INTRODUCCIÓN

La agricultura protegida es un sistema de producción agrícola en el que destacan los invernaderos, los cuales se clasifican en niveles bajo, medio y alto grado de acuerdo con las tecnologías que se implementan en ellos, como películas plásticas, sustratos, sistemas de producción y automatización climática (^{García et al. 2011}). Las tecnologías influyen principalmente en las condiciones ambientales generadas en el interior del invernadero, ya que se crean las óptimas y apropiadas de radiación, temperatura, humedad, dióxido de carbono y circulación de aire para la reproducción, desarrollo y crecimiento de las plantas, así como el aumento de producción (^{Castañeda et al. 2007}). Asimismo, dichas condiciones favorecen el crecimiento, desarrollo y propagación de organismos tanto benéficos como perjudiciales, los cuales pueden manifestarse como plagas y enfermedades que implican mayor riesgo económico. Por ello el productor recurre de manera continua a plaguicidas para eliminarlas (^{Sonneveld y Voogt 2009}, ^{Salazar et al. 2012}).

Debido a sus condiciones sociales y culturales, los jornaleros que laboran en invernaderos no respetan o desconocen las instrucciones sobre el uso y manejo de plaguicidas, o bien minimizan su riesgo para la salud; esto, aunado a que el invernadero es un espacio cerrado con escasa circulación de aire y volatilización de agroquímicos, lo que aumenta la exposición, riesgo y probabilidad de afectación para su salud (^{Haro-García et al. 2002}, ^{Bortoli et al. 2009}, ^{Ortega-Martínez et al. 2014}). La constante exposición a vapores y residuos de plaguicidas presentes en el ambiente del invernadero, que son espacios cerrados, favorecen el proceso de absorción de sustancias tóxicas a través de su inhalación, absorción dérmica o ingestión, la que puede originar el daño citogenético (^{Costa et al. 2006}, ^{Peralta et al. 2011}).

Diversos estudios de monitoreo de jornaleros de invernaderos expuestos laboralmente a plaguicidas, utilizaron variedad de biomarcadores nucleares de exposición, como aberraciones cromosómicas, micronúcleos, intercambio de cromátidas hermanas y el ensayo cometa, encontrando resultados positivos (^{Costa et al. 2006}, ^{Peralta et al. 2011 Gómez-Arroyo et al. 2000}, ²⁰¹³), así como resultados negativos de la exposición (^{Lucero et al. 2000}, ^{Piperakis et al. 2003}, ²⁰⁰⁶, ^{Lamadrid et al. 2011}). Las diferencias en los resultados pueden asociarse a extensas fuentes de variabilidad ocasionadas principalmente por el implemento de tecnologías en el invernadero que modifican las condiciones ambientales, el comportamiento de los plaguicidas y la exposición de los jornaleros, en comparación con un sistema de cultivo convencional en el que la degradación o dispersión de vapores de plaguicidas es más rápida por la radiación solar, el aire y la lluvia (^{Sonneveld y Voogt 2009}, ^{Bojacá et al. 2013}, ^{Wu et al. 2013}).

El objetivo de este trabajo fue determinar el daño citogenético en las células epiteliales de exfoliación bucal a través del ensayo de micronúcleos, evaluando las frecuencias de anormalidades nucleares en personas no expuestas y expuestas a los plaguicidas en invernaderos de alta y baja tecnología en Atlixco, Puebla, México.

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se desarrolló en el municipio de Atlixco, localizado en el centro-oeste del estado de Puebla, a una altitud promedio de 1840 msnm, entre las coordenadas 18º 49’ 30”-18º 58’ 30” N y 98º 18’ 24”-98º 33’ 36” O. El criterio para seleccionar a los jornaleros se basó en el inventario de invernaderos del estado de Puebla (^{INEGI 2008}).

Los invernaderos seleccionados representaron una superficie de 5000 y 7000 m² de sembradío para la producción de jitomate con baja y alta tecnología, respectivamente, de acuerdo con la clasificación de ^{García et al. (2010)}. Los grupos de estudio se formaron con 40 jornaleros (16 mujeres y 24 hombres) con una edad promedio de 32.9 ± 8.0 años, los cuales laboraron en invernaderos con antigüedad de 3 a 4 años y aceptaron voluntariamente participar en el estudio. Por otra parte, el grupo no expuesto estuvo constituido por 40 individuos (16 mujeres y 24 hombres) no involucrados en labores del invernadero ni en el uso y aplicación de plaguicidas, con una edad promedio de 30.1 ± 10.3 años. Todos los participantes fueron informados sobre el objetivo del estudio y firmaron el consentimiento de participación. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Popular Autónoma del Estado de Puebla.

A los participantes se les solicitó enjuagarse la boca con agua y se les realizó un raspado de la parte interna de las mejillas con una espátula estéril para recolectar las células epiteliales de descamación, las cuales se colocaron en laminillas previamente codificadas para evitar el sesgo durante el conteo y se dejaron secar al aire libre. Posteriormente, las células se fijaron con una mezcla de metanol-ácido acético (3:1). La hidrolización del ADN y su tinción se realizaron mediante la reacción de Feulgen. Las anormalidades nucleares se clasificaron de acuerdo con los criterios de ^{Stich y Rosin (1984)}, ^{Stich (1987)}, ^{Tolbert et al. (1992)}, ^{Martínez-Valenzuela et al. (2009)}, ^{Thomas et al. (2009)} y ^{Bolognesi y Fenech (2013)}. Las observaciones en el microscopio de campo claro se realizaron sobre las células con núcleos bien definidos entre 1000 células diferenciadas de cada muestra, con el fin de determinar la frecuencia de micronúcleos y otras anormalidades nucleares como picnosis, cromatina condensada, brotes nucleares, cariolisis y células binucleadas. Las células degeneradas no se contaron para el estudio.

RESULTADOS

Los ingredientes activos de los principales plaguicidas empleados en los invernaderos son los clasificados como ligeramente peligrosos (Cuadro I). Sin embargo, los de baja tecnología incluyen imidacloprid, una sustancia altamente peligrosa que se utiliza principalmente en insecticidas y funguicidas para el control de la mosquita blanca (Bemisia tabaco) y de podredumbre gris (Botrytis cinérea).

No se observaron diferencias entre las edades de ambos grupos. El grupo de jornaleros presentó una edad de 32.9 ± 8.0 años en comparación con el grupo no expuesto (30.1 ± 10.3 años), sin diferencia estadísticamente significativa (p > 0.05). Al analizar los valores de anormalidades nucleares en células epiteliales bucales entre los jornaleros comparados con los testigos, las frecuencias más altas de anormalidades correspondieron a los jornaleros de los invernaderos, las cuales fueron estadísticamente significativas (p < 0.05). Para comparar el efecto de la exposición a vapores de agroquímicos presentes en el lugar laboral entre los jornaleros y el grupo testigo, se calculó el IF en las anormalidades nucleares. Los resultados se presentan en el cuadro II.

Para diferenciar los factores que definen las condiciones laborales en los invernaderos, considerando el uso de alta tecnología (20 jornaleros) y baja tecnología (20 jornaleros), se dividió el grupo total de acuerdo a este factor. Los resultados de la evaluación estadística se presentan en el cuadro III para el grupo de jornaleros que laboraron en invernaderos con alta tecnología y en el cuadro IV para los que laboraron en invernaderos de baja tecnología. La comparación de ambos grupos de jornaleros se presenta en el cuadro V.

Para evaluar el factor de género como indicador de exposición a los vapores de plaguicidas en los invernaderos con alta tecnología y baja tecnología, las poblaciones se dividieron de acuerdo a esta variable. Los resultados con las diferencias calculadas, se presentan en los cuadros VI y VII.

DISCUSIÓN

La exposición ocupacional puede relacionarse con el desarrollo de diferentes padecimientos inducidos por los mecanismos que residen en cambios de cromosomas (^{Martino-Roth et al. 2003}). La exposición medida con la magnitud de anormalidades nucleares, expresa el tamaño de exposición y su prevalencia en las personas expuestas (^{Srám y Binková 2000}). Uno de los biomarcadores de irregular división celular que involucra el rompimiento de cromosomas, inadecuada segregación de cromatina o las interferencias en mitosis, es la formación de micronúcleos y otras anormalidades nucleares. La frecuencia de estos eventos observados en células epiteliales bucales puede constatar el tamaño de la exposición (^{Holland et al. 2008}), ya que el aumento de frecuencias en anormalidades nucleares puede relacionarse con el paso temprano en la carcinogénesis (^{Bonassi et al. 2011}).

Los resultados de nuestro estudio con individuos expuestos a plaguicidas en invernaderos coinciden con los descritos por ^{Bortoli et al. (2009)}, ^{Martínez-Valenzuela et al. (2009)}, ^{Larrea-Poma et al. (2010)}, ^{Kvitko et al. (2012)}, ^{Benedetti et al. (2013)} y ^{Carbajal-López et al. (2016)}, quienes encuentran un incremento significativo en las frecuencias de células binucleadas, cromatina condensada y células cariolíticas en trabajadores expuestos en comparación con los testigos, que corresponden a personas no involucradas en la aplicación de plaguicidas. Este incremento de anormalidades nucleares es principalmente resultado de la continua exposición a plaguicidas rociados en invernaderos y aspirados por los trabajadores. Los estudios referidos muestran sólo un incremento de células con anormalidades nucleares, mientras que las frecuencias de anormalidades nucleares en nuestro estudio fueron pronunciadas y tuvieron significancia estadística mayor.

El análisis de frecuencias de anormalidades nucleares que toma en cuenta el factor de uso de tecnología aplicada en los invernaderos, el cual al mismo tiempo refleja la educación de los jornaleros para laborar en condiciones insalubres y manejar el plaguicida con precaución, indica aumentos moderados de células cariolíticas, células binucleadas y con cromatina condensada en comparación con el grupo de testigo.

La comparación de los IF de anormalidades nucleares entre individuos que laboran en invernaderos con alta y baja tecnología evidencia frecuencias superiores en el caso de invernaderos de baja tecnología, con resultados similares a los de ^{Bolognesi et al. (2004)}, quienes mencionan un aumento de anormalidades por mayor exposición a plaguicidas. El aumento de frecuencias de anormalidades nucleares en la mucosa normal, observado en las lesiones precancerosas y en el carcinoma sugirió un vínculo de este biomarcador con la progresión neoplásica causada por múltiples factores que incluyen la exposición a vapores de plaguicidas inhalados durante la jornada laboral (^{Casartelli et al. 2000}). La presencia de micronúcleos en células de exfoliación bucal es un evento relativamente raro, cuya frecuencia es de una célula con micronúcleos por cada 1000 células de descamación con una variabilidad individual específica (^{Ceppi et al. 2010}). Se han reportado frecuencias de 0.5 a 2.5 MN/1000 células (^{Kashyap et al. 2012}). En nuestro estudio, el valor promedio del grupo testigo fue de 1.9 MN/1000 células, valor que se encuentra dentro de los reportados.

Los datos sugieren que los efectos genotóxicos se incrementan en los tejidos linfoides y epiteliales a causa de la exposición al mutágeno o de una enfermedad degenerativa. Los defectos hereditarios en el mantenimiento del genoma son sistémicos y se producen en todos los tejidos. Por consiguiente, se considera que las diferencias en la cinética de replicación y la vida media de células bucales no pueden afectar a la expresión de las frecuencias en anormalidades nucleares. Además, las diferencias pierden importancia en condiciones de exposición crónica, la cual conduce a un estado de equilibrio con un elevado nivel de expresión independientemente de la tasa de división celular, cuando el periodo de exposición excede el marco de tiempo para una división nuclear (^{Fenech et al. 2011}). Los carcinógenos del tracto aerodigestivo aumentan la frecuencia de anormalidades nucleares tanto en las células bucales como de linfocitos, debido a que llegan principalmente a la corriente sanguínea, presentando un efecto sistémico para los tejidos. Finalmente, en células bucales, las anormalidades nucleares se expresan en las células basales en división de las capas profundas de la mucosa bucal (^{Ceppi et al. 2010}). Otros factores que valoran el ensayo del citoma y la frecuencia de células basales, células binucleadas, brotes nucleares, células picnóticas, células cariolíticas y células con cromatina condensada, se desarrollaron con menor frecuencia. Cabe señalar que en nuestro estudio el criterio de valoración (proporción de células binucleadas, células con cromatina condensada, células cariolíticas, células picnóticas, células con brotes nucleares y con micronúcleos) reveló valores elevados que llaman la atención como indicadores de riesgo laboral con las consecuentes afectaciones para la salud.

El comportamiento en casos de anormalidades nucleares puede explicarse por los factores de una desigual exposición a genotóxicos exógenos procedentes del ambiente ocupacional y diferente respuesta entre los géneros; no obstante, los resultados difieren a los de ^{Lucero et al. (2000)}, quienes indicaron que no encontraron diferencias estadísticamente significativas entre trabajadores de invernaderos expuestos a plaguicidas y los no expuestos.

En casos de exposición crónica, las diferencias entre la cinética de replicación y la vida media entre células bucales puede afectar la aparición de anormalidades nucleares en la mucosa bucal, ya que dicha exposición crónica conduce a una expresión elevada en estado estacionario de estas anormalidades, independiente de la tasa de división celular, si el periodo de exposición excede el tiempo necesario para una división nuclear (^{Ceppi et al. 2010}). Al comparar en este estudio a los individuos expuestos a plaguicidas con el grupo no expuesto, el daño al ADN se observa como consecuencia del contacto con los vapores de plaguicidas que persisten en los invernaderos, cuya magnitud podría depender de la tecnificación de los invernaderos para la producción agrícola.

CONCLUSIONES

Nuestros resultados proporcionan información sobre las frecuencias de anormalidades nucleares y citotoxicidad originada por el uso de plaguicidas en los invernaderos y el trabajo en condiciones de gran exposición a sus vapores. La combinación del grado de alteraciones nucleares específicas en las células bucales con el desarrollo de diversas enfermedades, puede desempeñar un papel importante en la identificación de individuos con alto riesgo de desarrollar enfermedades laborales; asimismo, pone de manifiesto que los individuos que laboran en invernaderos mostraron una mayor frecuencia de células con anormalidades nucleares, debido al efecto citotóxico de la exposición a los plaguicidas. La investigación de daños al ADN es un proceso necesario para evaluar la calidad del ambiente laboral, así como una herramienta para la educación de los trabajadores con el objetivo de disminuir el daño genético y prevenir el riesgo de enfermedades graves.