al., 2003). En el género Dioscorea la predominancia del polen monosulcado ocurre en secciones basales como Stenophora Uline, mientras que en las derivadas existe una variación en el número de aberturas (Su, 1987; Schols et al., 2001, 2005). Dicho aumento ofrecería una ventaja selectiva, debido al incremento de los sitios de germinación posibles, facilitando así el contacto entre al menos una abertura y la superficie del estigma (Doyle, 2005).
Estudios micromorfológicos, anatómicos y polínicos demostraron ser útiles en revisiones taxonómicas de Dioscorea (Tenorio et al., 2017; Alzer et al., 2019). Por lo tanto, el aporte de tales datos, sumados a los cromosómicos, ayudarán a esclarecer los límites y relaciones entre especies neotropicales, debido a la amplia plasticidad fenotípica de Dioscorea.
Conclusiones
Se aportan datos que reafirman un número básico x=10 para Dioscorea. Los resultados citológicos obtenidos en este trabajo revelan que Dioscorea ayardei es un tetraploide con n=20. Su comportamiento meiótico concuerda directamente con la alta viabilidad potencial de los granos de polen. La ornamentación de la exina y el número cromosómico de D. ayardei la relacionan con especies del clado Nuevo Mundo II.
