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INTRODUCCIÓN
La creciente industrialización y la urbanización han generado contaminantes antrópicos que afectan los ecosistemas (Hazim y Al-Ani 2019). El sector petroquímico es uno de los que más afecta porque causa contaminación en agua y suelo durante las actividades de extracción, transporte y refinamiento del petróleo, así como por fugas accidentales derivadas del mal manejo, estructuras en mal estado y robo de hidrocarburos (Cocârţă et al. 2017). Lo anterior genera afectaciones a flora, fauna, poblaciones microbianas, cuerpos de agua, suelo, y a la salud humana provocando enfermedades crónicas potencialmente cancerígenas, mutagénicas y teratogénicas (Hazim y Al-Ani 2019, Chan-Quijano et al. 2020).
Para la descontaminación de suelos existen tratamientos físicos y químicos que favorecen la dispersión del contaminante, pero no de su remoción; además son alternativas costosas, causan daños al ambiente e impiden la recuperación de ciertos hábitats. Por lo anterior, es necesario el uso de biotecnologías amigables con el ambiente que promuevan los procesos naturales de remoción de contaminantes, como la biorremediación (Hou et al. 2021). La biorremediación es una alternativa de limpieza de suelos contaminados mediante el uso de plantas y microorganismos para extraer, acumular, remover, reducir, transformar, mineralizar, degradar, volatilizar o estabilizar contaminantes (Arias-Trinidad et al. 2017, Guevara-Espinosa et al. 2018). Las bacterias, entre otros microorganismos, tienen la capacidad de tomar los contaminantes orgánicos como fuente de energía y de carbono. Por su parte, las plantas también pueden oxidar o acumular contaminantes orgánicos, lo que se conoce como fitorremediación (Daryabeigi y Hoveidi 2018, Ordoñez et al. 2018). Así, la fitorremediación aprovecha la capacidad de las plantas y sus bacterias asociadas para realizar procesos de descontaminación (Ordoñez et al. 2018).
El éxito de la fitorremediación se basa en la identificación de aquellas especies vegetales que produzcan abundante biomasa y que además toleren y degraden los contaminantes (García-Ávila et al. 2018). El girasol (Helianthus annuus L.) es una planta ampliamente reconocida como fitorremediadora de suelos contaminados con metales pesados y metaloides (Gutiérrez-Espinoza et al. 2011, Adejube et al. 2017, Zehra et al. 2019). Además, tiene potencial para acumular compuestos tóxicos ya que produce abundante biomasa y mejora las condiciones del suelo contaminado, y junto con bacterias rizosféricas asociadas, el girasol podría usarse como una alternativa efectiva, económica y ecológica para acelerar la eliminación de contaminantes orgánicos del suelo (Gutiérrez-Espinoza et al. 2011, Adejube et al. 2017, Rani et al. 2019, Zehra et al. 2019).
La fitorremediación asistida por microorganismos benéficos es uno de los métodos efectivos para favorecer la limpieza ambiental por su amplia aplicabilidad, rentabilidad y naturaleza ecológica (Malik et al. 2022). Los microorganismos generan metabolitos que promueven el crecimiento vegetal y, además, reducen los niveles de toxicidad del sitio; estas asociaciones permiten que ambos componentes se establezcan en sitios contaminados y lleven a cabo la fitorremediación (Gkorezis et al. 2016). Por lo anterior, el aislamiento y la selección de microorganismos nativos adaptados a los hidrocarburos son fundamentales para garantizar el éxito de la fitorremediación (Gkorezis et al. 2016). Así, el objetivo de la presente investigación fue evaluar la fitotoxicidad y fitorremediación de plantas de girasol en un suelo contaminado con gasolina, asistidas con bacterias rizosféricas nativas tolerantes al hidrocarburo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolecta del suelo
Se utilizó un suelo recolectado en Palmarito Tochapan, Puebla, México, sin antecedentes de contaminación por hidrocarburos de petróleo. El suelo no ha sido perturbado y se encuentra por donde pasa un ducto de gasolina que abastece a la Ciudad de México. Se consideraron los primeros 30 cm de profundidad, se secaron a temperatura ambiente y se tamizaron en malla de 2 mm (Daryabeigi y Hoveidi 2018). El suelo utilizado en cada fase experimental que se describe a continuación, no fue esterilizado para asegurar la presencia de los microorganismos nativos. Se determinaron las características físicas y químicas del suelo recolectado (laboratorio de Fertilidad de Suelos, Colegio de Postgraduados), que se muestran en el cuadro I. El análisis físico y químico del suelo se realizó considerando los estudios que dicta la NOM-021-RECNAT-2000 (SEMARNAT 2000).
CUADRO I PROPIEDADES FÍSICAS Y QUÍMICAS DE LOS SUELOS SIN CONTAMINAR CON GASOLINA.
| Parámetro | Valor | |
| Recolecta de suelo Fase 1 | Recolecta de suelo Fase 3 | |
| pH | 7.4 | 8.3 |
| Contenido de materia orgánica (%) | 1.80 | 1.93 |
| Textura (%) | *Franca | *Franca limosa |
| Capacidad de intercambio catiónico (Cmol(+)/kg) | 13.7 | 14.44 |
| P disponible (mg/kg) | 79.8 | 61.4 |
| Nitrógeno total (%) | 0.042 | 0.077 |
| Conductividad eléctrica (1/dSm) | 5.12 | 1.1 |
*Según la norma mexicana NOM-021-RECNAT-2000 (SEMARNAT 2000).
Fase 1. Tolerancia de Helianthus annuus L. a gasolina
Contaminación del suelo. Para la fase 1, en 5 kg de suelo se aplicó gasolina (Magna comercial) disuelta en 0.15 L de hexano (pureza de 98.5 %, Karal®) que se mezcló de manera mecánica con una pala de metal para homogenizar lo mejor posible el suelo, para lograr las concentraciones de 200, 400, 800, 1600, 2400 y 3200 mg de gasolina/kg de suelo y un tratamiento testigo (sin gasolina) (Alarcón et al. 2008). Para lograr cada concentración, la gasolina agregada por cada 5 kg de suelo varió según los requerimientos por tratamiento (1000, 2000, 4000, 8000, 12 000 y 16 000 mg de gasolina). Después de contaminar el suelo, se dejó en reposo por 48 h en invernadero, para dejar evaporar el solvente que se utilizó (hexano). Pasadas las 48 h de reposo del suelo, se utilizó 1 kg por cada unidad experimental (UE) donde se sembraron 10 semillas de girasol variedad Victoria y al emerger las plántulas, se raleó a ocho plantas (Escalante-Estrada et al. 2015). Las plantas se regaron con agua potable de acuerdo con los requerimientos necesarios (~100 mL de agua por UE) y se mantuvieron por 20 días.
Posteriormente, las plantas se cosecharon y se midió la altura y la longitud radical. La biomasa seca total se determinó secando las plantas completas en bolsas de papel a 70 ºC durante 72 h, posteriormente se pesaron en una balanza analítica.
Fase 2. Bacterias nativas tolerantes a gasolina en suelo contaminado
Aislamiento de bacterias tolerantes a gasolina y caracterización fenotípica de las colonias seleccionadas
A partir de 10 g de los suelos contaminados con gasolina y que fueron utilizados en la fase 1, se realizaron diluciones seriadas en solución isotónica; posteriormente, se tomaron 100 µL de las diluciones y se esparcieron con una espátula de Drigalsky sobre cajas Petri conteniendo agar nutritivo, las cajas se incubaron a 28 ºC durante 72 h. Después se realizó un conteo de unidades formadoras de colonias (UFC). Las cepas bacterianas se caracterizaron fenotípicamente mediante la descripción de la forma, superficie, color, textura y bordes de cada cepa, las caracterizaciones microscópicas se realizaron con la descripción de Ramírez-Gama et al. (2021), empleando tinción de Gram y observaciones al microscopio.
Pruebas bioquímicas de las cepas aisladas
Cada una de las pruebas se realizó de manera cualitativa para cada una de las cepas seleccionadas. La producción de índoles totales que incluyen al ácido indolacético (AIA), se realizó con el método modificado por Brick et al. (1991). El cambio de color amarillo a rosado fue considerado como actividad positiva en la producción de AIA para cada cepa bacteriana. El potencial de fijación biológica de nitrógeno (FBN) se realizó mediante el medio semisólido de malato libre de nitrógeno (NFb) en tubos de ensayo, en los que se sembró una asada correspondiente a cada cepa bacteriana, incubados a 28 ºC por 168 h. El cambio de color verde esmeralda a azul se consideró como actividad positiva a la fijación de nitrógeno atmosférico para cada cepa bacteriana (Almaraz-Suarez et al. 2020). La producción de sideróforos se realizó con el método de Schwyn y Neilands (1987), la presencia de halos de color naranja alrededor del crecimiento bacteriano se consideró como actividad positiva para la producción de sideróforos. Por último, la prueba de solubilización de fosfatos se realizó en medio Pikovskaya, se evaluó como actividad positiva a las cepas bacterianas a partir de la formación de halos claros alrededor del crecimiento bacteriano (Pikovskaya 1948).
Identificación molecular de las cepas
La identificación molecular de las cepas y la reconstrucción filogenética se realizó mediante inferencia bayesiana (Fuentes-Aragón et al. 2018).
Fase 3. Fitorremediación asistida por bacterias rizosféricas nativas
Preparación del inóculo bacteriano e inoculación
Las cepas bacterianas fueron aisladas de suelo contaminado con gasolina, y seleccionadas por su capacidad de producir fitohormonas, fijar nitrógeno atmosférico, producción de sideróforos y capacidad de solubilizar fosfatos (Fase 2). Las bacterias fueron propagadas individualmente en frascos de vidrio con 180 mL de medio Luria-Bertani. Los frascos fueron incubados en agitación a 180 rpm en una incubadora orbital digital (SHKE4000, Modelo 4328) a 28 ºC por 72 h. Posteriormente, las soluciones bacterianas fueron centrifugadas (Damon/IEC Division HN-SII) a 3500 rpm durante 30 min. El sobrenadante fue decantado y el botón bacteriano fue recuperado con 180 mL de agua destilada estéril, se realizaron tres lavados con agua destilada estéril. El consorcio bacteriano se preparó con el volumen inicial del cultivo para cada cepa y para obtener un volumen final de 1800 mL con agua destilada estéril. El conteo de las UFC fue estimado a partir de 1 mL de la suspensión bacteriana del cual se hicieron diluciones decimales (10-1 a 10-6), se tomó 0.1 mL de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6, y se colocó en cajas de Petri con agar nutritivo con cinco repeticiones por dilución. Las cajas fueron incubadas a 28 ºC y las UFC cuantificadas a las 24, 48 y 72 h. La carga bacteriana del consorcio fue de 4.0x108 UFC/mL. La inoculación del consorcio se realizó alrededor del sistema radical, 17 días después de la siembra, cada UE fue inoculada con 30 mL de la suspensión bacteriana de acuerdo con los tratamientos establecidos.
El suelo se contaminó disolviendo la gasolina en 375 mL de hexano, se aplicó en 10 kg de suelo, en concentraciones de 0, 1600 y 3200 mg de gasolina/kg de suelo; en cada contenedor se colocó 1 kg de suelo. Se dejó reposar por 48 h en condiciones de invernadero para dejar evaporar el solvente que se utilizó. Pasadas las 48 h de reposo, 10 semillas de girasol se sembraron en cada contenedor como unidad experimental (UE) y al emerger, se raleó a 5 plántulas por cada UE. Antes de sembrar las semillas de girasol, éstas se desinfectaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 1 % (Clorox®) durante 10 min, y se realizó un enjuague con agua destilada estéril. Posteriormente, las semillas fueron sumergidas en alcohol al 70 % por un minuto, y se enjuagaron ocho veces con agua destilada estéril (Gutiérrez-Espinoza et al. 2011). Lo anterior se realizó debido a que en un primer intento se observó la presencia de marchitez causada por hongos después de que las semillas germinaban, de tal manera que la desinfección reduciría la incidencia que generaba esta marchitez.
Las plantas se regaron con agua potable de acuerdo con los requerimientos necesarios (~200 mL), y se mantuvieron por 60 días en condiciones de invernadero. Posteriormente, las plantas fueron cosechadas y se estimó la longitud radical, las hojas se separaron de los tallos para calcular el área foliar mediante un medidor de área foliar (Licor, LI 3000, Inc. Lincoln, NE, EUA). La biomasa seca de hojas, tallo, raíz y total se determinó secando cada órgano en un horno (SL, Shel Lab) a 70 ºC por 72 h y se pesaron en balanza analítica. El área foliar específica (cm2/g) se estimó dividiendo el área foliar entre el peso seco de las hojas (Morales-Guzmán et al. 2020). La relación raíz/parte aérea se obtuvo a partir del peso de la biomasa de las raíces entre la biomasa de la parte aérea (García-Castro et al. 2018).
Extracción y cuantificación de hidrocarburos derivados de la gasolina
Por triplicado, las muestras de suelo se secaron a temperatura ambiente, se tomaron 10 g de suelo que se colocaron en bolsas de papel filtro. Para la extracción del contaminante del suelo, se utilizó un Soxhlet; en matraces de bola de fondo plano se agregaron 200 mL de disolvente hexano y en el sifón la muestra de suelo (mínimo 8 h a 69 ºC), para permitir el flujo del hexano y obtener muestras en el disolvente (Rani et al. 2019). Después, la muestra se concentró en un rotaevaporador (Modelo, RE200) y con un baño María (BM100) a 70 ºC, conectado con una bomba de vacío hasta obtener muestras secas. Tras la evaporación del disolvente, se añadió hexano para obtener un volumen total de 3 mL y la solución se transfirió a viales, se dejó volatilizar a temperatura ambiente hasta secar (Hou et al. 2019).
Análisis por cromatografía de gases
Los viales fueron resuspendidos en 20 µL de hexano; se utilizó un cromatógrafo de gases (Agilent Technologies, modelo 6890N, Net Work GC system), equipado con una columna DB-5, 5%-fenil-metilpolisiloxano (Agilent Technologies) de 60 metros de longitud, 0.25 mm de diámetro interno y 0.25 µm de espesor de película. La temperatura de inicio fue 50 ºC y se mantuvo durante 5 min, posteriormente la temperatura se elevó hasta 280 ºC usando una rampa de calentamiento de 20 ºC/min, durante 20 min. Se usó helio como gas acarreador con un flujo de 1 mL/min, la temperatura del inyector fue 250 ºC, inyección en modo de división, con una relación de 5:1.
Diseño experimental y análisis estadístico
En la Fase 1 se calculó el porcentaje de germinación, la altura de la planta, la longitud radical y la biomasa seca total, que consistió en siete tratamientos con cinco repeticiones cada uno, distribuidos en un diseño experimental completamente al azar.
En la Fase 2, se evaluaron las poblaciones de bacterias fijadoras de nitrógeno atmosférico (BFNA) en UFC/g de suelo, en un diseño experimental completamente al azar con tres niveles de contaminación del suelo (baja, media y alta) y un suelo testigo sin contaminante, con tres repeticiones cada uno.
En la Fase 3 se evaluó la altura de planta, longitud radical, relación vástago/raíz, número de hojas, área foliar, área foliar específica, biomasa seca aérea, radical y total, y se cuantificaron las UFC de BFNA. Se utilizó un experimento factorial 3x2, con tres niveles de contaminación (0, 1600 y 3200 mg/kg), y dos niveles de bioaumentación (sin y con inoculación bacteriana); en total se obtuvieron seis tratamientos con nueve repeticiones cada uno, distribuidos en un diseño experimental completamente al azar.
Los datos obtenidos en la Fase 1 y Fase 3 fueron sometidos al análisis de varianza, prueba de comparación de medias (LSD, α ≤ 0.05) y estimación del error estándar para cada media de cada tratamiento (SAS System 2000).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Fase 1. Tolerancia de Helianthus annuus L. a gasolina
La germinación de las semillas de girasol no fue afectada por las concentraciones de gasolina, registrándose porcentajes de germinación mayores al 96 % (Fig. 1A). La germinación de semillas ha sido base para evaluar la toxicidad de hidrocarburos del petróleo o de contaminantes inorgánicos (Daryabeigi y Hoveidi 2018, Pernía et al. 2018). Contrario a nuestros resultados, Pernía et al. (2018) reportaron la disminución de la germinación de semillas de Lactuca sativa expuesta a concentraciones de hidrocarburos aromáticos policíclicos (naftaleno, fenantreno y pireno). Por su parte, Daryabeigi y Hoveidi (2018) encuentran que dosis de hidrocarburos totales del petróleo mayores a 3000 mg/kg, disminuyeron la germinación de semillas de Kochia scoporia L. y Zea mays L. Es posible que la diferencia en las respuestas entre estos resultados y los obtenidos en el presente estudio puedan deberse al tipo de hidrocarburo utilizado en los experimentos y a la especie de planta (Daryabeigi y Hoveidi 2018).
Fig. 1 A) Porcentaje de germinación de semillas de Helianthus annuus L., B) altura de la planta, C) biomasa seca total y D) longitud radical obtenidos en suelo agrícola contaminado con gasolina en condiciones de invernadero, durante 20 días. Barras con letras diferentes indican diferencias estadísticas (Diferencia mínima significativa, α ≤ 0.05). Medias ± error estándar (n = 5).
La aplicación de la gasolina en concentraciones de 200 y 400 mg/kg no alteró significativamente la altura de las plantas con respecto al tratamiento testigo; en contraste, las concentraciones de 2400 y 3200 mg/kg inhibieron significativamente la altura; por otro lado, las concentraciones de 800 y 1600 mg/kg incrementaron esta variable (Fig. 1B). Este incremento en la altura de las plantas podría deberse a un efecto de hormesis ejercido por la gasolina sobre las plantas. La hormesis se caracteriza por provocar una aparente estimulación de los procesos fisiológicos al exponer a los organismos a bajos niveles de agentes tóxicos, pero que a niveles altos, inhibe dichos procesos(Chan-Quijano et al. 2020). El efecto de hormesis se ha observado en otras plantas [Haematoxylum campechianum L. y Tabebuia rosea (Bertol.) DC] expuestas a petróleo crudo (Chan-Quijano et al. 2020). Un efecto similar se registró en la biomasa de las plantas expuestas a las menores concentraciones de la gasolina (Fig. 1C). Por otro lado, la longitud radical del tratamiento testigo fue significativamente mayor con respecto a la registrada en el tratamiento con 3200 mg/kg (Fig. 1D). De manera similar a nuestros resultados, el crecimiento de plantas de L. sativa, K. scoporia L. y Z. mays L. fue menor ante la presencia de hidrocarburos aplicados en un rango de 50 a 10 000 ppm (Daryabeigi y Hoveidi 2018, Pernía et al. 2018). Lo mismo sucedió en plantas de Helianthus annuus L. expuestas a un suelo contaminado con diferentes concentraciones que van de 226 a 1030 ppm de plomo y zinc e hidrocarburos totales de petróleo e hidrocarburos aromáticos policíclicos en un rango de 2774 a 4824 ppm (Kluk y Steliga 2019). Las altas concentraciones de contaminantes pueden reducir la longitud radical porque son el primer sitio de contacto entre las plantas y los contaminantes (Hawrot-Paw y Bąkowska 2014, Sivaram et al. 2019). La exposición directa de la raíz a los contaminantes puede ocasionar efectos tóxicos que afectan la división celular y la elongación de la zona apical, provocando deficiencia en la absorción de nutrientes y agua y restringiendo su crecimiento y desarrollo (Hawrot-Paw y Bąkowska 2014, Sivaram et al. 2019). A nuestro conocimiento, la mayoría de los estudios sobre el uso de H. annuus L. en la fitorremediación se han realizado para recuperar suelos contaminados con metales pesados solos o en combinación con algunos hidrocarburos, pero no con hidrocarburos solos, por lo que el presente trabajo resalta la capacidad del girasol para tolerar diferentes concentraciones de un derivado del petróleo.
Fase 2. Bacterias nativas tolerantes a gasolina en suelo contaminado
Durante la Fase 2 del presente trabajo se aislaron 10 cepas bacterianas rizosféricas tolerantes a la gasolina; ocho cepas mostraron la capacidad de producir índoles totales (AIA), tres no fueron capaces de fijar nitrógeno, sólo tres cepas dieron positivo a la producción de sideróforos y tres solubilizaron fosfato de calcio (Cuadro II). Siete de las 10 cepas se lograron identificar hasta género y especie, con más de un 99.8 % de similitud, y tres cepas sólo se identificaron hasta género con más del 99.7 % de similitud (Cuadro III). Sobresalen las bacterias de los géneros Pseudomonas, Bacillus y Streptomyces con respecto a los géneros Priestia, Massilia y Sphingobium (Cuadro III).
CUADRO II CARACTERIZACIÓN MACRO Y MICROSCÓPICA DE 10 CEPAS BACTERIANAS AISLADAS DE SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO (SC) ARTIFICIALMENTE CON GASOLINA (FASE 2).
| Caracterización macroscópica | Caracterización microscópica | Pruebas bioquímicas | ||||||||||
| Clave | Forma | Elevación | Color | Textura | Borde | Halo | Morfología | Tinción gram | AIA | Sideróforos | Nfb | Solubilizadores de P |
| SC1 | Circular | Plana | Transparente | Viscosa | Ondulado | + | Bacilo | - | + | - | + | - |
| SC2 | Circular | Cóncava | Blanco | Viscosa | Entero | - | Bacilo | - | + | - | + | - |
| SC3 | Circular | Plana | Amarillo | Viscosa | Entero | - | Coco | - | - | - | + | - |
| SC4 | Circular | Plana | Blanco | Viscosa | Entero | - | Bacilo | - | + | - | - | - |
| SC6 | Circular | Algodonosa | Blanco | Algodonosa | Entero | - | Filamentosa | - | + | - | - | + |
| SC7 | Irregular | Cóncava | Blanco | Viscosa | Ondulado | - | Bacilo | - | - | + | + | + |
| SC8 | Circular | Plana | Rojo | Viscosa | Ondulado | - | Coco | + | + | + | + | + |
| SC11 | Circular | Cóncava | Blanco | Viscosa | Entero | - | Bacilo | - | + | - | + | - |
| SC12 | Circular | Plana | Blanco | Viscosa | Entero | + | Bacilo | - | + | - | - | - |
| SC15 | Circular | Cóncavo | Blanco | Cremosa | Entero | - | Bacilo | - | + | + | + | - |
IAI= Acido indolacético. NFb = medio semisólido de malato libre de nitrógeno. P = fósforo. (+) = actividad positiva, (-) = actividad negativa.
CUADRO III IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS CEPAS AISLADAS DE UN SUELO AGRÍCOLA CONTAMINADO (SC) ARTIFICIALMENTE CON GASOLINA.
| Clave de las cepas bacterianas | Concentración de gasolina de donde se aisló (mg/kg) | Especies y géneros bacterianos | Número de acceso GenBank | Porcentaje de similitud (%) |
| SC1 | 2400 | Bacillus sp. | OQ559532 | 99.7 |
| SC2 | 200 | Priestia megaterium | OQ559533 | 100 |
| SC3 | 200 | Massilia timonae | OQ559534 | 99.9 |
| SC4 | 3200 | Bacillus sp. | OQ559535 | 99.9 |
| SC6 | 200 | Streptomyces flavotricini | OQ569160 | 100 |
| SC7 | 0 | Pseudomonas palleroniana | OQ559536 | 99.9 |
| SC8 | 0 | Streptomyces flavotricini | 100 | |
| SC11 | 3200 | Sphingobium yanoikuyae | OQ559476 | 99.9 |
| SC12 | 2400 | Bacillus sp. | OQ559537 | 99.8 |
| SC15 | 3200 | Pseudomonas palleroniana | OQ559538 | 99.9 |
Las especies identificadas han sido reportadas en la biorremediación de suelos contaminados con petróleo o sus derivados (Alegbeleye et al. 2017, Kuri y Shikha 2019, Mitra et al. 2020, Romano-Armada et al. 2020, Alotaibi et al. 2022, Liu et al. 2022). Además, se han registrado con una o más de las actividades que promueven el crecimiento vegetal, como fijación de nitrógeno atmosférico, solubilización de fosfatos y potasio, producción de ácido indolacético, entre otras (Romano-Armada et al. 2020, Alotaibi et al. 2022). Por lo anterior, estos aislados bacterianos se utilizaron para el bioensayo de fitorremediación (Fase 3) del presente trabajo.
Fase 3. Fitorremediación asistida por bacterias rizosféricas nativas
El desarrollo de las plantas es uno de los factores a considerar en su selección para propósitos de fitorremediación (Gkorezis et al. 2016, Daryabeigi y Hoveidi 2018). En el presente trabajo, las plantas expuestas al suelo contaminado (1600 y 3200 mg/kg) tuvieron menores longitud radical (Fig. 2A), número de hojas (Fig. 2B), altura (Fig. 2C), área foliar (AF) (Fig. 2D) y menor relación raíz/parte aérea (Fig. 2E), en comparación con el testigo sin inoculación bacteriana; en contraste, el área foliar específica no mostró diferencias significativas por efecto de la gasolina (Fig. 2F), independientemente de la inoculación bacteriana. La gasolina en el suelo disminuyó la biomasa seca aérea (Fig. 3A), radical (Fig. 3B) y total (Fig. 3C).
Fig. 2 Desarrollo de plantas de Helianthus annuus L. creciendo en un suelo contaminado artificialmente con 0, 1600 y 3200 mg de gasolina/kg de suelo, después de 60 días. A) longitud radical (cm), B) número de hojas C) altura (cm), D) área foliar E) relación raíz/parte aérea y F) área foliar específica (cm2/g). Barras con letras diferentes indican diferencias estadísticas (diferencia mínima significativa, α ≤ 0.05). Media ± error estándar, n = 9.
Fig. 3 Desarrollo de plantas de Helianthus annuus L. creciendo en suelo contaminado artificialmente con 0, 1600 y 3200 mg de gasolina/kg de suelo, después de 60 días. A) Biomasa seca aérea (g), B) biomasa seca radical (g), C) biomasa seca total (g). Barras con letras diferentes indican diferencias estadísticas (diferencia mínima significativa, α ≤ 0.05). Media ± error estándar, n = 9.
Similar a nuestros resultados, Daryabeigi y Hoveidi (2018)) observaron disminución en la longitud y biomasa de plantas de K. scoporia L. y Z. mays L. expuestas a concentraciones de gasolina (1000 a 10 000 mg/kg). Los efectos de la gasolina sobre la biomasa vegetal se pueden deber a que generalmente este contaminante contiene altos niveles de compuestos volátiles de bajo peso molecular que pueden difundirse a través de las membranas y causar daño celular, lo que disminuye el desarrollo de las plantas (Gkorezis et al. 2016, Daryabeigi y Hoveidi 2018). Además de estos daños, los contaminantes orgánicos pueden modificar las asociaciones benéficas entre plantas y microorganismos debido a que modifican su biodiversidad y su capacidad de colonizar las raíces (Lenoir et al. 2016).
En el presente trabajo se encontraron diferencias significativas en el porcentaje de gasolina disponible en el suelo en donde la inoculación del consorcio bacteriano redujo la gasolina remanente en el suelo, sobre todo en la concentración de gasolina más alta (3200 mg/kg) con respecto a la gasolina del suelo testigo (contaminación al tiempo inicial) (Fig. 4A). La presencia de girasol fue esencial para remover mayor cantidad de gasolina en el suelo (Fig. 4B). Las raíces modifican las características físicas y químicas del suelo y pueden disipar y modificar la biodisponibilidad de contaminantes orgánicos, lo que conlleva a la selección de comunidades microbianas rizosféricas capaces de tolerar o degradar hidrocarburos (Gutiérrez-Espinoza et al. 2011, Gkorezis et al. 2016, Adejube et al. 2017, Daryabeigi y Hoveidi 2018, Zehra et al. 2019). Nuestros resultados muestran que el consorcio bacteriano nativo tolerante a la gasolina puede remover dicho hidrocarburo hasta ~50 %, especialmente en la concentración más alta (Fig. 4B). Se demuestra que los microorganismos nativos cumplen un papel importante en la degradación de contaminantes orgánicos y son base importante para eliminar hidrocarburos de petróleo del ecosistema (Guarino et al. 2017).
Fig. 4 Efecto de Helianthus annuus L. sin bacterias (barras blancas) y con bacterias (barras negras) sobre: A) contenido de gasolina disponible y B) porcentaje de gasolina removida en un suelo contaminado con 1600 y 3200 mg/kg, después de 60 días. Barras con letras diferentes indican diferencias estadísticas (diferencia mínima significativa, α ≤ 0.05). Media ± error estándar, n =3.
CONCLUSIONES
Las semillas de girasol mostraron capacidad de germinar en todas las concentraciones de gasolina en el suelo. Sin embargo, las variables de crecimiento de las plántulas de girasol fueron afectadas ante concentraciones de gasolina de 2400 y 3200 mg/kg.
Las 10 cepas bacterianas nativas seleccionadas mostraron actividades fisiológicas relacionadas con la promoción del crecimiento vegetal; además, toleraron hasta 3200 mg/kg de gasolina en el suelo. Los géneros bacterianos identificados fueron Bacillus, Streptomyces y Pseudomonas, así como Priestia, Massilia y Sphingobium.
La inoculación del consorcio bacteriano en las plantas de girasol favoreció la remoción de la gasolina en el suelo. Por lo anterior, el girasol inoculado con bacterias nativas tolerantes a gasolina puede ser una alternativa efectiva para reducir la contaminación en un suelo contaminado con este compuesto.
