Extracción de fitoquímicos

0.5 g de harina se mezclaron con 10 ml de metanol al 80%; esta suspensión se agitó en un rotador (OVAN noria R, EUA, 2010) por 10 min y fue centrifugada a 3000 x g/10 °C/10 min. El sobrenadante se concentró a 35 °C (Speed Vac Concentrator, Thermo Electron Corporation) hasta alcanzar un volumen final de 2 ml (^{Adom & Liu, 2002}).

Flavonoides

En una placa de 96 celdas se agregaron 20 µl del extracto de fitoquímicos. Los extractos se mezclaron con 80 µl de agua destilada y 6 µl de NaNO₂ al 5%, y se reposó por 5 min. Posteriormente, fueron adicionados 12 μl de AlCl₃ al 10%, 10 μl de NaOH 1 M y 20 µl de agua destilada. La absorbancia fue determinada a 510 nm (Synergy HT, Biotek Instrument), después de 30 minutos. Se preparó una curva de calibración (R² = 0.975) utilizando catequina (25 ppm-300 ppm), y el contenido de flavonoides fue expresado como mg equivalentes de catequina (mg EC)/100 g. Las determinaciones se realizaron por triplicado (^{Adom & Liu, 2002}).

Taninos condensados

Se mezcló 1 g de harina con 10 ml de acetona al 80%, posteriormente, se tomó una alícuota de 20 μl del extracto y la misma cantidad de una curva estándar de catequina; se mezclaron con 1200 μl de vainillina al 4% en metanol y 600 μl de HCL concentrado. Se dejaron en reposo durante 15 min. Se midió la absorbancia a 500 nm (Synergy HT, Biotek Instrument). Los resultados se calcularon y expresaron como mg equivalentes de catequina (mg EC)/100 g, empleando una curva de calibración (R² = 0.995) de catequina 50 μg/ml a 1000 μg/ml. Las determinaciones se realizaron por triplicado (^{Xu & Chang, 2007}).

Cumarinas

Se mezcló 24 mg de la harina de pingüica con 50 ml de una solución metanol/agua (80:20). Una segunda dilución se realizó tomando una alícuota de 8 ml de la solución stock en 25 ml de la solución metanol/agua (80:20), obteniendo una concentración final teórica de 153.6 μg/ml. Las lecturas se realizaron en un espectrofotómetro (Synergy HT, Biotek Instrument) a una longitud de onda de 275 nm. Se preparó una curva de calibración (R² = 0.996) tomando como estándar de cumarina la 2H-1-benzopirano-2-ona de Fluka (Sigma-Aldrich), y los resultados fueron expresados como mg equivalentes de cumarina (ECU)/100 g. Las mediciones se realizaron por triplicado (^{Soares et al., 2012}).

Compuestos fenólicos

En una placa de 96 celdas se agregaron 20 µl del extracto de fitoquímicos y se mezclaron con 180 µl del reactivo de Folin Ciocalteu, la reacción se neutralizó con 50 µl Na₂CO₃ al 7% y se reposó por 90 min. La absorbancia fue registrada a 750 nm (Synergy HT, Biotek Instrument), y se preparó una curva de calibración (R² = 0.994) utilizando ácido gálico como estándar. El contenido de fenólicos totales fue expresado como mg equivalentes de ácido gálico (mg EAG)/100 g. Las determinaciones se realizaron por triplicado (^{Singleton et al., 1999}).

Capacidad antioxidante por DPPH

Se preparó una solución 150 mM de DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) en metanol al 80%, se mezcló 20 µl de la curva estándar de trolox y del extracto de fitoquímicos con 200 µl de la solución de DPPH en una placa de 96 celdas. Se incubó por 30 minutos en obscuridad. La absorbancia fue determinada a 540 nm. Se construyó una curva estándar de trolox (0-120 µM), y la actividad antiradical fue expresada como µmol equivalentes de Trolox (ET)/100 g. Las determinaciones se realizaron por triplicado (^{Cardador-Martínez et al., 2002}).

Capacidad antioxidante por ABTS

El radical ABTS•+ (ácido 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfónico) se obtiene tras la reacción de ABTS (7 mM) con persulfato potásico (2.45 mM) mezclados en partes iguales e incubados en oscuridad durante 16 h. Una vez formado el radical, se diluyó en una solución amortiguadora de fosfatos hasta obtener un valor de absorbancia entre 0.70 ± 0.02 a 735 nm. A 1980 µl de la dilución del radical ABTS•+ se le añadieron 20 µl de extracto de fitoquímicos y se incubaron por 15 min en oscuridad para posteriormente medir la absorbancia a 735 nm. Se construyó una curva estándar de trolox (25-125 µM). La actividad antiradical fue expresada como µmol equivalentes de Trolox (ET)/100 g. Las determinaciones se realizaron por triplicado (^{Re et al., 1999}).

Capacidad antioxidante por el método ORAC (capacidad de absorción de radicales de oxígeno)

Los extractos fueron evaluados empleando Trolox como estándar y fluoresceína como prueba. Los radicales peroxilo fueron generados por 2,2-azobis (2-amidinopropano) dihidrocloruro, y la pérdida de fluorescencia fue monitoreada en un Synergy Microplate Reader (SynergyTM HT Multi-Detection, BioTek, Inc., Winooski, VT). La absorbancia de excitación y emisión fueron fijadas a 485 mm y 538 nm, respectivamente. La actividad antioxidante fue expresada como µmol equivalentes de Trolox (ET)/ 100 g. Las determinaciones se realizaron por triplicado (^{Ou et al., 2001}).

Minerales

El contenido de minerales se realizó utilizando el método 955.06 de la Association of Official Analytical Chemists (^{AOAC, 1998}) a partir de muestras calcinadas (450 °C, 6 h) y digeridas con HCl concentrado, utilizando un espectro de absorción atómica (Perkin-Elmer 2380). Los resultados de minerales fueron expresados como partes por millón (ppm). Todos los resultados fueron expresados en base seca (bs). Las determinaciones se realizaron por triplicado.

Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina (ECA)

Se midió la actividad de 0.05 ml de la ECA frente a su sustrato, Hipuril-L-Histidil-L-Leucina (SIGMA) a una concentración (% p/v) de 0.30%. Bajo las mismas condiciones se realizó la medición de la actividad de la ECA adicionando enalaprilo (SIGMA), a una concentración de 0.4 % p/v como control positivo. De la misma manera, se evaluó la propiedad inhibitoria en los extractos de pingüica. La concentración de cada uno fue de 0.2% p/v en un buffer de fosfatos PBS. Se realizó una incubación a 37 °C por 30 min de la enzima con su sustrato y, según era el caso, con los inhibidores. La reacción fue detenida con 0.25 ml de HCl 1 M. Posteriormente, se realizó una extracción del producto de la actividad enzimática (ácido hipúrico) con 1.0 ml de acetato de etilo, seguido de su evaporación. Este producto se solubilizó en 1.5 ml de agua destilada. Se determinó la absorbancia del producto obtenido a una longitud de onda de 228 nm. Todos los análisis se realizaron por triplicado (^{Wang et al., 2003}). La actividad de antihipertensiva se expresó cómo % inhibición de la ECA y se calculó como sigue:

Flavonoides

El contenido de flavonoides obtenido en pingüica fue 52.2 mg EC/100 g (Tabla 2). No existen reportes del contenido de flavonoides en pingüica, pero lo reportado en otras frutas como ciruela, kiwi y manzana es de 118 mg EC/100 g (bs) a 239 mg EC/100 g (bs) (^{Awad et al., 2000}; ^{Kim et al., 2003}; ^{Park et al., 2014}), valores arriba a lo encontrado en nuestro estudio.

Taninos

En el presente estudio el contenido de taninos fue de 278.02 mg EC/100 g (Tabla 2). El contenido de taninos reportado en algunas frutas (durazno, caqui, kiwi, arándanos) es de 240 mg EC/100 g a 597 mg EC/100 g, pero en pingüica no existen reportes sobre su contenido (^{Belhadj et al., 2016}; ^{Del Bubba et al., 2009}; ^{McDougall et al., 2009}; ^{Park et al., 2011}).

Cumarinas

En el presente estudio se encontró un valor de 46 mg ECU/100 g (Tabla 2); no existen reportes del contenido de cumarinas en pingüica. El método usado en la presente investigación es el desarrollado por ^{Soares et al. (2012)}, donde reportaron valores de 4.7 g ECU/100 g a 5.0 g ECU/100 g en harinas de hojas de guaco (Mikania glomerata), una planta trepadora de Brazil, que es empleada en la medicina tradicional para el tratamiento del asma, tos y bronquitis. Esta planta es conocida por sus altos contenidos de cumarinas, por lo que se puede considerar una presencia significativa de este compuesto en nuestra muestra.

Fenólicos totales

El contenido total de fenólicos fue de 323.4 mg EAG/100 g (Tabla 2). No existen reportes acerca del contenido de fenólicos en Arctostaphylos pungens, pero en otras frutas (fresa, mango, ciruela, tuna, pera, zarzamora) el contenido de estos compuestos es de 218 mg EAG/100 (bs) a 440 mg EAG/100 (bs) (^{Arion et al., 2014}; ^{Clerici & Carvalho-Silva, 2011}; ^{Crecente-Campo et al., 2012}; ^{Kim et al., 2010}).

Actividad antioxidante

Los valores de actividad antioxidante de la pingüica se muestran en la Tabla 3. No existen reportes que nos indiquen la actividad antioxidante en la pingüica, pero los datos reportados en otras frutas por el método DPPH varían de 2010 µmol ET/100 g a 3200 µmol ET/100 g (ciruela, guayaba, durazno), por ABTS varían de 2230 µmol ET/100 g a 7500 µmol ET/100 g (ciruela, guayaba, durazno) y por ORAC varían de 1002 µmol ET/100 g a 9584 µmol ET/100 g (ciruela negra, durazno, uva, arándano azul, manzana, mango, pera, fresa,) (^{Arion et al., 2014}; ^{Floegel et al., 2011}; ^{Kristl et al., 2011}; ^{Mokrani & Madani, 2016}; ^{Thaipong et al., 2006}). Y los valores obtenidos en Arctostaphylos pungens por DPPH, ABTS y ORAC fueron 6214 µmol ET/100 g, 8465 µmol ET/100 g y 7141 µmol ET/100 g, respectivamente. Los resultados obtenidos por los tres métodos mostraron que la capacidad antioxidante en pingüica es alta en comparación con los valores reportados en otras frutas por los tres métodos.

Minerales

El contenido de minerales en pingüica es mostrado en la Tabla 4. El calcio es esencial para la estructura y funcionamiento de huesos y dientes; el requerimiento diario en adultos es de 800 mg/día a 1200 mg/día, (^{Shin & Kim, 2015}). En este estudio se obtuvo un valor de 1345 mg/100 g. El hierro es un mineral esencial, su consumo diario requerido para adultos es de 10 mg/día a 15 mg/día (^{Leterme et al., 2006}), su contenido en pingüica fue de 169.5 mg/100 g. El Mg fue el tercer mineral detectado en mayor cantidad con 10.7 mg/100 g, los requerimientos diarios de este mineral en adultos es de 300 mg/día a 400 mg/día (^{Berto et al., 2015}). El cuerpo humano contiene entre 2 g a 3 g de Zn, y el 0.1% de este tiene que ser repuesto diariamente. El consumo diario requerido de Zn es de 12 mg/día a 15 mg/día (^{Mareta & Sandstead, 2006}), y lo detectado en pingüica fue de 4.2 mg/100 g. La dosis diaria requerida para Mn es de 1.8 mg/día a 2.3 mg/día, y lo obtenido en pingüica fue de 0.725 mg/100 g (^{Berto et al., 2015}). El contenido de minerales en frutas varía de acuerdo con la planta, su madurez, condiciones del suelo, clima y prácticas agrícolas (^{Mirdehghan & Rahemi, 2007}).

Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina

El extracto metanólico de pingüica logró una inhibición de la ECA del 50%. No existen estudios científicos que señalen el efecto de la pingüica sobre la ECA; no obstante, sí existen reportes con otras frutas con sus respectivos valores inhibidores, como lo son plátano, granada, litchi (50%) y fresa (38%). Además, se ha reportado que la cáscara y semillas de la uva han alcanzado porcentajes de inhibición de hasta un 80% (^{Cheplick et al., 2010}; ^{Fernandez & Labra, 2013}; ^{Kessy et al., 2018}), mientras que el control positivo enalaprilo presentó una inhibición de la enzima del 98% ± 1%.

Flavonoides

Actualmente, existe un creciente interés en los flavonoides, debido a la posibilidad de mejorar la salud pública a través de la dieta promovida por el consumo de frutas, donde este fitoquímico se encuentra en cantidades considerables (^{Ignat et al., 2011}). Las frutas son una buena fuente de flavonoides, aunque no existen reportes del contenido total de estos fitoquímicos en pingüica. La presencia de flavonoles como quercetina, miricetina y kaempferol con sus glucósidos y la catequina han sido reportados previamente en Arctostaphylos pungens y Arctostaphylos uva-ursi (^{Panusa et al., 2015}). Con la excepción de los flavan-3-oles (catequinas), los flavonoides se acumulan principalmente en forma de glucósidos y están a menudo concentrados en las células epidérmicas superiores de las cáscaras de las frutas. La determinación de flavonoides presentes en frutas es un tema que está estrechamente relacionado con los beneficios a la salud de los alimentos de origen vegetal. La investigación sobre la cuantificación de los flavonoides en frutas, como la pingüica, es necesaria para revelar la biodisponibilidad y bioaccesibilidad de estos compuestos en la dieta humana, aunque el contenido de flavonoides en pingüica resultó menor. Comparado con otros frutos, la capacidad antioxidante fue superior a otros frutos, por lo que la actividad antioxidante en pingüica está relacionada con otros fitoquímicos y no con los flavonoides.

Taninos

El contenido de taninos en frutas ha sido por mucho tiempo de interés en alimentos debido a su importancia en la calidad de las frutas y sus productos, los taninos están asociados con el color, astringencia y amargor en las frutas (^{Landete, 2012}). Por otra parte, varias investigaciones han revelado el efecto anticarcinogénico, actividad antiinflamatoria, antimutagénica, antimicrobiana y antioxidante de los taninos (^{Borges-Argáez et al., 2007}; ^{Prior & Gu, 2005}). Los taninos contienen al acido tánico como unidad estructural, tienen un peso molecular relativamente alto y son divididos usualmente en dos grupos: hidrolisables (galotaninos y elagitaninos) y condensados, también conocidos como proantocianidinas (^{Hagerman & Butler, 1991}). Estas diferencias en la estructura química hacen que las investigaciones sean dirigidas hacia sus propiedades biológicas o su relación en su actividad-estructura. Los taninos condensados se acumulan en la vacuola, a menudo se encuentran en las capas epidérmicas y subepidérmicas de las frutas (^{Kao et al., 2002}). En cambio, los taninos hidrolizables son conocidos por encontrarse en la pared celular (^{Grundhöfer et al., 2001}). Los taninos condensados son más estables y no son fácilmente desdoblados. La presencia de galotaninos ha sido previamente reportada (monogaloilglucosa, digaloilglucosa, trigaloilglucosa, tetragaloilglucosa y pentagaloilglucosa) en Arctostaphylos pungens y Arctostaphylos uva-ursi (^{Olennikov & Chekhirova, 2013}; ^{Panusa et al., 2015}), además de la presencia de elagitaninos. El contenido de taninos condensados en frutas es afectado principalmente por las condiciones ambientales de las áreas de cultivo y el grado de maduración de las frutas, y puede estar influenciado por el almacenamiento y las condiciones de proceso (^{Serrano et al., 2009}). El efecto antioxidante de estos compuestos es atribuido principalmente a su modo de acción en neutralizar radicales libres, quelación de metales de transición, inhibición de enzima prooxidantes y peroxidación lipídica (^{Koleckar et al., 2008}).

Cumarinas

Existen pocos reportes sobre el contenido de cumarinas en frutas, pero se han reportado hasta 15 diferentes tipos de cumarinas en frutos como el membrillo de bengala (Aegle marmelos). También se ha reportado su presencia en pomelo (Citrus maxim), un fruto cítrico, así como en los frutos de plantas como la Cullen corylifolium y la Angelica officinalis L., siendo cuatro las principales cumarinas identificadas por HPLC: imperatorina, isoimperatorina, xantotoxina y bergapteno (^{Sezer et al., 2011}; ^{Zhang et al., 2018}). Las cumarinas son una de las 8000 estructuras de compuestos fenólicos o polifenoles reportadas que están presentes en los vegetales. Las cumarinas están ampliamente distribuidas en diferentes partes anatómicas de las plantas, son conocidas por su agradable olor a vainilla y se encuentran en altas concentraciones en frutas como el membrillo de Bengala (Aegle marmeleos), así como en semillas, raíces, cortezas y hojas (^{Borges et al., 2013}). Su estructura básica consta de un anillo bencénico, unido a un anillo α-pirona con un átomo de oxígeno en la posición α, y un grupo cetona en el carbono 2 (C2); además, son derivados del ácido cinámico. A este esqueleto básico se le pueden adicionar diferentes residuos, formando así la familia de las cumarinas. Adicionalmente, de acuerdo con estas distintas estructuras, pueden tener diferentes actividades bioactivas, como antibacterianas, antioxidante, antiinflamatorias, anticoagulantes y sobre todo anticarcinogénica (^{Kubrak et al., 2017}; ^{Zhang et al., 2014}).

Compuestos fenólicos

La distribución y el contenido de los compuestos fenólicos en frutas son de interés debido a sus beneficios a la salud. Estos beneficios están asociados con sus propiedades antioxidantes, no obstante, hoy en día más evidencia señala su efecto como moléculas involucradas en numerosas vías de señalización y, de esta forma, afectar funciones celulares y en la expresión de genes, además de su efecto directo en el sistema digestivo (^{Battino et al., 2009}). La distribución y composición de los compuestos fenólicos en frutas son afectados por la madurez, tipo de cultivar, prácticas horticulturales, origen geográfico, estación de crecimiento, condiciones de almacenamiento en poscosecha y condiciones de procesamiento (^{Kim et al., 2003}). Los compuestos fenólicos más comunes en frutas son antocianinas, glucósidos de flavonoles, proantocianidinas y ácidos hidroxicinámicos (^{Määttä-Riihinen et al., 2004}).

Actividad antioxidante

Los compuestos antioxidantes son capaces de neutralizar radicales libres y de esta forma reducir el riesgo de enfermedades crónicas. Hoy en día, la actividad antioxidante en las frutas ha sido tomada como un indicador de sus efectos benéficos para la salud humana (^{Prior & Wu, 2013}). La especificidad y sensibilidad de un solo método no indica la completa exanimación de los fitoquímicos en el extracto; de esta forma, la combinación de varios métodos puede proveer una evaluación más confiable del perfil de antioxidantes en pingüica. Tres ensayos fueron empleados para evaluar la capacidad antioxidante, cada ensayo tiene su propia ventaja y limitación, cada método emplea un radical libre diferente para determinar la capacidad antioxidante; de esta forma, los datos obtenidos por los tres métodos aumentan la confianza del potencial antioxidante de la pingüica, al poder neutralizar una mayor cantidad de radicales libres.

Minerales

Las frutas y hortalizas son fuentes valiosas de minerales, estos micronutrientes intervienen en numerosos procesos bioquímicos, y una ingesta adecuada de determinados minerales se relaciona con la prevención de diversas enfermedades. Aunque las principales fuentes de calcio en la dieta humana son los productos lácteos, su contenido en frutas como en lo detectado en pingüica no debe ser subestimado (^{Shin & Kim, 2015}). El hierro está contenido en la hemoglobina en los glóbulos rojos de la sangre, la cual transporta el oxígeno de los pulmones hacia los tejidos del cuerpo, incluyendo los músculos y el cerebro (^{Konczak & Roulle, 2011}). El Mg es un constituyente de los huesos y dientes, contribuye a la liberación de la hormona paratiroidea y la reacción de conversión de la vitamina D a su forma activa, además de la respiración en tejidos y la relajación de los músculos (^{Berto et al., 2015}; ^{Elinge et al., 2012}). Deficiencia de Zn es común cuando alguien presenta síntomas de malnutrición y afecta al sistema inmune, en los sentidos del olfato y gusto, así como en la síntesis del DNA y RNA (^{Elinge et al., 2012}: ^{Fraga, 2005}). El Mn es un elemento tóxico a altas concentraciones, y en bajas dosis, es un elemento esencial. El Mn es un cofactor crucial para varias enzimas, incluyendo la enzima antioxidante, Mn superóxido dismutasa (MnSOD), así como piruvato carboxilasa, transferasas, hidrolasas y quinasas. El Mn también es importante en la sanación de heridas, digestión, reproducción y en la regulación de la energía celular (^{Freeland-Graves et al., 2015}).

Actividad inhibitoria de la enzima convertidora de angiotensina

Diferentes tipos de compuestos contenidos en alimentos han sido investigados sobre sus propiedades inhibitorias de la ECA. Estos derivados pueden ser divididos dentro de tres categorías, péptidos de origen animal, vegetal y de microorganismos (^{Herrera et al., 2014}; ^{Wilson et al., 2011}). Actualmente, diversos medicamentos son empleados para el control de la hipertensión arterial, estos pertenecen al grupo de inhibidores de la ECA. Ejemplos de ellos son el captopril, enalapril, lisinopril y termocapril. Estos medicamentos generalmente actúan ligando el zinc, cofactor de la ECA, a un grupo sulfhidrilo, lo que permite bloquear eficazmente los lugares activos de la enzima e inhibir así su actividad biológica. No obstante, pueden producir efectos adversos tales como erupciones o sarpullidos en la piel, trastornos alimenticios, tos, entre otros (^{Laurent, 2017}). Terpenoides y compuestos fenólicos, incluyendo a los flavonoides, taninos, así como algunos derivados del ácido cafeíco, son algunos metabolitos secundarios producidos en frutas que han sido identificados como potenciales inhibidores de la ECA, con la ventaja de no presentar efectos secundarios (^{Ojeda et al., 2010}).