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Introducción
En el mundo se han descrito cerca de 280 especies de Lupinus (Eastwood et al., 2008), siendo México unos de los centros secundarios de diversificación. En nuestro país se han reportado entre 65 y 110 especies del género Lupinus, que representan entre el 23 al 40% de las especies a nivel mundial (Bermúdez Torres et al., 1999; Sousa & Delgado, 1998). Las especies de ese género han sido utilizadas desde los tiempos de los romanos, griegos e incas como fuente de proteína vegetal (Clements et al., 2005; Domínguez et al., 2023; Gladstones, 1998). Las especies del género Lupinus sintetizan alcaloides quinolizidínicos (AQ) como estrategia de defensa contra herbívoros (Wink, 1993; Wink et al., 1995). Estos compuestos tienen una gran diversidad de actividades biológicas que les confieren potencial en la industria de los agroquímicos como fuente de bioinsecticidas (Ruiz-López et al., 2010; Wink et al., 1995), en la industria química como fuente de catalizadores quirales (Regla et al., 2019) y en la industria farmacéutica como moduladores de la secreción de insulina (García López et al., 2004), entre otros. Nuestro grupo de investigación ha evidenciado que los extractos de AQ de L. bilineatus presentan actividad larvicida y larvistática sobre larvas de Aedes aegypti, vector del dengue y Spodoptera frugiperda, gusano cogollero del maíz (Bermúdez-Torres et al., 2009, 2017; Michi Flores, 2016; Reyes Izquierdo, 2013). Para el abasto de estos compuestos se requieren grandes cantidades de materia prima; sin embargo, ambas especies son silvestres, lo que limita la obtención de este material. Una alternativa interesante es el cultivo in vitro, que permite la propagación y crecimiento de las especies de interés en condiciones controladas y la producción inducida de los AQ. Al respecto, Montes-Hernández (2010) reporta la inducción de callo y suspensiones de L. aschenbornii, indicando que bajo estas condiciones es posible obtener AQ; sin embargo, la producción de AQ es dos a tres órdenes menores a lo reportado para la planta, por lo que será necesario incluir a futuro procedimientos de elicitación para incrementar la producción de estos compuestos. Con base en el potencial de las especies mexicanas de Lupinus como fuentes de moléculas de interés y la necesidad de obtener suficiente materia prima, este trabajo tuvo como objetivo establecer las condiciones de germinación, inducción de callo y producción de alcaloides en dos especies de Lupinus, L. montanus y L. bilineatus en condiciones in vitro.
Materiales y métodos
Material vegetal. Se utilizaron semillas de L. bilineatus y L. montanus que fueron recolectadas en el Parque Nacional Iztaccíhuatl-Popocatépetl, Estado de México, México y almacenadas a 4°C y 8-12% de humedad relativa. Los datos de colecta de las semillas de las dos especies se muestran en la Tabla 1. Las semillas fueron desinfectadas y escarificadas de acuerdo con el protocolo reportado por Ramírez-Betancourt (2019).
Tabla 1 Datos geográficos de la colecta de las especies de Lupinus.Table 1. Geographical Data of the Collection of Lupinus Species.
| Especie | Código de población |
Altitud (m s.n.m) |
Longitud | Latitud | Fecha de colecta |
|---|---|---|---|---|---|
|
L. bilineatus (No. de Voucher: MEXU 1297305) |
LIP2camp | 2937 | N19°04’30.2” | W98°42’02.2”, | Agosto del 2018 |
|
L. montanus (No. de Voucher: MEXU 1297279) |
LIP2mon | 3889 | N19o08’26.8” | W98o38ʼ59.8” | Septiembre del 2016 |
Germinación. Se sembraron 50 semillas de cada una de las especies de Lupinus en medio de cultivo Murashige y Skoog (MS) al 100% (Murashige y Skoog, 1962; Sigma-Aldrich) a razón de 4.4 g L-1, suplementado con 30 g L-1 de sacarosa y 2.2 g L-1 de fitagel y ajustado a un pH de 5.8. Se sembraron cinco semillas por frasco y se cultivaron en un cuarto de cultivo a 25 °C de temperatura, un fotoperiodo de 16 h luz y 8 h obscuridad y una humedad relativa del 90%. Las semillas se observaron durante 12 días, se evaluaron las siguientes variables: emergencia y tamaño de radícula, documentadas mediante fotografías.
Inducción de callo de L. montanus y L. bilineatus . Para la inducción de callo se sembraron explantes de raíz, hipocótilo y cotiledón de aproximadamente 1cm de longitud en medio semisólido MS, suplementado con sacarosa (30 g L-1), fitagel (2.2 g L-1), adicionado con combinaciones de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 0.5, 1 y 2 mg L-1) y cinetina (CIN, 0.0, 0.5 y 1 mg L-1). El pH de los medios se ajustó a 5.8. La raíz y el hipocótilo fueron sembrados colocándolos sobre el medio de manera horizontal y para el caso de los cotiledones fueron sembrados con el haz hacia arriba, se colocaron cuatro explantes por frasco, de un total de 8 frascos. Las variables que se evaluaron fueron hinchamiento y formación de callo.
Crecimiento in vitro de células desdiferenciadas de L. montanus y L. bilineatus . Para realizar la cinética de crecimiento, se sembraron 0.25 g de biomasa obtenida de callos sembrados en medio semisólido MS, suplementado con sacarosa (30 g L-1) y fitagel (2.2 g L-1). Los medios de cultivo se ajustaron a un pH de 5.8 y se adicionó la combinación de reguladores que dio la mejor respuesta a la formación de callo para cada especie. Se cosecharon cuatro frascos en los días 0, 3, 7, 11 17 y 21 y se determinaron la biomasa fresca (BF) y biomasa seca (BS). Para la determinación de BF, las muestras fueron filtradas en una malla de 60 micras y se pesaron en una balanza analítica. Para determinar la BS las muestras fueron secadas en un horno a 40 °C por 48 h hasta peso constante y se pesaron en una balanza analítica. Se calculó la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación de acuerdo con las siguientes fórmulas:
Velocidad específica de crecimiento
Tiempo de duplicación
Donde:
Xf= Biomasa final
Xo= Biomasa inicial
tf= Tiempo final
to= Tiempo inicial
Determinación de AQ. Los AQ fueron extraídos utilizando el protocolo reportado por Ramírez-Betancourt et al. (2021) y determinados por cromatografía de capa fina, utilizando como fase móvil ciclohexano (C6H12) y dietilamina (C4H11N), las placas fueron documentadas con el equipo Visualizer (CAMAG, Suiza) y el protocolo reportado por Ramírez-Betancourt (2019). Las muestras analizadas se colectaron a los 0, 3, 7, 11 17, y 21 días, correspondientes a la cinética de crecimiento y producción, para el análisis de los AQ las muestras cuatro muestras se unificaron.
Resultados
Germinación de las especies de Lupinus
Los resultados muestran que al cuarto día el porcentaje de semillas germinadas fue igual o superior al 70% para ambas especies, 78 y 70% L. bilineatus y L. montanus, respectivamente, mientras que a partir del día siete el proceso de germinación en el caso de L. montanus se estancó en 74%, la germinación de las semillas de L. bilineatus continuó incrementando paulatinamente de 78% al 4to día, a 80% en el 5to, 88% al 6to, 92% al 7mo, llegando a 100% en el 12vo día (Figura 1). Tomando en cuenta los reportes sobre germinación de semillas, los resultados sugieren que las condiciones para la germinación de las semillas que se utilizaron para ambas especies de Lupinus fueron las adecuadas, ya que ambas tuvieron porcentajes mayores al 70% (Wolny et al., 2018) y fueron mayores a lo reportado por Pablo Pérez et al., (2013) para L. montanus (48%).
Durante el proceso de germinación se realizaron observaciones del desarrollo en ambas especies, desde el inicio hasta el día 12 (Figura 2 y Figura 3). En el caso de L. bilineatus, las semillas presentaron una coloración entre amarilla y café con motes obscuros, de acuerdo con lo ya reportado por Ramírez-Betancourt (2019). A partir del día uno (Figura 2B) se observó el rompimiento de la testa, dando inicio al crecimiento radicular (flecha roja) con una coloración amarilla y una longitud aproximada de 0.4 mm. Lo anterior corresponde a lo reportado por Wolny et al. (2018), quien define que la germinación de una semilla inicia con la absorción de agua y finaliza cuando la radícula sobresale de la estructura que la cubre, en este caso la testa, así como la emergencia del eje embrionario o radícula (Bewley, 1997). Wolny et al. (2018) reportan que durante el proceso de germinación hay tres fases, en la fase I hay una relación muy estricta con la tasa de absorción de agua (imbibición de agua por la semilla seca), hasta llegar a una completa hidratación de la semilla. Posteriormente, en la fase II hay una completa hidratación de la semilla, por lo tanto, ya no hay un requerimiento de agua. Finalmente, se tiene la fase III donde hay un aumento en la absorción del agua y está relacionada con la terminación de la germinación. Lo anterior, correlaciona con lo observado en este trabajo, ya que inicialmente las semillas de ambas especies vegetales mostraron un proceso de hinchamiento referido a la absorción de agua y posteriormente, la emergencia de la radícula, in stricto sensu, momento de la germinación. Posteriormente, en el día cuatro se observó un incrementó en el crecimiento radicular hasta 5 veces más (llegando a aproximadamente 4.5 cm), adoptando una forma curva (flecha roja) y cambiando a un color crema (Figura 2C). En el día seis la raíz se sumergió en el medio de cultivo y se observó la presencia de vellosidades de aproximadamente 0.2 a 0.5 mm de longitud (flecha negra), además de que se observaron cambios en la coloración de esta, mientras que en la parte superior mostró un tono rosado, en la parte inferior la coloración fue crema (Figura 2D); en esta etapa de crecimiento la raíz presentó una longitud de hasta 7.7 cm. A partir del día siete se observó un crecimiento vertical y la presencia de vellosidades (Figura 2E F G; flecha negra). En el día 12, continuo el crecimiento y desarrollo de las plántulas sin desprendimiento de la testa (Figura 2H I J K) y en algunos casos se llegaron a observar los cotiledones (Figura 2I J), indicados con una flecha roja, de tal forma que, en esta especie vegetal no se observó el desprendimiento de la testa y el desarrollo de las plántulas en su mayoría llegó a una altura de 6.5 cm, al límite superior del frasco Gerber (Figura 2K).
Figura 2 Germinación de semillas de Lupinus bilineatus después de 12 días de incubación a 25 ± 2oC. A) Día 1, B) Día 2, C) Día 4, D) Día 6, EFG) Día 7, HIJK) Día 12.
Figura 3 Germinación de semillas de L. montanus. A) 0 día, B) 2 días, C) 3 días, D) 4 días, E) 5 días, F) 6 días, G) 7 días, H) 8 días, I) 9 días, J) 10 días, K) 11 días, L) 12 días.
Las semillas de L. montanus presentaron una coloración cremosa con pequeños puntos color café (Figura 3A) y un tamaño entre 0.4 y 0.7 mm, las semillas más grandes tardaron hasta dos días en romper la testa; mientras que, en las semillas más pequeñas la radícula se pudo observar a partir del día uno con una longitud de hasta 0.4 cm (Figura 3B). Posteriormente, al día cuatro la radícula llegó a una longitud de hasta 4.5 cm, evidenciando un incremento del 99% respecto al día uno (Figura 3) y se observó como la radícula se sumergió en el medio de cultivo (flecha roja) buscando un soporte más firme. En el día cinco no hubo un crecimiento evidente de la radícula, sin embargo, se observó el crecimiento de pequeños pelos radiculares de aproximadamente 0.5 mm de longitud (flecha negra, Figura 3E), así como el inicio del desprendimiento de la testa (flecha roja). El crecimiento de la radícula continuo durante los días seis, siete y ocho, hasta alcanzar 3.3 cm de longitud (Figura 3F G H). El proceso de desprendimiento de la testa continuo durante los días 9, 10 y 11 (Figura 3I J K) y fue hasta el día 12 cuando la testa se desprendió totalmente, a diferencia de L. bilineatus, que mantuvo la testa. Hasta este día 12 las plántulas alcanzaron una longitud aproximada de 9.5 cm. A partir de las plántulas, se realizó la inducción de tejido desdiferenciado (callos).
Inducción de tejido desdiferenciado a partir de explantes de L. bilineatus y L. montanus
Con respecto a la respuesta a la inducción de callo utilizando las condiciones mencionadas en materiales y métodos, los resultados muestran que, en cuanto a la combinación de reguladores, L. bilineatus presentó mayores porcentajes de inducción de callo con 2,4-D (1mg mL-1) y Cin (1 mg mL-1), mientras que L. montanus con 2,4-D (1mg mL-1) y Cin (0.5 mg mL-1) (Tabla 2).
Tabla 2 Inducción de tejido desdiferenciado en dos especies de Lupinus empleando unaTable 2. Induction of undifferentiated tissue in two Lupinus species using a combination of 2,4-D and Cin.
| Explante | 2,4-D (mg/mL) |
Cin (mg/mL) |
Respuesta a la formación de callo | |
|---|---|---|---|---|
| L. bilineatus | L. montanus | |||
| Raíz | 0.5 | 0.5 | - | - |
| 1 | 0.5 | - | + | |
| 2 | 1 | + | - | |
| Cotiledón | 0.5 | 0.5 | - | - |
| 1 | 0.5 | - | - | |
| 2 | 1 | - | - | |
| Hipocótilo | 0.5 | 0.5 | - | - |
| 1 | 0.5 | - | - | |
| 2 | 1 | - | - | |
La desdiferenciación del tejido inicia con un proceso de hinchamiento, los explantes de raíz de L. bilineatus con una combinación de reguladores de crecimiento 2,4-D (1 mg mL-1) y Cin (1 mg mL-1), mostraron una respuesta del 85% de hinchamiento con respecto a 71 y 33% en relación con lo observado con cotiledón y tallo, respectivamente. Como se puede observar con cotiledón, solo cuatro de 17 explantes que pasaron por un proceso de hinchamiento, dieron respuesta a la formación de callo (Tabla 3). Así mismo, cuando se utilizó como explante hipocótilo, de nueve cortes solo el 44% dio respuesta a la formación de callo, contrariamente a lo observado cuando se utilizó raíz, donde el 75% de los explantes dieron respuesta a la formación de callo. Con respecto a L. montanus (Tabla 4) con una combinación de reguladores de crecimiento de 2,4-D (1 mg mL-1) y Cin (0.5 mg mL-1), se observó una respuesta de hinchamiento de los explantes del 40%, 100% y 40% con raíz, cotiledón e hipocótilo, respectivamente, obteniendo una mayor respuesta respecto a lo observado con L. bilineatus. Así mismo, la mejor respuesta a la formación de callo se dio empleando como explante la raíz (100%). A una semana de haber sembrado los explantes de ambas especies de Lupinus, el explante de raíz de L. bilineatus mostró formación de callo en el tratamiento de 2,4-D de 2 mg L-1 y Cn 1 mg L-1 a partir del día 7, mientras que el explante de raíz de L. montanus mostró formación de callo hasta el día 11 con una concentración de 2,4-D de 1 mg L-1 y Cn 0.5 mg L-1.
Tabla 3 Respuesta de los explantes de Lupinus bilineatus al tratamiento para inducción de callo.Table 3. Response of Lupinus bilineatus explants to callus induction treatment.
| Explante | No. de explantes |
% de cada explante |
No. de explantes hinchados |
% de explantes hinchados |
No. de explantes con callo |
% de explantes con callo |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Cotiledón | 24 | 100 | 17 | 70.8 | 4 | 16.7 |
| Raíz | 28 | 100 | 24 | 85.7 | 21 | 75 |
| Hipocótilo | 27 | 100 | 9 | 33.3 | 4 | 33.3 |
Tabla 4 Respuesta de los explantes de Lupinus montanus tratamiento para inducción de callo.
| Explante | No. de explantes |
% de cada explante |
No. de explantes hinchados |
% de explantes hinchados |
No. de explantes con callo |
% explantes con callo |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Cotiledón | 25 | 100 | 10 | 40 | 4 | 16 |
| Raíz | 25 | 100 | 25 | 100 | 25 | 100 |
| Hipocótilo | 25 | 100 | 10 | 40 | 3 | 12 |
En el caso del explante de hipocótilo se observó la emergencia de pequeñas hojas adventicias a la semana de haber sido sembrados, mientras que los explantes de cotiledones experimentaron una elongación, pero no hubo una buena respuesta a la formación de callo (Figura 4B), lo anterior fue observado con ambas especies de Lupinus, mientras que el explante de raíz presentó a las dos semanas un proceso de hinchamiento y posteriormente al mes se pudo observar la presencia de callo friable de pigmentación verde y beige (Figura 4E y F) para ambas especies, L. bilineatus y L. montanus.
Incremento de la biomasa en callos de L. bilineatus y L. montanus.
El incremento de la biomasa para ambas especies presenta tres fases: la fase lag o de adaptación, que se encuentra desde el día cero al día siete, momento en que inicia la fase exponencial, la cual se alarga hasta el día 21 en ambas especies L. montanus y L. bilineatus, con una velocidad específica de µ= 0.08049 h-1 y 0.0568 h-1 y un tiempo de duplicación (td) de 8.60 h y 12.20 h, respectivamente. Los anteriores resultados nos indican diferencias en los parámetros finales µ y td de ambas especies de Lupinus. Mientras que en las etapas iniciales y hasta el día 14 el comportamiento de ambas especies similar, 0.0612 y 0.0647 g BS para L. montanus y L. bilineatus, respectivamente. Posteriormente, en el día 18, ambas especies alcanzaron su pico máximo de crecimiento: L. montanus con 0.0931 g BS y L. bilineatus con 0.0745 g BS y a partir de este tiempo, ambas iniciaron la fase de muerte.
Figura 5 Crecimiento en base a biomasa seca (BS) de callos de ● L.montanus y▲ L. bilineatus.Figure 5. Growth based on dry biomass (DB) of calli from ● L. montanus and ▲ L. bilineatus.
Producción de alcaloides quinolizidínicos (AQ) en callos
Se determinó la presencia de AQ por cromatografía de capa fina a diferentes tiempos de la cinética de crecimiento de 0, 4, 7, 11, 14, 18 y 21 días (Figura 6). Como se puede observar, en ambas especies durante los primeros días de crecimiento no se detectaron AQ, fue hasta el día 21 que se observó para ambas especies la presencia de AQ.
Discusión
Germinación
Durante el proceso de germinación se pudieron observar diferencias importantes. Con L. montanus a partir del día cuatro se alcanzó un 70% de germinación, llegando hasta un 74% al día siete, mientras que las semillas de L. bilineatus alcanzaron un 100% de germinación al día 12. De acuerdo con lo reportado por Acosta-Percástegui y Rodríguez-Trejo (2005) la temperatura, la luz y la escarificación de las semillas son factores que afectan la germinación. El almacenaje a condiciones de baja temperatura y baja humedad relativa, así como el protocolo de escarificación utilizado (Ramírez Betancourt, 2019) favorecieron la respuesta de germinación de ambas especies, L. montanus y L. bilineatus. Otros autores reportan porcentajes de germinación menores, Mariel (2006) reporta un 56% de germinación de las semillas de L. montanus con escarificación mecánica, mientras que con tratamientos imbibición en agua caliente en semillas de Lupinus diffusus, los autores refieren daño grave de los embriones, ya que no emergió ninguna plántula (Dehgan et al., 2003). En este trabajo es posible que las diferencias en el porcentaje de germinación se deban a la especie, la edad de las semillas, la susceptibilidad a los desinfectantes utilizados en el proceso de desinfectación, etc. Las semillas de ambas especies fueron caracterizadas físicamente, observándose que ambas presentan testas ornamentadas y de coloración café con manchas oscuras. Ambas especies iniciaron el rompimiento de la testa a los dos días, seguida de la emergencia y crecimiento de la radícula hasta el desarrollo de las plántulas. Una diferencia notable entre las especies estudiadas en el presente trabajo es que las plántulas de L. bilineatus aun cuando mostraron la emergencia de los cotiledones no liberaron la testa (Figura 2K), mientras que L. montanus libera la testa en la fase de emergencia de los cotiledones, observándose también la emergencia de pelos radiculares (Figura 3E). Posteriormente, a los 11 días se observó como la testa estuvo a punto de ser liberada, sin embargo, no se desprendió totalmente; este comportamiento también ha sido observado en plántulas de L. bilineatus en condiciones ex vitro (datos no reportados).
Inducción de callo
Para ambas especies, el explante de raíz presentó mayor respuesta a la formación de callo (Figura 4), a diferencia de experiencias anteriores que refieren una mayor inducción de callo para L. aschenbornii utilizando hipocótilo con una combinación similar a la que se utilizó en este trabajo para la inducción de callo de L. montanus (Montes-Hernández, 2010), mientras que Sator (1985), reportó una alta generación de callo utilizando todas las partes de la planta de las especies de L. polyphyllus, L. hartwegii, L. angustifolius y L. luteus cuando se aplican combinaciones de ácido 3-indol-acético (AIA) y 6-bencilaminopurina (BAP) y Ramírez-González (2013) reportó una respuesta del 50% en cuanto a la inducción de callo en la especie de L. montanus (HBK), empleando como explante hipocótilo. A partir de las dos semanas se empezó a observar la presencia de tejido desdiferenciado, similar a lo reportado por Montes-Hernández (2010) quien menciona que a partir de los 15 días observó la iniciación de tejido desdiferenciado y al mes se tenía completamente la formación de callo, lo cual fue similar a lo observado en este trabajo para ambas especies. Los anteriores resultados indican un comportamiento similar en L. bilineatus y L. montanus en cuanto al tipo de explante, el tiempo de respuesta y la pigmentación de los callos, los cuales presentaron una coloración beige y verde (Figura 4E y 4F). En cuanto a la textura, los callos verdes fueron más compactos respecto a los beige, estos últimos presentaron una consistencia más friable, similar a lo reportado por Ramírez-González (2013) para los callos generados con L. montanus, los cuales presentaron estructura compacta y una coloración verde.
Incremento de biomasa en callos
Respecto a la cinética de crecimiento de ambas especies L. bilineatus y L. montanus, ambas presentaron un crecimiento similar hasta el día 14, donde L. bilineatus llegó a la fase estacionaria y decayó a la fase de muerte, mientras que L. montanus continuó en la fase estacionaria (Figura 4A). Caso contrario a lo reportado por Montes-Hernández (2010), este autor reporta para L. aschenbornii una fase exponencial de 7 a 14 días y una prolongada fase estacionaria de 6 días y con una biomasa final de 4.6 gPF/L. Esto último similar a lo obtenido en este trabajo con L. bilineatus. Con respecto a L. montanus, se obtuvieron 5.24 veces más biomasa partiendo de 0.25 g (inóculo) con respecto a lo generado con L. aschenbornii. Con respecto a la biomasa seca, fue mayor con L. montanus (0.0931 g) respecto a L. bilineatus (0.0745 g). Es importante mencionar que no existen muchos reportes respecto a la generación de tejido desdiferenciado y al comportamiento en una cinética de crecimiento y producción, lo cual se reporta en este trabajo.
Producción de alcaloides
La presencia de alcaloides solo pudo ser detectada hasta el día 21. Lo anterior podría coincidir con lo reportado por Montes-Hernández (2010) para L. aschenbornii, que indica que la producción de AQ en cultivos en suspensión es dos a tres magnitudes menor que en hoja o semilla de planta silvestre. Aunque también puede deberse a la baja sensibilidad y baja especificidad para algunos AQ del reactivo de Dragendorff (Zhang et al., 2021).
Conclusiones
Se obtuvieron altos porcentajes de germinación para las semillas de ambas especies, L. bilineatus (100%) y L. montanus (74%).
El explante que dio una mejor respuesta para la inducción de callo en ambas especies fue la raíz a una relación de reguladores de crecimiento de 2 mg L-1 de 2,4-D y 1 mg L-1 de CIN para L. bilineatus y para L. montanus 1 mg L-1 de 2,4-D y 0.5 mg L-1 de CIN.
La cinética de crecimiento presentó un comportamiento similar parea ambas especies, con tres fases evidentes: la fase lag o de adaptación, la fase exponencial y la fase de senescencia.
La producción de AQ se detectó para ambas especies en el día 21.
La utilización de estos protocolos de germinación, inducción de callo y la realización de las cinéticas de crecimiento ofrecen una alternativa para la producción de metabolitos secundarios de gran importancia como son los AQ.
