Recolección de follaje

En 2019 se recolectó follaje de 92 árboles de Bursera linanoe de cuatro poblaciones en los estados de Morelos, Guerrero y Oaxaca en las subprovincias bióticas Balsasana y Cañadiana en México (Cuadro 1). Estas se identificaron con un número consecutivo, nombre de la subprovincia y el sitio donde el árbol crece. La distancia entre dos árboles donde se recolectó follaje fue variable; sin embargo, se evitó muestrear follaje de árboles ubicados a una distancia menor de 20 m. Las muestras de follaje fueron transportadas en caja de plástico con hielo al laboratorio del posgrado en Ciencias Forestales, Campus Montecillo del Colegio de Postgraduados, donde se almacenaron a -20 °C hasta la extracción del ADN.

El follaje se molió en mortero añadiendo nitrógeno líquido con el método CTAB modificado para la extracción de ADN ^{(Doyle y Doyle, 1987)}. A continuación, se colocaron 100 mg de tejido liofilizado, amortiguador de extracción a 60 °C y 2 µL de β-mercaptoetanol en un tubo Eppendorf de 2 mL; después, el tubo fue colocado en un vórtex para agitar el contenido por 5 s; posteriormente, los tubos se colocaron en un termobloque (Select Bio Products, West Palm Beach, Florida, EUA) para la incubación por 90 min a 65 °C; luego, el contenido en los tubos se mezcló en un agitador vórtex (Benchmark, Tempe, Arizona, EUA) por 10 min, y después se agregaron 500 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1). Posteriormente, los tubos fueron invertidos para mezclar el contenido por 10 min. A continuación, el contenido en los tubos se centrifugó a 13,500 rpm a 4 °C por 10 min. La fase acuosa superior fue vertida a un tubo de 1.7 mL, y se agregó isopropanol en proporción 1:1 con base en la cantidad de fase acuosa obtenida, la cual se agitó en un vórtex, y homogenizó por inmersión por 10 min. A continuación, los tubos fueron almacenados en un refrigerador a 4 °C durante 1 h, y posteriormente estos fueron colocados en una centrifuga que operó a 13,500 rpm por 15 min para formar la pastilla, la cual se precipitó al fondo del tubo, y el isopropanol se decantó. Se añadió 1 mL de etanol para lavar el isopropanol y la pastilla por inversión lenta la cual se decantó al final. Algunas muestras se lavaron dos veces con etanol; luego, el líquido se decantó y evaporó en una campana de extracción. La pastilla fue resuspendida en 50 µL de agua destilada estéril. Se agregó 1 µL de cada muestra al pedestal del Nanodrop 1000 c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EUA) para tomar lecturas de absorbancia a 260 y 280 nm para comprobar la calidad del ADN. Después de medir la calidad del ADN, cada una de las muestras fueron homogenizadas a 50 ng µL^-1. La integridad del ADN se confirmó mediante electroforesis en geles de agarosa 1.5 % (p/v).

Amplificación por PCR y electroforesis

Cinco ISSR amplificaron de nueve que se probaron. La solución de la reacción de PCR se elaboró para los iniciadores ISSR1 e ISSR4 ^{(Coppi et al., 2010)} en un volumen total de 25 µL el cual consistió en 100 ng de ADN, 4 µL de amortiguador 1X, 1.2 µL de MgCl₂ 1.5 mM, 2 µL de iniciador 10 mM, 0.4 µL de DNTPs 0.2 mM y 1.4 unidades de taq polimerasa (Promega). La misma reacción se realizó para el iniciador ISSR5 ^{(Coppi et al., 2010)}, pero con 50 ng de ADN. La reacción de la PCR se hizo para los iniciadores ISSRUBC827 e ISSRUBC840 ^{(Dos Santos Araújo et al., 2016)} en un volumen de 12 µL que contenía 100 y 150 ng de ADN respectivamente, 1.2 µL de amortiguador 1X, 0.96 µL de MgCl₂ 25 mM, 0.39 µL de iniciador 0.33 µM, 0.3 µL de DNTPs 0.25 mM y 0.5 unidades de taq polimerasa (Promega).

El termociclador (Techne TC-512, Heison Products, Chelmsford, Essex, UK)) fue programado para la reacción de la PCR con los iniciadores ISSR1, ISSR4 e ISS5, como se indica a continuación: el primer paso consistió en 94 °C durante 5 min para desnaturalizar el ADN, seguido por

35 ciclos a 94 °C por 40 s (desnaturalización), 43 °C por 45 s (alineamiento), y 72 °C por 90 s (extensión); un ciclo final a 94 °C por 45 s, 42 °C por 45 s y 72 °C por 5 min, mientras que para la reacción de PCR para ISSRUBC827 e ISSRUBC840 se siguió el protocolo siguiente: se desnaturalizó el ADN a 94 °C por 2 min, 37 ciclos de 94 °C por 15 s (desnaturalización), 47 °C por 30 s (alineación) y 72 °C por 60 s (extensión), y una extensión final a 72 °C por 60 s.

Los productos (5 µL de la reacción con los iniciadores ISSR1, ISSR4 e ISSR5 y 10 µL para ISSRUBC827, ISSRUBC840) de la PCR se colocaron en geles de agarosa 2 %, y se agregaron 2 µL de bromuro de etidio. En los pozos a los lados del gel, se vertieron 6 µL de marcador de peso molecular Phi y de 100 pb (Promega) y 2 µL del colorante Diamond (Promega). Los geles de agarosa se colocaron en una cámara de electroforesis que se aforó con amortiguador TBE 1X, y conectó a una fuente de poder que suministró una corriente eléctrica de 75 V por 2 h y 30 min. Al finalizar, los geles se visualizaron bajo luz ultravioleta en un fotodocumentador (UVP Epi Chemi II^TM Darkroom, Upland, California, EUA), y se tomó una fotografía de cada gel. La interpretación de los geles se hizo asignando 1 cuando se observó la presencia de una banda y 0 cuando la banda estuvo ausente para las muestras de cada uno de los árboles. Cada banda observada se consideró como un locus en las muestras estudiadas.

Análisis de la información

Los siguientes estimadores de diversidad genética fueron calculados con el programa GenAIEx V6.5 ^{(Blyton y Flanagan, 2012)}: porcentaje de loci polimórficos (P), heterocigosidad esperada (He), número efectivo de alelos (Ne) e índice se Shannon-Weaver. También se calcularon las distancias genéticas de Nei ^{(Nei, 1978)}, se elaboró un dendrograma con el método UPGMA y se hizo un análisis de varianza molecular (AMOVA) con el programa GenAIX V6.5 ^{(Blyton y Flanagan, 2012)}; además, se calculó la F_ST de Wright ^{(Hartl, 2020)} con el programa Excel de Microsoft.

Posteriormente, se estimó el número de migrantes por generación (Nm). También, la estructura genética se evaluó con el programa Structure V 2.3.4 que coloca los grupos (K) sin considerar el origen de cada individuo ^{(Pritchard et al., 2000)}. Se determinó el número de grupos (K) en los que se incluyen los árboles de lináloe con base en el procedimiento descrito por ^{Evanno et al. (2005)}. El coeficiente de correlación de Spearman fue calculado entre las distancias genéticas y las distancias geográficas entre poblaciones.

Diversidad genética

Se encontró el máximo porcentaje de loci polimórficos considerando todas las poblaciones de B. linanoe(Cuadro 2). Los mayores valores se registraron para los cuatro estimadores de diversidad genética de lináloe en la población en Atenango del Río, mientras que los menores valores en los estimadores de diversidad genética se encontraron en la población de Cuicatlán (Cuadro 2).

Estructura genética

El índice F_ST de Wright fue 0.160 entre las poblaciones estudiadas de B. linanoe. El número de migrantes (Nm) fue 1.3 por generación, mientras que, se encontró un F_ST de 0.05 entre subprovincias, y se estimaron cuatro migrantes por generación (Nm) entre subprovincias. El AMOVA indicó que 74 % de la diversidad genética se distribuye dentro de poblaciones, 21 % entre poblaciones y 5 % entre subprovincias.

La mayor distancia genética en los árboles de lináloe se presentó entre las poblaciones de Tlaquiltenango y Tecomavaca (Cuadro 3); estas poblaciones se localizan a 218 km una de la otra. Por otro lado, la menor distancia genética fue entre las poblaciones de Atenango del Río y Cuicatlán (Cuadro 3; Figura 1), las cuales se ubican a 231 km una de la otra. Se apreció una clara diferenciación genética de la población en Tlaquiltenango con respecto a las otras tres poblaciones (Figura 1). El coeficiente de correlación de Spearman fue -0.029 entre las distancias genéticas y distancias geográficas de las poblaciones de lináloe en las dos subprovincias bióticas.

Figura 1 Dendrograma construido con distancias genéticas de Nei de cuatro poblaciones de Bursera linanoe en dos subprovincias bióticas de México. 

Una estructura poblacional se encontró donde se definieron cuatro grupos (K = 4) con una probabilidad media estimada (lnK) y una varianza igual a -4891.55 y 199.87, respectivamente (Figura 2). El grupo K1, representado por el color amarillo, se formó con individuos de lináloe de Atenango del Río y árboles de Cuicatlán (Figura 2). Por otro lado, se agruparon árboles de Tecomavaca en el grupo K2, color rojo (Figura 2). También, el grupo K3 (color azul) se integró con árboles de Cuicatlán y Tecomavaca (Figura 2); asimismo, se construyó el grupo K4 (color verde) con individuos de las poblaciones Tlaquiltenango y Atenango del Río (Figura 2).

Figura 2 Agrupamiento sin considerar el origen de los individuos de Bursera linanoe de cuatro poblaciones naturales. Cada color representa un grupo (K) formado por el programa STRUCTURE. 

Diversidad genética

Bursera linanoe presentó una diversidad genética alta en las poblaciones estudiadas derivada de la interacción entre mutación, migración, deriva genética, selección y tipo de reproducción. Cuando un gen tiene solo dos alelos como es el caso de los marcadores moleculares dominantes ^{(Hartl, 2020)}, los valores de heterocigosidad esperada varían entre 0 y 0.5, y los valores del número de alelos por locus varían entre 1 y 2, mientras que el índice de Shannon varía entre 0 y 0.693 ^{(Blyton y Flanagan, 2012)}. Con base en lo anterior, incluso la población de lináloe en Cuicatlán, con los valores menores de los estimadores de diversidad genética en el presente estudio, tiene un nivel considerable de diversidad genética como resultado del apareamiento entre árboles diferentes, lo cual es común en lináloe debido a que esta especie tiene un sistema de reproducción dioico ^{(Gutiérrez-Santiago et al., 2016)}. La reproducción sexual es una de las principales fuentes de diversidad genética como consecuencia de la recombinación de cromosomas y segregación independiente en la meiosis ^{(Krebs et al., 2018)}. La mayor diversidad genética en la subprovincia Balsasana puede deberse a la presencia de un mayor número de árboles en cada una de las poblaciones en esta subprovincia, donde se encontró la densidad arbórea mayor (560 árboles ha^-1) en Atenango del Río y, en contraste, la densidad menor (33 árboles ha^-1) se encontró en Cuicatlán ^{(Cruz-Larios et al., 2022)}, población donde se registró la menor diversidad genética. Esto significa que el tamaño efectivo (Ne) de la población influyó en la magnitud de la diversidad genética encontrada.

Existen pocos estudios de diversidad genética en especies arbóreas que habitan el bosque tropical caducifolio tomando en consideración el número alto de especies de plantas que habitan en este bioma ^{(Rzedowski et al., 2004)}. La diversidad genética fue mayor en B. linanoe que en Bursera simaruba (He = 0.25, índice de Shannon = 0.37) en el bosque tropical caducifolio en Colombia ^{(Bocanegra-González et al., 2019)}. También, la diversidad genética fue mayor en B. linanoe que aquella en Boswellia sacra Flück (He = 0.222), una especie de la familia Burseraceae ^{(Coppi et al., 2010)}. ^{Quintero et al. (2021)} reportaron que la diversidad genética obtenida con microsatélites del cloroplasto fue menor para Bursera bipinnata (Moc. & Sessé ex DC.) Engl. (He = 0.197), B. cuneata (Schltdl.) Engl. (He = 0.175) y B. palmeri S. Watson (He = 0.072) que para B. linanoe.

Por su parte, el porcentaje de loci polimórficos fue mayor en B. linanoe que en Simarouba glauca DC (14.43 %) ^{(Kumar y Agrawal, 2017)}; sin embargo, el genoma del cloroplasto es pequeño comparado con el genoma nuclear de una planta ^{(Neale y Wheeler, 2019)}. También, marcadores moleculares distintos son informativos de secciones diferentes del genoma de una especie ^{(Sagar et al., 2023)}, por lo que, además, es recomendable estimar la diversidad genética de lináloe con otros marcadores moleculares codominantes como microsatélites (SSR) y polimorfismo de nucleótido único (SNPs) que pueden proporcionar información adicional para proponer estrategias de conservación para esta especie.

Estructura genética

La divergencia genética entre subprovincias es baja, a pesar de que las subprovincias Balsasana y Cañadiana se separaron en el periodo geológico Mioceno ^{(Alaniz-Álvarez y Nieto-Samaniego, 2005}; ^{De-Nova et al., 2012)}. El bajo número de migrantes (flujo génico) entre subprovincias puede ser la causa de la poca diferenciación genética entre subprovincias. Cuatro migrantes por generación son insuficientes para mantener una divergencia genética alta entre poblaciones ^{(Hartl, 2020)}; sin embargo, la diferenciación genética es alta entre las cuatro poblaciones de B. linanoe. ^{Hartl (2020)} menciona que valores de F_ST ≤ 0.15 y ≥ 0.25 indican una divergencia genética alta entre poblaciones. Valores > 0.25 indican una diferenciación genética muy alta ^{(Hartl, 2020)}. También, se presentan niveles muy altos (F_ST = 0.38) de diferenciación entre poblaciones de Boswellia sacra, una especie de la familia de las Burseraceae ^{(Coppi et al., 2010)}. Por otro lado, se encontró una diferenciación moderada (F_ST = 0.122) entre Bursera graveolens (Kunth) Triana & Planch., B. malacophylla B. L. Rob. y el híbrido putativo de estas especies en las islas Galápagos, mientras que se halló una diferenciación alta (F_ST = 0.221) cuando se incluyeron poblaciones alopátricas de estas especies ^{(Weeks y Tye, 2009)}.

El análisis molecular de varianza (AMOVA) confirmó la diferenciación baja entre subprovincias y una diferenciación alta entre poblaciones de lináloe. También, se registraron niveles muy altos de diversidad genética (40 y 52 %) entre poblaciones de Chrysodracon auwahiensis (Lu & Morden) y C. hawaiiensis (Degener & Degener) Lu & Morden, endémicas de Hawai con el uso de ISSR ^{(Lu et al., 2016)}; además, Pinus cembroides Zucc., una especie arbórea que crece en las zonas áridas presentó una diversidad genética muy alta (26 %) entre poblaciones usando ISSR como marcador molecular ^{(Fuentes-Amaro et al., 2019)}, valor similar a lináloe en la presente investigación.

Generalmente, las distancias genéticas se usan para medir la diferenciación entre poblaciones con base en las frecuencias alélicas ^{(Frankham et al., 2002)}. Los valores de distancias genéticas (Cuadro 3) para lináloe están dentro del intervalo reportado para plantas, los cuales varían entre 0.02 y 0.07 para subespecies y entre 0.05 y 0.79 para especies ^{(Nei, 1987)}; sin embargo, algunos valores de las distancias genéticas fueron menores en lináloe que los valores de 0.09 a 0.235 reportados entre poblaciones de P. cembroides^{(Fuentes-Amaro et al., 2019)}.

El análisis a través del software STRUCTURE muestra una estructura genética clara de las poblaciones de lináloe con un número de grupos (K) igual al número de poblaciones naturales incluidas en el estudio. El grupo K1 se formó con árboles que tienen origen en Atenango del Río y Cuicatlán, confirmando la menor similitud que se detectó con las distancias genéticas entre estas dos poblaciones (Cuadro 3), aunque K puede ser sobreestimado cuando se presenta apareamiento entre árboles emparentados de una población ^{(Hubisz et al., 2009)}. Quizás se pudo presentar apareamiento entre árboles genéticamente relacionados en la población de lináloe en Cuicatlán, donde la densidad de árboles (33 árboles ha^-1) y la diversidad genética fueron menores (Cuadro 2) ^{(Cruz-Larios et al., 2022)}, bajo el supuesto de que una menor densidad de árboles es un indicador de un tamaño efectivo (Ne) reducido de la población donde la probabilidad de apareamiento entre individuos genéticamente emparentados aumenta, disminuyendo la diversidad genética ^{(Frankham et al., 2004)}.

Los valores altos de heterocigosidad esperada para B. linanoe indican que la selección puede ser la fuerza evolutiva que está conduciendo a la diferenciación de las poblaciones de lináloe debido a que la migración inhibe los efectos de la deriva genética ^{(Hartl, 2020)}. El número de migrantes entre poblaciones de B. linanoe es suficiente para evitar la diferenciación entre poblaciones de esta especie y mantener la diversidad genética a través del flujo génico o migración y favoreciendo los niveles altos de diversidad genética a través de la selección de individuos genéticamente diferentes y un apareamiento cruzado favorecido por una polinización por insectos ^{(Daly et al., 2022}; ^{Rivas-Arancibia et al., 2015)}. Un migrante por cada dos generaciones es suficiente para evitar la diferenciación por efecto de deriva genética ^{(Hartl, 2020)}. También, se presenta un número de migrantes suficiente (Nm= 3.57) para evitar el efecto de deriva genética para B. simaruba, una especie con amplia distribución en el bosque tropical caducifolio ^{(Dunphy y Hamrick, 2007)}.

Por los resultados, se recomienda establecer una estrategia de conservación donde se consideren como prioritarias las cuatro poblaciones de lináloe; también se sugiere incluir otras poblaciones de B. linanoe en estudios de diversidad genética utilizando marcadores moleculares, secuenciación y estudios de jardín común para generar información como base para la conservación de lináloe.