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Introducción
El género Haworthia (Duval) pertenece al orden Asparagales y familia Asphodelaceae, endémico de Sudáfrica (Kim et al., 2018). El número cromosómico básico del grupo es 7, en las especies diploides (2n = 2x = 14) se presentan ocho cromosomas grandes y seis pequeños (cariotipo bimodal); sin embargo, el orden Asparagales también reúne especies con grupos cromosómicos que van desde diploides hasta octaploides (Parai et al., 2012). En Haworthia se ha reportado que del 35 al 49 % de sus especies y variedades son poliploides (Riley y Majumdar, 1966); en las subdivisiones Tessellatae y Coarctatae es común que se presenten formas poliploides y aneuploides (Parai et al., 2012); además, han surgido mutantes espontáneos que originaron poblaciones poliploides, como en Haworthia limifolia (Ahirwar et al., 2015).
La poliploidía ha sido un referente de dificultad para la propagación in vitro en distintas especies de Haworthia, esta hipótesis concuerda con los resultados de Ogihara y Tsunewaki (1979), quienes señalaron para H. setata (Haw) que el análisis cromosómico de plantas regeneradas a partir de células de callo mostró número diploide de cromosomas y en células con número poliploide la organogénesis fue muy difícil de inducir. La poliploidía es indicativa de algún cambio en el genoma asociado directamente con la inestabilidad de los cromosomas, relación que coincide con los hallazgos de Mayer y Aguilera (1990), quienes reportaron que con un aumento en el número de ploidía se encontró un aumento en la inestabilidad cromosómica.
Si bien las causas de la inestabilidad cromosómica, bajo condiciones de cultivo de tejidos vegetales son poco conocidas, se cree que una de las más comunes es la “transición de fase” (Gao et al., 2019), inducida por el cultivo in vitro (Neelakandan y Wang, 2012), en el cual se desestabiliza el programa genético y epigenético del tejido vegetal intacto y puede conducir a variaciones cromosómicas, activación de transposones, cambios de secuencias y en la metilación del ADN, que desembocan en la generación de variantes somaclonales (Wang y Wang, 2012).
La fase de callo, tanto en su estado de desdiferenciación como de rediferenciación (Gao et al., 2019), y el uso de reguladores de crecimiento como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) han sido señalados como elementos fundamentales para la inducción de inestabilidad cromosómica manifestada por aberraciones cromosómicas, entre las que encuentran fragmentos, puentes, cromosomas rezagados, aneuploidía, poliploidía, y cambios en la cromatina, en el ciclo celular y en la estructura de los cromosomas (Pavlica et al., 1991); no obstante, se han reportado discrepancias con relación al efecto de tales elementos en otros cultivos. En Pennisetum americanum, Swedlund y Vasil (1985) observaron un ligero cambio a aneuploidía y poliploidía, con una fuerte selección a favor de la regeneración de plantas a partir de células de callo citogenéticamente estables. En Daucus carota, la omisión de 2,4-D indujo una caída significativa en la frecuencia de mitosis multipolares, lo que se atribuyó a una selección competitiva hacia células con número diploide en presencia de mecanismos que producen inestabilidad, manifestada como poliploidía, aneuploidía y estructuras alteradas (Bayliss, 1973; 1977). Estas discrepancias indican que la variación cromosómica en plantas regeneradas también depende del genotipo (Bairu et al., 2011). Hay genotipos que dan lugar a mayor inestabilidad cromosómica que otros en las mismas condiciones de cultivo (Puolimatka y Karp, 1993). Los posibles contrastes a nivel de especies del género Haworthia no han sido suficientemente analizados.
En este contexto, es importante investigar el comportamiento numérico y morfológico de los cromosomas y los factores que los afectan, lo cual es útil para implementar métodos de selección in vitro, dado que tanto la estabilidad como la inestabilidad cromosómica son importantes en el mejoramiento genético del cultivo, ya sea para desarrollar genotipos clonales o para generar genotipos con variantes novedosas. Por lo anterior, el objetivo del presente estudio fue analizar la estabilidad e inestabilidad de los cromosomas en tejidos desdiferenciados y rediferenciados de Haworthia bajo condiciones in vitro, bajo la hipótesis de que existe una dependencia entre factores in vitro y genotipo para la conservación del número y morfología de los cromosomas.
Materiales y métodos
Material vegetal
Se emplearon tres especies de Haworthia: H. marumiana var. batesiana, H. fasciata var. major y H. limifolia var. ubomboensis. Las plantas fueron adquiridas en los invernaderos del mercado Madre Selva de Xochimilco, Ciudad de México.
Desinfestación y establecimiento
Segmentos de hoja etioladas de cada una de las tres especies de Haworthia se sumergieron por 30 s en alcohol etílico 70 %; posteriormente, en hipoclorito de sodio 4 % con dos gotas de Tween 20 durante 15 min. Se empleó el medio basal Eriksson (1965), y para suplementarlo se utilizaron tres tratamientos: a) ácido naftalenacético (ANA) 2.0 mg L-1 + 6-bencilaminopurina (BA) 1.0 mg L-1, b) ANA 5.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1, y c) ácido 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D) 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1. Se adicionaron 30.0 g L-1 de sacarosa. El pH del medio de cultivo se ajustó a 5.7 ± 0.1. Como solidificante se empleó agar (8.0 g L-1). Se realizó la esterilización en autoclave a 121° C y 1.5 kg cm-2 durante 15 min y se dispensaron 20 mL de medio de cultivo por frasco tipo Gerber. Se llevó a cabo la siembra con los explantes de hoja, los cuales fueron incubados a 25 ± 2 °C en oscuridad.
Multiplicación
Los callos obtenidos fueron aislados y subcultivados por 18 meses en medio basal Eriksson. La rediferenciación de raíces fue inducida en callos subcultivados en medio Eriksson con los diferentes tratamientos de auxinas (ANA, 2,4-D) y citocininas (BA o cinetina) utilizados en el establecimiento.
Análisis cromosómico
El análisis cromosómico se realizó en células de callos desdiferenciados y de raíces rediferenciadas; para ello, se tomaron al azar diferentes regiones superficiales del callo y ápices de raíces de las tres especies bajo estudio; se pretrataron en una solución 0.002 M de 8-hidroxiquinoleína a 18 o 20 °C por 2 h; se fijaron en solución Farmer (alcohol etílico y ácido acético en proporción 3:1). La hidrólisis o maceración se realizó con ácido clorhídrico (HCl 1 N) a 60 ± 1 °C durante 6 min. La tinción se hizo con el reactivo de Schiff (Fucsina)..
Para el montaje, se añadió una gota de acetocarmín 2 % y se realizó el aplastado. En cada una de las tres especies, las determinaciones cromosómicas fueron realizadas en 100 células en metafase, se utilizaron de cuatro a ocho individuos por especie, de acuerdo con la presencia de células en metafase. Las observaciones se realizaron en un microscopio binocular biológico (VE-B300, VELAB, Pharr, Texas, EUA) y se elaboraron los cariotipos de acuerdo con la clasificación de Levan et al. (1964). Los cromosomas se ordenaron de mayor a menor tamaño para la elaboración de cariotipos.
Resultados y discusión
Respuesta general de los genotipos a las condiciones proporcionadas in vitro
El cultivo in vitro de las tres especies de Haworthia fue difícil para la inducción de callo desdiferenciado y la rediferenciación de raíz. La diferencia entre genotipos fue evidente con el tratamiento de ANA 5.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 al mostrar que H. limifolia var. ubomboensis no tuvo respuesta a la rediferenciación de raíces (Cuadro 1); esto indica que no todos los genotipos responden a la selección a favor de la regeneración de plantas a partir de células de callo, como fue señalado por Swedlund y Vasil (1985). Contrariamente, con el mismo tratamiento las especies H. marumiana var. batesiana y H. fasciata var. major mostraron una respuesta altamente positiva, tanto en la rediferenciación de raíces como en la estabilidad cromosómica.
Cuadro 1 Número cromosómico y morfología de los cromosomas observados en células de callos desdiferenciados y de raíces rediferenciadas en tres especies de Haworthia cultivadas in vitro con diferentes reguladores de crecimiento.
| Reguladores | Tejido | Especies | ||
| H. marumiana var. batesiana | H. fasciata var. major | H. limifolia var. ubomboensis | ||
| ANA (2.0 mg L-1) + BA (1.0 mg L-1) | CD |
(2n=14) (2n-1=13) (2n+1=15) (4x-4=24) (4x-1=27) (4x=28) A |
(2n=14) (4x-2=26) (4x-1=27) A, M |
(2n=14) (4x-1=27) A, M |
| ANA (5.0 mg L-1) + BA (1.0 mg L-1) | RR |
(2n=14) A |
(2n=14) A |
SR |
| 2,4-D (5.0 mg L-1) + cinetina (1.0 mg L-1) | CD | CNS |
(2n=14) (4x-4=24) A, M |
(2n=14) (4x-2=26) (4x-1=27) A, M |
| RR |
(2n=14) (2n-1=13) (4x=28) A, M |
(2n=14) (4x-2=26) A, M |
(2n=14) (4x-1=27) A, M |
|
CD: callos desdiferenciados, RR: raíces rediferenciadas, SR: sin respuesta, CNS: callo no sobrevivió, A: morfología acrocéntrica, M: morfología metacéntrica.
El tratamiento 5.0 mg L-1 de 2,4-D + 1.0 mg L-1 de cinetina también evidenció la diferencia entre genotipos, ya que fue letal para los callos de H. marumiana var. batesiana, no así para callos de H. fasciata var. major y H. limifolia var. ubomboensis; asimismo, con este tratamiento se observaron diferencias dentro de una misma especie a nivel de tejidos, ya que en H. marumiana var. batesiana, si bien al momento de realizar los estudios cromosómicos los callos desdiferenciados se encontraron muertos, las raíces ya rediferenciadas presentaron sobrevivencia favorable, lo cual es un indicio de la fuerte selección que se da a favor de la regeneración de plantas a partir de células citogenéticamente normales, como lo concluyeron Swedlund y Vasil (1985).
Asimismo, se encontró para todas las especies que en las células de callos desdiferenciados hubo mayor variación del número cromosómico en comparación con las células de raíces rediferenciadas, lo cual podría estar relacionado con el tiempo de 18 meses en el cual se había mantenido el estado de callo. Betekhtin et al. (2017) mencionaron que frecuentemente los cultivos de callo a largo plazo presentan una acumulación de cambios genéticos, incluida la poliploidización.
Estabilidad cromosómica
La mayor parte de los estudios citológicos realizados en células de callos desdiferenciados y ápices de raíces rediferenciadas de las tres especies de Haworthia mostraron el número cromosómico diploide 2n=2x=14, con la morfología y características del grupo y sus 20 μm parientes Aloe y Gasteria (Sánchez y Raymúndez, 2017), ocho cromosomas grandes (L1, L2, L3, L4) y seis pequeños (S1, S2, S3), todos acrocéntricos, lo cual coincide con Riley y Majumdar (1966) (Cuadro 1, Figura 1A).
Figura 1 Cariotipo bimodal de callos desdiferenciados y ápices de raíces rediferenciadas de tres especies de Haworthia: A) ideograma que muestra cariotipo diploide normal, B) las flechas señalan satélites en los cromosomas L 1 y L 4
La estabilidad, tanto del número cromosómico como de la morfología de los cromosomas y su relación con el tipo de tejido (callos desdiferenciados o raíces rediferenciadas) y los reguladores de crecimiento empleados para suplementar el medio de cultivo, tuvo los siguientes valores por especie:
H. marumiana var. batesiana
En las células de callos desdiferenciados cultivados con ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 se encontró a los cromosomas con el número diploide en 90 de las 100 células observadas, y al analizar el cariotipo se observó que éstos también conservaron su morfología acrocéntrica. En las células de raíces rediferenciadas cultivadas con ANA 5.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 los cromosomas permanecieron sin cambios, tanto en número como en morfología, en las 100 células analizadas. En 92 de las células de raíces rediferenciadas cultivadas en 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1 se mantuvo la condición diploide de los cromosomas y éstos con morfología acrocéntrica.
H. fasciata var. major
En las células de callos desdiferenciados cultivados con ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 los cromosomas presentaron la tendencia a permanecer con el número diploide en 96 de las 100 células analizadas y sin cambios en su morfología acrocéntrica. En cuanto a las células de raíces rediferenciadas cultivadas con ANA 5.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 el número diploide y la morfología acrocéntrica de los cromosomas persistieron en las 100 células observadas. El examen en células tanto del callo desdiferenciado como de raíces rediferenciadas en el tratamiento con 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1 mostró la conservación del número diploide y la morfología acrocéntrica de los cromosomas únicamente en 10 células del total analizado.
H. limifolia var. ubomboensis
En 97 de las células observadas provenientes de callo desdiferenciado cultivado con ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 los cromosomas conservaron el número diploide y morfología acrocéntrica. El análisis de 100 células de callo desdiferenciado cultivado con 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1 mostró a 92 células en las que se conservó el nivel diploide y morfología acrocéntrica de los cromosomas. El estudio citogenético de los ápices de las células de raíces rediferenciadas, cultivadas con 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1 mostró a 79 células con cromosomas diploides y sin cambios en su morfología.
En las tres especies de Haworthia la tendencia que tuvo la estabilidad, tanto en el número cromosómico como en la morfología de los cromosomas, fue dependiente de la especie, del tipo de tejido (callo desdiferenciado o raíces rediferenciadas), y de los reguladores de crecimiento, factores que han sido señalados como puntos clave para la estabilidad cromosómica (Bairu et al., 2011; Pavlica et al., 1991); sin embargo, se observó que el genotipo tiene una gran influencia en la respuesta al ambiente proporcionado bajo condiciones in vitro, pues no todas las especies mostraron el mismo comportamiento ante condiciones iguales de cantidad y clase de regulador, así como de tipo de tejido, pero tales diferencias no sólo quedaron a nivel de especies, sino que también se manifestaron dentro de la misma especie. Lo cual concuerda con las discrepancias señaladas por Bayliss (1973; 1977) o Swedlund y Vasil (1985) en otros cultivos. Los resultados de esta investigación dejan en evidencia la opción y oportunidad de realizar selección in vitro de genotipos que muestren estabilidad cromosómica, de acuerdo con los objetivos perseguidos; por ejemplo, para fines de mejoramiento genético sería una actividad primordial al garantizar el emparejamiento cromosómico durante las recombinaciones meióticas entre distintas especies (Vélez-Torres y Fernández-Pavía, 2023).
Es importante mencionar que en esta investigación el número cromosómico básico de las tres especies analizadas fue 2n=2x=14; sin embargo, en algunas poblaciones naturales de H. limifolia el número cromosómico ha cambiado; por ejemplo, Ahirwar et al. (2015) encontraron mutantes espontáneos en clones de esta especie, los cuales poseían 2n=28 cromosomas somáticos; por su parte, Parai et al. (2012) reportaron 2n=28 cromosomas somáticos para H. limifolia var. keithii.
Inestabilidad cromosómica
La inestabilidad, tanto del número cromosómico, como de la morfología de los cromosomas de acuerdo con los cariotipos elaborados para cada una de las especies y su relación con el tipo de tejido, callo desdiferenciado o raíces rediferenciadas, y los reguladores de crecimiento empleados en el medio de cultivo, tuvo los siguientes valores en las especies estudiadas:
H. marumiana var. batesiana
En callos desdiferenciados cultivados con ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1, de las 100 células analizadas se encontraron tres con 13, una con 15, dos con 24, dos con 27 y dos con 28 cromosomas; Asimismo, el cariotipo mostró alteraciones en la morfología de los cromosomas (Figura 2A) al cambiar de cromosomas acrocéntricos a metacéntricos. En cuanto a las células de raíces rediferenciadas, cultivadas en 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1, se encontró que en cuatro células el número cromosómico fue 13 y su cariotipo mostró que 12 cromosomas tuvieron morfología acrocéntrica y uno metacéntrica; además, en cuatro células se encontró un nivel tetraploide (4x=28), aunque se conservó la morfología acrocéntrica en el cariotipo.
H. fasciata var. major
En tres de un total de 100 células analizadas de callos desdiferenciados cultivados con ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 cambiaron los números cromosómicos a 26 y a 27; es decir, mostraron aneuploidía en relación al tetraploide. El examen de células de callo desdiferenciado y de raíces rediferenciadas cultivadas en un medio adicionado con 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1 de cinetina, mostró una dominancia de aneuploides en 90 células; los números observados fueron 24 y 26 cromosomas para cada tipo de tejido, respectivamente. Además de los diferentes cambios en número cromosómico, al analizar el cariotipo se encontró que en tales células se formaron cromosomas metacéntricos debido a la fusión de dos cromosomas acrocéntricos que originaron un cromosoma dicéntrico (dos centrómeros) con longitud mayor, con lo cual, a su vez, se causó la disminución del número total de cromosomas (Figuras 2B y C). Estos hallazgos coinciden con los de Mayer y Aguilera (1990), quienes sugirieron que la aneuploidía incrementa la frecuencia de eventos de pérdida de cromosomas.
H. limifolia var. ubomboensis
El análisis cromosómico de células de callos desdiferenciados cultivados en ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 exhibió a tres células con aneuploidía de 27 cromosomas y con uno de los cromosomas pequeños como metacéntrico. En las células derivadas de callos desdiferenciados cultivados con 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1, 35 de las células mostraron un cromosoma metacéntrico, cuatro presentaron la condición aneuploide con 26 y cuatro presentaron 27 cromosomas. En las células rediferenciadas de ápices de raíz, en este mismo medio de cultivo, se encontraron 21 células con aneuploidía de 27 cromosomas, los cuales presentaron un cromosoma metacéntrico.
Estabilidad de satélites y cariotipo bimodal
Las tres especies de Haworthia estudiadas se caracterizaron por presentar satélites en los dos brazos largos de dos cromosomas largos (2L 1 y 2L 4, Figura 1B-C); esto concuerda con lo encontrado por Jessy et al. (2005) para los cariotipos de cuatro especies, pese a su distinto número cromosómico, H. papillosa Haw. (2n=14), H. fasciata Haw. (2n=14), H. limifolia Marl. (2n=21) y H. reinwardtii Haw. (2n=35); además, concluyeron que independientemente de la naturaleza de los satélites, la característica común fue que se presentaron en el brazo largo de los respectivos cromosomas grandes en las cuatro especies, situación que coincide para las tres especies de la presente investigación, en las que aun cuando los distintos tratamientos en el medio de cultivo causaron cambios en número y morfología de cromosomas, en la presencia de los satélites no se observaron cambios. Parai et al. (2012) obtuvieron resultados similares para H. radula (Haw.) Duval (2n=14); sin embargo, en una especie autotetraploide (2n=28), H. limifolia Marl. var. keithii, no encontraron satélites.
Se considera complicado precisar la causa que produjo los cambios en los niveles del número y morfología de los cromosomas; sin embargo, los resultados concuerdan con los de Lee y Phillips (1988) en que la inestabilidad cromosómica se asocia más con el crecimiento desorganizado en callo. También fue evidente que cuando las células de callo desdiferenciado fueron cultivadas en 2,4-D y cinetina la inestabilidad fue mayor, ya que los niveles de ploídia aumentaron y se dieron cambios en morfología que originaron cromosomas metacéntricos, por lo cual a tal auxina se le puede considerar como un agente capaz de detener la división celular ocasionando irregularidades cromosómicas, como lo señalo Fiskesjö et al. (1981). Pavlica et al. (1991) encontraron que los tipos más frecuentes de aberraciones inducidas por el 2,4-D son fragmentos, puentes, poliploidías y aneuploidías, así como cambios en la actividad mitótica, en el ciclo celular y en la cromatina. También se puede suponer que en células que sufren cambios cromosómicos en alta frecuencia los efectos citológicos pueden ser una consecuencia directa de un incremento en la proporción de la división celular, inducida por la auxina e inclusive que ésta puede operar como un agente mutagénico. No obstante, también la combinación de ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1, y la fase de callo causaron cambios en el número y la morfología de los cromosomas en las tres especies de Hawothia, pero no con un efecto drástico como el del 2,4-D. Otro factor evidente en los resultados fue la influencia del genotipo, Puolimatka y Karp (1993) en un estudio en centeno, señalaron que hay genotipos que dan lugar a mayor inestabilidad que otros en las mismas condiciones de cultivo; por lo tanto, es necesario considerar que el tipo de auxina o citocinina adicionada al medio de cultivo, el tipo de tejido (callo desdiferenciado o raíces rediferenciadas), el tiempo de mantenimiento del callo, el genotipo, y la combinación de todos estos factores interactuan durante el cultivo in vitro de Haworthia para la estabilidad cromosómica.
En referencia al cariotipo, en esta investigación se encontró que el cariotipo bimodal permaneció estable cuando el número cromosómico diploide también así lo fue, pero cuando hubo poliploidía y aneuplodía se presentaron distintos cariotipos bimodales de acuerdo con el nivel de ploidía. Oginara (1981) mencionó que en todas las Aloineae la estabilidad del cariotipo bimodal es constante, ya que existe una fuerte selección para la conservación del cariotipo básico; sin embargo, en Haworthia las especies tetraploides presentaron 16 cromosomas grandes y 12 cortos (Parai et al., 2012), en especies triploides 12 largos y nueve cortos, y en pentaploides 20 largos y 15 cortos (Jessy et al., 2005).
Conclusiones
Las especies de Haworthia cultivadas in vitro, H. marumiana var. batesiana y H. fasciata var. major mostraron la mayor estabilidad en células de raíces rediferenciadas cultivadas en ANA 5.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 al no exhibir variación en el número cromosómico (2n=2x=14) ni en la morfología de cromosomas; sin embargo, no fue así para H. limifolia var. ubomboensis. En las células de callo hubo mayor variación en número y morfología de cromosomas, en comparación con las células de raíz. La combinación de 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1 y callo resultó letal dentro de la especie H. marumiana var. batesiana. La mayor inestabilidad en células tanto de callos como raíces se obtuvo con la dosis de 2,4-D 5.0 mg L-1 + cinetina 1.0 mg L-1, donde se encontró la menor conservación del número diploide y generación de poliploidía y aneuploidía, con números cromosómicos de 13, 14, 24, 26, 27 y 28, además de cambios en la morfología de los cromosomas de acrocéntricos a metacéntricos. También, la combinación de ANA 2.0 mg L-1 + BA 1.0 mg L-1 y fase de callo, causó cambios en el número y morfología de los cromosomas en las tres especies de Haworthia, pero no con un efecto drástico como el del 2,4-D. Los resultados evidenciaron que la respuesta del genotipo al ambiente proporcionado in vitro juega un papel importante para la estabilidad cromosómica, y brinda la oportunidad de realizar selección bajo tales condiciones de cultivo.
