Área de estudio

La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Facultad de Ciencias Agrícolas, Campus IV de la Universidad Autónoma de Chiapas, en entronque carretera costera y Pueblo de Huehuetán, Chiapas (14° 54’ 29” N, 92° 15’ 38” O, 50 m de altitud, precipitación pluvial de 2326 mm anuales, temperatura promedio anual de 28 °C y clima cálido húmedo con lluvias en verano).

Medio de cultivo

Cien mililitros del medio de cultivo anaerobio (MCA) contenían 47.9 mL de agua destilada, 30.0 mL de líquido ruminal clarificado (filtrado en una gasa triple y centrifugado a 20 817 g por 15 min, a 4 °C y esterilizado a 121 °C por 15 min a 15 psi en autoclave; Felisa, FE-397, México), 5 mL de solución mineral I (6 g K₂HPO₄ 1000 mL^-1), 5 mL de solución mineral II (6 g K₂HPO₄, 6 g (NH₄) ₂SO₄, 12 g NaCl, 2.45 g MgSO₄ y 1.6 g CaCl₂ H₂O en 1000 mL de solución final), 5 mL de Na₂CO₃ en solución 8 % (8 g de Na₂CO₃ en 100 mL de agua destilada), 5 mL de acetato de sodio al 1.5 % (1.5 g acetato de sodio en 100 mL de agua destilada), 2 mL solución de sulfido-cisteína (2.5 g L-cisteína disuelta en 15 mL de NaOH 2 N+2.5 g Na₂S-9H₂O en 100 mL de H₂O), 0.1 mL de solución de resazurina al 0.1% (0.1 mL de resazurina en volumen final de 100 mL calentada hasta que el indicador pierde su coloración), 0.2 g de tripticasa-peptona y 0.10 g de extracto de levadura (^{Ley de Coss et al., 2011}, ²⁰¹³).

Aislamiento de BRUpj

La capacidad de adaptación y viabilidad del consorcio de bacterias del rumen se evaluó en el medio de cultivo con pasta de J. curcas (primer aislamiento). Para esto, en viales de cultivo de 250 mL se depositaron 150 mL del MCA y 3.0 g de pasta de J. curcas desengrasada sin detoxificar. Todo el procedimiento se realizó bajo flujo de CO₂, y se adicionaron 50 mL de LRF de bovino macho extraído con sonda esofágica. El medio se mantuvo 10 d a 38±0.05 °C. Luego, a 10 tubos (13×100 mm PYREX^®, México) con 4.5 mL de MCA se adicionó 0.1 g de la pasta, se inoculó con 0.5 mL del cultivo de bacterias que se mantuvieron activas en el primer aislamiento y se mantuvieron 7 d a 38±0.05 °C, el gas producido se liberó cada 24 h. Luego, 0.5 mL de este cultivo se transfirieron a tubos de 13×100 mm (PYREX^®, México) con 4.5 mL del MCA nuevo estéril, con las mismas características, y se incubaron 24 h. El cultivo se transfirió a viales con 50 mL de medio de cultivo para crecimiento de bacterias ruminales utilizadoras de pasta de J. curcas (BRUpj), y se mantuvieron 48 h a 38±0.05 °C. Este cultivo fue el inóculo de posibles BRUpj (T2).

Degradación in vitro de la MS (DivMS)

Pasta (0.2 g) de J. curcas en tubos de ensayo (18×150 mm; PYREX^®, México) se esterilizó por 15 min a 121 °C, se agregaron 9 mL del medio de cultivo bajo flujo de CO₂, de acuerdo con la técnica reportada por ^{Cobos y Yokoyama (1995)} y se mantuvo a 38±0.05 °C por 3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h, después de inocularse con 1.0 mL de los inóculos (T1: LFR obtenido de un bovino con cánula ruminal; T2: BRUpj obtenido del proceso de aislamiento). En cada periodo de incubación se determinó la concentración del substrato no degradado. Después de cada periodo el pH se midió con un potenciómetro (OACTON, 43294, Singapur). En cada tratamiento se tomaron los valores promedio y se ajustaron a valores logarítmicos para obtener los promedios para prueba con datos ajustados (^{Häubi, 2004}). Los resultados se calcularon con Microsoft Excel.

Recuento de bacterias totales (BT)

Con una pipeta tipo Pasteur, 0.5 mL de medio de cultivo se extrajo de cada tratamiento al finalizar cada periodo de incubación (3, 6, 12, 24, 48, 72 y 96 h), por capilaridad se depositaron en una cámara Petroff-Hausser (Hausser #3900, Electron Microscopy Sciences, EE.UU.), con un área de 0.0025 mm² y profundidad de 0.02 mm. Para el recuento se usó un microscopio de contraste de fases (Biológico BX51, Olympus, EE.UU.), a una magnificación 1000X (^{Ley de Coss et al., 2013}). La cuenta bacteriana se calculó con la fórmula: cantidad de bacterias=(promedio) (factor de dilución, 2×10⁷). Además, la tasa de generación se determinó para conocer el tipo de crecimiento entre los inóculos (LRF vs. BRUpj) con la fórmula: N=N ₀ 2 ⁿ (1), donde N: número final de células, N ₀ : número inicial de células y n: número de generaciones durante el periodo de crecimiento exponencial. Por tanto, el tiempo de generación (tg) de la población bacteriana se calculó como t/n, donde t es tiempo y se determina con los datos de la fase de crecimiento exponencial, n se calculó con la transformación logarítmica de la ecuación 1: n=3.3 [log N-log N ₀ ] (^{Madigan et al., 2009}).

Concentración de ácidos grasos volátiles (AGV)

Para determinar la concentración de AGV, nuevos MCA inoculados con LRF y BRUpj se mantuvieron por triplicado a 38±0.05 °C; luego a 2.0 mL de medio de cultivo se adicionaron 0.5 mL de ácido metafosfórico al 25 %; la mezcla se colocó en viales de plástico y se centrifugó a 17 664 g por 10 min, se agitó en un vórtex (Science MED, MX-S, EE.UU.) y se almacenaron a -10 °C. Para el análisis, 2 mL de la muestra descongelada, a 25 °C y centrifugada a 34 622 g, por 20 min, se depositaron en viales para cromatografía. El contenido de AGV se determinó en un cromatógrafo de gases (PerkinElmer^TM, Claurus 500; EE.UU.) con automuestrador y columna capilar (ELITE-FFAP de 15 m, Perkin-Elmer^TM), detector de ionización de flama (FID), gas N₂ acarreador a 60 psi, H₂ y O₂ para generar la flama con un flujo de 45 y 450 mL min^-1, de acuerdo con el método descrito por ^{Cobos et al. (2011)}.

Concentración de nitrógeno amoniacal

Dos mL de los medios para medir DivMS, en triplicado, se centrifugaron a 1000 g por 10 min, y 1.5 mL del sobrenadante se mezclaron con 0.375 mL de ácido metafosfórico (proporción 4:1), se mantuvieron en refrigeración y luego se centrifugaron a 13 000 g por 25 min. El sobrenadante se recuperó en viales de 2 mL y se almacenaron en congelación a -10 °C hasta su valoración; 20 µL de este sobrenadante se mezclaron con 1 mL de fenol y 1 mL de hipoclorito de sodio. Las muestras se mantuvieron a 37 °C por 30 min en baño maría, se adicionaron 5 mL de agua destilada, para diluir las muestras, se agitaron con un vortex (Science MED MX-S EE.UU.) y la absorbancia a 630 nm en un espectrofotómetro UV-VIS (Perkin-Elmer^TM, Lambda -40; EE.UU.) calibrado con un método (r²=0.99) de concentración de nitrógeno amoniacal según ^{McCullough (1967)}.

Diseño y análisis estadístico

El diseño experimental fue completamente al azar con cuatro repeticiones, los datos de la degradación de MS, concentración de AGV, concentración de nitrógeno amoniacal y pH en los medios de cultivo se analizaron con el procedimiento GLM. La concentración de bacterias totales se analizó con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (^{SAS, 2009}). Los valores promedio se compararon con la prueba de Tukey (p≤0.05).

Degradación in vitro de la MS

La DivMS de la pasta fue mayor (p≤0.05) en T1 (68.66%) queen T2 (58.00%) sólo a las 72 h (Cuadro 1). En ambos tratamientos hubo degradación del substrato desde la hora 3 de incubación. Esto indica que las bacterias se adaptaron al medio y degradaron la pasta sin detoxificar. ^{Kasuya et al. (2013)} indican que DivMS de la pasta de J. curcas sin detoxificar fue 54.9 % y aumentó a 77.9 % cuando se modificó con el hongo Pleurotus ostreatus por 45 d; además, la concentración de ésteres de forbol en la pasta disminuyó 99 %. Martínez et al. (2005) reportan que la degradación in vitro de la proteína cruda de la pasta de J. curcas, mezclada con enzimas, para simular la digestibilidad en no rumiantes fue 78.6 % e incrementó a 86 % cuando se calentó previamente. En nuestro estudio no se evaluó la degradación de los ésteres de forbol, por lo que no se puede asegurar que las bacterias lo degradaran. La degradación de los ésteres de forbol por Pleurotus ostreatus, B. adusta, Ganoderma recinaceum y P. rufa está documentado (^{Dias et al., 2014}; ^{De barros et al., 2011}). La degradación de los ésteres de forbol ocurre por actividad sinérgica entre las enzimas que catalizan la despolimerización de la lignina (actividad lignocelulósica de xilanasas, celulasas extracelulares y manganeso peroxidasa). El periodo de degradación de los ésteres de forbol es 15 a 30 d (^{Dias et al., 2014}; ^{Najjar et al., 2014}). Esta actividad enzimática la presentan bacterias del rumen (^{Hazlewood y Teather, 1988}; ^{Dehority, 2003}; ^{Cobos et al., 2011}), pero el tiempo de incubación debe ser mayor a 15 d para observar su efecto.

El pH en T1 fue mayor (p≤0.05) que en T2 a las 72 h, sin diferencias entre los tratamientos (p>0.05) en las demás horas (Cuadro 1). En ambos tratamientos el pH fue menor a 6.0, lo cual indica que las bacterias, que producen AGV o ácidos orgánicos, estuvieron activas (^{Scandolo et al., 2007}) y se adaptaron al medio ácido. ^{Dehority (2003)} indica que el pH es modificado por los ácidos orgánicos producidos durante la fermentación; sin embargo, la actividad bacteriana se afecta cuando el pH del medio es menor de 6.0, principalmente la de las bacterias que usan carbohidratos estructurales (^{Reynolds et al., 1993}). El pH en sistemas abiertos, como el rumen, puede ser menor a 6.0 por la acumulación de ácido láctico y esto ocurre cuando la dieta es rica en carbohidratos que se fermentan fácilmente, o es deficiente en fibra (^{Owens, 1998}). Sin embargo en estudios in vitro, que son sistemas cerrados, la acumulación de los ácidos orgánicos en el medio afecta más el pH porque no hay flujo hacia otro sistema, lo que pudo ocasionar el pH menor de 6.0 en nuestro estudio. ^{Martínez et al. (2006)} señalan que el contenido de almidón en la pasta de J. curcas desgrasada es 112 g kg^-1 MS, que es bajo respecto al contenido del grano de maíz. Al respecto, ^{Alfaro et al. (2009)} reportan un contenido de almidón de 16 híbridos de maíz amarillo, entre 650 y 756 g kg^-1 MS (711 g kg^-1 MS en promedio).

Recuento de bacterias totales

La cuenta inicial de bacterias inoculadas (LFR y BRUpj) a los medios fue 10⁴ mL^-1 de medio de cultivo, lo cual se obtuvo en la prueba para medir desde DivMS de la pasta. La cuenta de bacterias totales a las 24 y 48 h fue mayor (p≤0.05) en T1 que en T2, pero a las 96 h fue mayor (p≤0.05) en T2 (4.06) (Cuadro 2). La cuenta de bacterias totales no aumentó durante el periodo de incubación y fue menor a la reportada en el rumen (10¹⁰ a 10¹² bacteria mL^-1) por ^{Dehority (2003)}. El pH menor a 6.0 en ambos tratamientos pudo afectar el crecimiento, ya que en F. succinogenes, R. flavefaciens y R. albus reducen su crecimiento cuando el pH del medio es menor a 6.2 (^{Reynolds et al., 1993}; ^{Dehority, 2003}).

Aunque se observó heterofermentación de las bacterias de LRF y BRUpj, el crecimiento exponencial fue 3.0 a 3.5 h^-1. Ésto es lento, comparado con 1.5 h^-1 obtenido por ^{Kunene et al. (2000)} y ^{Ley de Coss et al. (2013)}, quienes usaron un medio a base de D-(+)-glucosa y condiciones similares de cultivo; además, la tasa de generación fue 1.36 y 1.09 h con LRF y BRUpj, respectivamente. Lo anterior también es lento comparado con bacterias del rumen, cuya tasa de generación es de 15 a 30 min. El crecimiento exponencial y la tasa de generación pudieron afectarse por el pH menor de 6.0 y la concentración inicial baja de bacterias inoculadas al medio (10⁴). La población de bacterias disminuyó desde las 72 h en T1 y en T2 aumentó a las 96 h; esto indica que el consorcio de BRUpj se adaptó mejor al medio.

Concentración de ácidos grasos volátiles (AGV)

La concentración de ácido propiónico, butírico y AGV totales no fue diferente (p>0.05) en las horas de muestreo (Cuadro 3). La concentración de ácido acético fue mayor (p≤0.05) en T1 a las 3, 6 y 12 h de incubación. La proporción normal de AGV producidos en el rumen con dietas óptimas que contienen menos de 40 % de carbohidratos solubles es: 60 a 65 % acético, 25 % propiónico, y 10 a 15 % butírico (^{Cobos, 2007}). La proporción de AGV calculada en nuestro estudio indica que la concentración de ácido acético fue menor al valor normal, y la proporción de propiónico y butírico es similar a la del rumen en condiciones normales de alimentación (^{Dehority, 2003}). Esto indica que en ambos tratamientos hubo actividad heterofermentativa.

Concentración de nitrógeno amoniacal

La concentración de NH₄ de las fermentaciones in vitro fue mayor (p≤0.05) en T2, en todos los tiempos de incubación (Cuadro 4). Esto indica que el consorcio de bacterias desarrollado en el medio selectivo con pasta de J. curcas, se adaptó mejor a sus condiciones y mostró actividad proteolítica mayor por el sinergismo que pudiera existir. En algunos casos hasta 90 % de la variación en la actividad proteolítica entre cepas se asoció con el sustrato disponible (^{Cotta y Hespell, 1986}); además, la cooperación entre especies ha mostrado actividad mayor. ^{Wallace (1985)} observó que Butyrivibrio fibrisolvens, Selenomonas ruminantium y Streptococcus bovis crecieron mejor en pares cuando el medio de cultivo tenía caseína como única fuete de nitrógeno; esta respuesta indicó que bacterias con actividad proteolítica pueden cooperar a su incremento. Según ^{Dehority (2003)}, las especies bacterianas ruminales con actividad proteolítica mayor son Ruminobacter amylophilus, Prevotella ruminicola, S. ruminantium, B. fibrisolvens y S. bovis; donde los productos primarios son aminoácidos y peptidos, y P. ruminicola es la productora mayor de NH₃.