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Introducción
El limón persa (Citrus latifolia Tanaka), es un cítrico comercializado por su alto contenido de vitamina C y aceites esenciales (Pérez-Nájera et al., 2013; Fathollahi et al., 2021). México ocupa el primer lugar a nivel mundial en la producción de limón (FAO, 2019). Sin embargo, existen pérdidas en poscosecha cercana al 50 % de la producción debido a hongos fitopatógenos. El hongo Penicillium italicum, es el agente causal del moho azul en los cítricos, afectado drásticamente la calidad del fruto y vida de anaquel (Jing et al., 2020). Los fungicidas sintéticos son los productos más utilizados convencionalmente para el control de P. italicum en poscosecha de cítricos (Chen et al., 2020). Sin embargo, han resultado ser ineficientes debido a que favorecen el desarrollo de fitopatógenos resistentes, además de presentar efectos negativos a la salud humana, animal y ambiental (Leyva-Acuña et al., 2020; Ons et al., 2020).
En la actualidad, la aplicación de microorganismos antagónicos como agentes de control biológico hacia fitopatógenos es una alternativa al uso de agro-productos sintéticos (Sui et al., 2020; Cerna-Chávez et al., 2021; Sánchez-Espinosa et al., 2021). Las levaduras aisladas de planta, suelo o fruto han sido eficientes en el control de enfermedades en poscosecha, sin embargo, existen levaduras aisladas de ambientes marinos, las cuales, han demostrado tener mayor capacidad antagónica que las aisladas de ambientes terrestres e incluso de fungicidas sintéticos (Rivas-Garcia et al., 2018). Dentro de los mecanismos antagónicos de levaduras hacia los fitopatógenos están; competencia por espacio y nutrimentos, producción de enzimas hidrolíticas, compuestos orgánicos volátiles, inducción de resistencia en el hospedero, entre otros (Mukherjee et al., 2020). Generalmente, se determina la capacidad antagónica de una levadura sobre frutos infectados por un fitopatógeno, sin embargo, en la actualidad, los consorcios microbianos han mostrado una mayor capacidad de inhibición debido a que se potencializan sus mecanismos de acción, además de incrementar su adaptación al hospedero (Palmieri et al., 2017).
Por otra parte, el alga verde marina Ulva sp. por la actividad de sus polisacáridos ha sido estudiada como antioxidante, antibacteriano, larvicida, anticoagulante, promotora del crecimiento vegetal, inductor de resistencia en el hospedero, entre otros (Li et al., 2020). El polisacárido ulvan protege a las plantas debido a su capacidad de inducir la resistencia sistémica adquirida, aumentando diversos compuestos como peroxidasa, superóxido dismutasa, catalasa, proteínas relacionadas con la patogenia (PR), entre otros, las cuales, le confieren una mayor tolerancia al hospedero hacia la infección por fitopatógenos (Abouraicha et al., 2015).
La aplicación de microorganismos antagónicos más el polisacárido ulvan ha sido evaluado en el control de enfermedades en frutos (Rivas-Garcia et al., 2018; Chiquito-Contreras et al., 2019), sin embargo, el efecto de levaduras de origen marino y ulvan no ha sido evaluado en el control de P. italicum en frutos de limón persa, lo cual, podría potenciar el control del moho azul, disminuyendo el uso de fungicidas sintéticos. Por lo anterior, en este estudio se determinó la capacidad antagónica in vitro de levaduras de origen marino hacia P. italicum y su efecto con ulvan en el control del moho azul sobre frutos de limón persa.
Materiales y métodos
Levaduras de origen marino
Las levaduras de origen marino fueron donadas por la colección de microorganismos perteneciente al CIBNOR y están identificadas como: Debaryomyces hansenii (cepa ECP4 y L1), Cryptococcus laurentii (cepa IRIICB) y Rhodotorula minuta (cepa IR4CF). Cada levadura se cultivó en medio Papa-Dextrosa-Agar (PDA, DifcoTM) a 25 °C por 48 h. Posteriormente, se colectó la biomasa y con una solución salina (0.85%) se ajustó su concentración a 1×106 células∙mL-1 con ayuda de un hematocitómetro.
Polisacárido ulvan
Ulvan (#ULV010, OligoTech®, Elicityl Ltd., Crolles, Francia) se preparó a 2 mg∙mL-1 usando agua desionizada estéril.
Muestreo
Se colectaron frutos de limón persa de una empacadora del Municipio de Martínez de la Torre, Veracruz, México, con signos y síntomas de moho azul, y se etiquetaron para su posterior procesamiento.
Aislamiento y patogenicidad de hongos poscosecha
Se cortaron cuatro trozos del exocarpio (de 0.5 cm2) enfermo de cada fruto. Las muestras se lavaron con hipoclorito de sodio al 5 % por 3 min y después se hicieron dos lavados con agua destilada estéril. Los trozos se dejaron secar y se colocaron en placas con PDA más Bactrol® al 0.05 % y se incubaron a 28 °C por 7 días. Los aislamientos fueron re-sembrados hasta obtener cultivos puros y se mantuvieron en placas con PDA y tubos inclinados a 4 °C.
Para la prueba de patogenicidad se usó la metodología de Navarta et al. (2014). Frutos de limón persa fueron sumergidos en hipoclorito de sodio al 5 % por 3 min, se enjuagaron en agua destilada estéril y secados en una campana de flujo laminar. Posteriormente, a cada fruto se le realizaron dos heridas de 2 mm con un bisturí estéril y se inoculo cada herida con un taquete 0.5 cm2 de diámetro proveniente de un cultivo en PDA de 7 días de cada aislamiento de Penicillium sp. Un grupo de frutos fue inoculado con agua destilada estéril como control. Los frutos se almacenaron a 27 °C y 90 % HR en recipientes de plástico estériles por 7 días. Se cuantificó diámetro de lesión (mm) y la incidencia de la enfermedad (%DI) (Saravanakumar et al., 2016), mediante la fórmula: %DI = FI/TF × 100. Dónde: FI, es el número de frutos infectados y TF, es el total de frutos. Para confirmar los postulados de Koch cada hongo fue re-aislado de los frutos en placas con PDA. Se utilizaron 10 frutos por tratamiento y el experimento se repitió dos veces.
Identificación morfológica y molecular de hongos poscosecha
Los hongos fitopatógenos fueron identificados a través de sus características morfológicas utilizando claves taxonómicas (Agrios, 2005) y por técnicas moleculares utilizando la región ITs1-5,8s-ITs-2 del ADN.
Efecto de ulvan sobre el crecimiento de levaduras de origen marino y Penicillium italicum
Fue seleccionada la cepa C2T de P. italicum por ser la más patogénica y se cultivó en placas con PDA a 25 °C por 7 días. Las esporas se cosecharon en una solución salina al 0.85 % con Tween 80, ajustando su concentración a 1×104 esporas∙mL-1 con ayuda de un hematocitómetro (Tian et al., 2002).
Efecto de ulvan sobre el crecimiento de levaduras de origen marino y P. italicum
Matraces Erlenmeyer que contenían 50 mL de medio YPD se inocularon con 1 mL de la suspensión ajustada previamente de cada levadura y 2 µL de ulvan. Los matraces se incubaron a 25 °C y 125 rpm. Se recolectaron alícuotas de 10 µL a las 6, 12, 18, 24 y 30 h para determinar el crecimiento de las levaduras de origen marino, con y sin, ulvan utilizando un espectrofotómetro UV a una longitud de onda de 620 nm. Se realizaron lecturas por triplicado por tratamiento en cada intervalo de tiempo y el experimento se repitió dos veces.
Para P. italicum, matraces Erlenmeyer que contenían 50 mL de medio de cultivo Caldo Papa y Dextrosa (Difco, Detroit, USA), se inocularon con 1 mL de la suspensión ajustada previamente del hongo y 2 µL de ulvan. Los matraces se incubaron a 25 °C y 125 rpm. Se colectaron alícuotas de 10 µL cada 6, 12, 18 y 24 h, colocándolas en un portaobjetos para ser observadas en un microscopio óptico. Se determinó la germinación de esporas, contabilizando 100 esporas y considerando una espora germinada, cuando el tubo germinativo fue igual o mayor al tamaño de la espora. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento y el experimento se repitió dos veces.
Antagonismo in vitro de levaduras de origen marino hacia P. italicum
Los ensayos de confrontación antagonista-fitopatógeno se llevaron a cabo en placas con PDA. Se estrío una línea de 4 cm de cada levadura y la combinación de ellas en el centro de la placa, posteriormente a 2 cm de distancia se colocó una alícuota de 20 µL de la suspensión ajustada del fitopatógeno (1×104 esporas∙mL-1). Un grupo de placas se inoculó con el fitopatógeno y 30 µL de un fungicida sintético (Benomyl 50 ® , a una concentración de 1000 ppm) y otro grupo solo fue inoculado con P. italicum (tratamiento control). Las placas fueron incubadas a 25 °C por 7 días. Se cuantificó el diámetro de crecimiento (mm) del fitopatógeno y se calculó la reducción del crecimiento micelial con la fórmula I (%) = DC-DT/DC ×100. Dónde: DC, es el micelio cuantificado en el tratamiento control y DT, es el diámetro del hongo en el tratamiento con levaduras de origen marino. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento y el experimento se repitió dos veces.
Medio de cultivo a base de flavedo de limón persa
El medio de cultivo se elaboró utilizando frutos de limón persa previamente lavados con agua del grifo, agua destilada y pelados con un bisturí estéril. Para preparar el medio a base de limón se utilizó 47.6 g de flavedo que se depositó en un matraz de 1 L con 680 mL de agua destilada. Se esterilizó el medio a 120 °C por 15 min y se vació 10 mL del sobrenadante en tubos falcón.
Desarrollo experimental
En cada tubo falcón, se depositaron 800 µL de la suspensión ajustada previamente de cada levadura y cuando fue en combinacion se depositaron 200 µL de cada levadura más 800 µL de la suspensión ajustada previamente de P. italicum. Los tubos falcón se incubaron a 25 °C y 150 rpm por 24 h. Se tomaron alícuotas de 3 mL para determinar; carbohidratos totales, sacarosa, glucosa y fructosa, y de 1 mL para determinar el número de esporas germinadas del hongo. Se consideró a una espora germinada cuando el tubo de germinación era igual o mayor al tamaño de la espora. Se observaron 100 esporas por tratamiento y se realizaron tres repeticiones. El experimento se repitió dos veces.
Determinación de carbohidratos
Para la determinación del contenido de glucosa se utilizó el método GOD-PAD de Barham y Trinder (1972), utilizando el kit Randox (Randox México S.A. de C.V). Se mezclaron 5 mL de la muestra con 50 mL de la solución reactiva. Después de incubar 30 min se midió la absorbancia en espectrofotómetro a 490 nm. Los valores se expresaron en mg∙mL-1. La fructosa se cuantificó por el método de Taylor (1995). Se adicionaron 5 mL de muestra, 20 mL triptamida-HCI y 600 mL de HCI concentrado. Los tubos se mezclaron y calentaron a 60 °C en baño maría por 15 min y se enfriaron en agua por 40 min. Finalmente, se midió en un espectrofotómetro la absorbancia a 518 nm. Las concentraciones se obtienen interpolando las absorbancias obtenidas con una curva de calibración de fructosa y sus valores se expresaron en mg/mL. La sacarosa se cuantificó con el método de Bruner (1964). Se mezclaron 2 mL de muestra y 4 mL de HCI 3 M, posteriormente se calentó a 100°C en baño maría por 15 min. Para neutralizar se añadieron 10 mL de KOH 5N y 600 mL de DNS (3,5-Dinitro ácido salicílico). La mezcla se calentó a 100 °C por 10 min en baño maría y se enfrió en agua con hielo. Se midió la absorbancia en un espectrofotómetro a 570 nm. El resultado se interpoló con una curva de calibración y los valores se expresaron en mg∙mL-1.
Antagonismo in vivo de levaduras de origen marino en frutos de limón persa con P. italicum y ulvan
Frutos de limón se lavaron con agua destilada estéril y desinfectados con hipoclorito de sodio al 5 % por 1 min (Yao et al., 2004). Se enjuagaron en agua destilada estéril y se dejaron secar por 1 h en una campana de flujo laminar. Posteriormente, a cada fruto se le realizaron dos heridas de 2 mm de profundidad con una aguja estéril y en cada una se inocularon 20 µL de la suspensión ajustada previamente del fitopatógeno. Después, cada herida fue inoculada de manera individual o combinada con 20 µL de la suspensión ajustada previamente de cada levadura y ulvan. Un grupo de frutos fueron inoculados con el fitopatógeno más 15 µL del fungicida sintético Benomyl 50 ® . Otro grupo fue inoculado con el fitopatógeno y ulvan y un grupo control solo con P. italicum.
Los frutos se colocaron en recipientes de plástico estériles a 25 °C y 90 % HR por 7 días. Se cuantificó diámetro de lesión (mm) y la incidencia de la enfermedad (%DI) (Saravanakumar et al., 2016) mediante la fórmula: %DI = FI/TF × 100. Dónde: FI, es el número de frutos infectados y TF, es el total de frutos. Para confirmar los postulados de Koch se re-aisló cada hongo de los frutos enfermos en placas con PDA. Se utilizaron cinco frutos por tratamiento y el experimento se repitió dos veces.
Inducción de resistencia en frutos de limón persa inoculados con levaduras de origen marino, P. italicum y ulvan
Muestra
Para determinar la inducción de resistencia de frutos de limón persa inoculados con levaduras de origen marino, P. italicum y ulvan se cuantificó la actividad enzimática en los frutos a las 24 h después de la inoculación de cada tratamiento. Se hizo una mezcla compuesta de cada tratamiento colectado (1 g de tejido) de cada fruto. Las muestras fueron almacenadas a -40°C para su respectivo análisis.
Sobrenadante
De la mezcla compuesta se pesó 0.1 g de tejido y se colocó en un tubo eppendorf, después se le agregaron 2 mL de buffer de fosfato y se colocaron en un homogeneizador durante 60 s. Posteriormente, se centrifugaron a 10000×g por 13 min a 5°C. Transcurrido el tiempo, el sobrenadante se recuperó y se colocó en un tubo eppendorf y se almacenó a -40°C para su posterior análisis. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento.
Actividad enzimática
La actividad catalasa (CAT) se determinó en microplacas de 96 pozos, a cada uno se le agregaron 10 µL de buffer de fosfato 100 nM (pH 7.0), más 20 µL del extracto y se incubaron por 6 min. Transcurrido este tiempo se añadieron 20 µL de peróxido de hidrógeno 8.82 M y se les incubó por 20 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregaron 30 µL de hidróxido de potasio (KOH) 10 M, más 30 µL de reactivo Purlpad (23.5 M) y se les incubó por 10 min. Por último, se añadieron 10 µL de Peryodato de potasio 0.5 M en KOH 0.5 M, y se les volvió a incubar por 5 min. Finalmente, se hicieron lecturas a 540 nm en un espectrofotómetro. Para determinar la actividad de superóxido dismutasa (SOD), se utilizó una microplaca de 48 pozos, donde se colocaron 600 µL de buffer de fosfato. Posteriormente, se les agregaron 20 µL del extracto, se adicionaron 20 µL de xantina oxidasa y, se agregaron otros 600 µL de buffer de fosfato. Se hicieron lecturas a una absorbancia de 560 nm, cada 30 s durante 5 min. La actividad de peroxidasa (POX), se determinó en placas de 96 pozos colocando 10 µL del extracto, después se les adicionaron 50 µL de solución de guaiacol y la muestra se cuantifico a 436 nm en un espectrofotómetro. Los valores fueron expresados en U/g de proteína.
Análisis estadístico
Los datos se analizaron mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA) utilizando el software STATISTICA 10.0 (paquete de software StatSoft, Tulsa, OK) y se utilizó la prueba de Tukey (P≤0.05) para la separación de medias. Antes del análisis de varianza, los porcentajes se transformaron en arcoseno-raíz cuadrada.
Resultados y discusión
Aislamiento, identificación y patogenicidad de hongos aislados de frutos de limón persa
Se aislaron siete hongos de frutos de limón persa identificados como Penicillium spp. En la prueba de patogenicidad, de los aislamientos catalogados como; CV2T, C2T, NFC, VFC, 2FC, CVMT y BFC, solo los primeros dos tuvieron una incidencia del 100 % y el resto de los hongos no ocasionaron enfermedad sobre los frutos. El aislamiento C2T fue el que mayor daño ocasionó sobre los frutos con un diámetro de lesión de 49 mm seguido de CV2T con 39 mm. Los hongos CV2T y C2T fueron re-aislados de los frutos confirmando los postulados de Koch. A través de la región ITs1-5,8s-ITs-2 del ADN, los siete hongos fueron identificados como Penicillium italicum mostrando una identidad del 100 % según la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information, https://www.ncbi.nlm.nih.gov).
El limón ocupa dentro de los cítricos el segundo lugar en importancia, tanto por su consumo en fresco como por su uso industrial. Dentro del contexto mundial, México está considerado como el principal país productor en las variedades persa y mexicano (SADER, 2019). Después de la cosecha, el limón se almacena y manipula en plantas de embalaje con el fin de mantener su vida y calidad poscosecha, así como reducir la descomposición debido a la infección por fitopatógenos (Papoutsis et al., 2019). Sin embargo P. italicum, agente causal del moho azul, es uno de los principales hongos que causan pérdidas económicas de hasta el 80 % de la producción de cítricos a nivel mundial (El-Otmani et al., 2011).
En México, P. italicum es uno de los principales fitopatógenos que causan pérdidas poscosecha cercanas al 50 % de la producción que incluye limón, naranja y mandarina (Ochoa et al., 2007). Debido a la gran cantidad de esporas que produce P. italicum, infecta rápidamente a las heridas de los frutos por lo que su control debe ser durante y después de la cosecha, para evitar grandes pérdidas de fruta (Kellerman et al., 2016). La rápida identificación de los fitopatógenos en poscosecha es fundamental para el manejo de las enfermedades en los cítricos limitando las pérdidas de fruta y manteniendo su calidad organoléptica (Kanashiro et al., 2020).
Efecto de ulvan sobre P. italicum y levaduras de origen marino
La presencia de ulvan no influyó sobre la germinación de esporas de P. italicum (Figura 1). En relación a las levaduras de origen marino, no existió un efecto de ulvan sobre el crecimiento de los microorganismos (Figura 2). La dinámica de crecimiento fue similar entre todos los tratamientos.
Figura 1 Dinámica de germinación de esporas de P. italicum con ulvan.
Figure 1. Spore germination dynamics of
P. italicum with ulvan.
Figura 2 Dinámica de crecimiento de levaduras de origen marino con ulvan. ECP4 y L1 =
D. hansenii, IRIICB = C.
laurentii e IR4CF = R. minuta.
Figure 2. Growth dynamics of marine yeasts
with ulvan. ECP4 and L1 = D. hansenii, IRIICB =
C. laurentii and IR4CF = R.
minuta.
Las algas marinas han recibido una gran atención durante los últimos años, debido a la química natural de sus productos (Pankiewicz et al., 2016), principalmente a los polisacáridos que presentan diversas actividades biológicas como anticoagulantes, antivirales, antibacterianas, antitumorales, antiproliferativas, inmunomoduladoras, entre otras (Berri et al., 2016). Ulva sp. es un alga verde marina que está recibiendo una gran atención, debido a sus propiedades fisicoquímicas y biológicas de posible interés para aplicaciones en diversas áreas como la cosmetología, medicina, agrícola, entre otras (Berri et al., 2016).
Ulvan es un polisacárido aislado de Ulva sp. que presenta actividad antiviral, antibacteriano, antioxidante, antiparasitario, entre otros (Chiquito-Contreras et al., 2019). En la agricultura, se ha utilizado como promotor del crecimiento vegetal e inductor de resistencia en las plantas, sin embargo, no presenta una acción antimicrobiana directa sobre los microorganismos (Rivas-Garcia et al., 2018). Su principal función en las plantas es inducir la producción de enzimas de defensa como la catalasa (CAT), peroxidasa (POX), polifenol oxidasa, superóxido dismutasa (SOD), compuestos fenólicos, proteínas relacionadas con la patogenia (PR), entre otros (Khedia et al., 2020; Moenne et al., 2020).
Antagonismo in vitro de levaduras de origen marino hacia P. italicum
Las levaduras de origen marino inhibieron el crecimiento micelial del fitopatógeno in vitro (Figura 3). La inhibición que ejercieron las levaduras de manera individual o en consorcio hacia P. italicum fue entre 21 y 38 %. El fungicida sintético Benomyl 50 ® solo limito a 3 % el crecimiento de P. italicum.
Figura 3 Efecto de la aplicación individual o en consorcio de levaduras de origen marino sobre
el crecimiento micelial de P. italicum. ECP4 y L1 =
D. hansenii, IRIICB = C.
laurentii e IR4CF = R. minuta. Las
líneas verticales sobre las barras representan la desviación
estándar (n= 3). Las letras representan la diferencia estadística
entre tratamientos (Tukey, P≤0.05).
Figure 3. Effect of the individual or
consortium application of marine yeasts on the mycelial growth of
P. italicum. ECP4 and L1 = D.
hansenii, IRIICB = C. laurentii and
IR4CF = R. minuta. Vertical lines on the bars
represent the standard deviation (n = 3). Letters represent the
statistical difference between treatments (Tukey,
P≤0.05).
Existen diversos reportes sobre la capacidad antagónica de levaduras hacia fitopatógenos, Taqarort et al. (2008) evaluaron el biocontrol de P. digitatum mediante el uso de las levaduras Pichia anomala y D. hansenii. Por su parte, Zhang et al. (2007) y Droby et al. (2009) observaron una disminución del moho azul por la acción de la levadura Cryptococcus laurentii. Sin embargo, la acción antagónica de los microorganismos puede potenciarse si se utilizan consorcios microbianos, los cuales pueden tener un mayor espectro de actividad, por lo tanto, pueden reducir la presencia de los fitopatógenos eficazmente en comparación con su aplicación de manera individual (Palmieri et al., 2017). La eficiencia de los consorcios microbianos podría resultar no solo de la actividad de las especies individuales, sino también de su acción sinérgica que suprimirá el crecimiento de un fitopatógeno a través de diferentes mecanismos de acción (Panebianco et al., 2015). La aplicación de consorcios microbianos ha mejorado la eficiencia del control biológico de enfermedades en muchos sistemas agrícolas (Jain et al., 2020).
Por otra parte, el uso de fungicidas sintéticos sigue siendo la primera opción en el control de fitopatógenos de importancia agrícola (Zhu et al., 2020). Para el control de Penicillium sp. se recomienda el uso de diversos fungicidas sintéticos, entre ellos el Benomyl 50 ® , sin embargo, han perdido eficiencia en el control del fitopatógeno debido a la resistencia que presentan algunas cepas de diversas especies de Penicillium (Moussa et al., 2021).
Competencia por carbohidratos entre levaduras de origen marino y P. italicum
El contenido de fructosa, glucosa y sacarosa disminuyó significativamente en presencia de levaduras de origen marino y P. italicum (Figura 4). El consorcio con ECP4, L1, IRIICB y IR4CF más el fitopatógeno fue el que disminuyó significativamente el contenido de carbohidratos en el medio de cultivo a base de flavedo de limón persa (control). Por otra parte, las levaduras de origen marino inhibieron significativamente el número de esporas germinadas de P. italicum (Figura 5). El consorcio conformado por ECP4, L1, IRIICB y IR4CF, inhibió en un 77 % la germinación de esporas del fitopatógeno. P. italicum germino en un 89 %.
Figura 4 Contenido de carbohidratos en medio de cultivo a base de flavedo de limón persa
inoculado con levaduras de origen marino y P.
italicum. ECP4 y L1 = D. hansenii,
IRIICB = C. laurentii e IR4CF = R.
minuta. Las líneas verticales sobre las barras
representan la desviación estándar (n= 3). Las letras representan la
diferencia estadística entre tratamientos (Tukey,
P≤0.05).
Figure 4.
Carbohydrate content in culture medium based on Persian lemon
flavedo inoculated with marine yeast and P.
italicum. ECP4 and L1 = D. hansenii,
IRIICB = C. laurentii and IR4CF = R.
minuta. Vertical lines on the bars represent the
standard deviation (n = 3). Letters represent the statistical
difference between treatments (Tukey,
P≤0.05).
Figura 5 Germinación de esporas de P. italicum en medio de cultivo a base de
flavedo de limón persa. ECP4 y L1 = D. hansenii,
IRIICB = C. laurentii e IR4CF = R.
minuta. Las líneas verticales sobre las barras
representan la desviación estándar (n= 3). Las letras representan la
diferencia estadística entre tratamientos (Tukey,
P≤0.05).
Figure 5. Spore
germination of P. italicum in a Persian lemon
flavedo-based culture medium. ECP4 and L1 = D.
hansenii, IRIICB = C. laurentii and
IR4CF = R. minuta. Vertical lines on the bars
represent the standard deviation (n = 3). Letters represent the
statistical difference between treatments (Tukey,
P≤0.05).
Todos los microorganismos requieren de azúcares como fuentes de carbono para su crecimiento y reproducción, la competencia por espacio y nutrientes es una vía antagónica de levaduras hacia fitopatógenos (Mukherjee et al., 2020), este mecanismo es eficaz debido a que las levaduras tienen un metabolismo más rápido que el fitopatógeno, agotando rápidamente las fuentes de carbono (fructosa, glucosa, sacarosa, entre otros) y limitando a la germinación de esporas (Spadaro y Droby, 2016; Adrees et al., 2019). Los microorganismos antagonistas deben tener la capacidad de competir efectivamente por los nutrientes disponibles en el nicho ecológico para colonizar y limitar el crecimiento de los fitopatógenos. Al respeto, Spadaro et al. (2010), mencionan que los microrganismos antagonistas tienen la capacidad de asimilar una amplia variedad de mono y disacáridos. Hernández-Montiel et al. (2010), reportaron que las levaduras presentan una mayor tasa de consumo de glucosa y sacarosa que los fitopatógenos, lo cual restringe la germinación de la espora de los hongos.
Efecto levaduras de origen marino y ulvan en el control de P. italicum en frutos de limón persa
La incidencia de P. italicum en frutos de limón persa fue disminuida por la inoculación de levaduras de origen marino, ulvan y el fungicida sintético (Figura 6). La aplicación del consorcio microbiano con las cepas ECP4, L1, IRIICB y IR4CF disminuyó la incidencia de la enfermedad hasta en un 20 % y los frutos de limón persa con Benomyl 50® más P. italicum presentaron un 60 % de incidencia. En relación al diámetro de lesión, las levaduras de origen marino, ulvan y Benomyl 50 ® disminuyeron significativamente el daño ocasionado por el fitopatógeno en frutos de limón persa (Figura 7). Los frutos inoculados con el consorcio conformado por ECP4, L1, IRIICB y IR4CF presentaron el diámetro de lesión más bajo con valores de 2 mm. La aplicación de las levaduras de origen marino de manera individual o en consorcio disminuyó el diámetro de lesión en menos del 60 % en comparación con el tratamiento de los frutos con Benomyl 50 ® y el fitopatógeno. P. italicum fue re-aislado de los frutos enfermos confirmando los postulados de Koch.
Figura 6 Incidencia de P. italicum en frutos de limón persa inoculados con
levaduras de origen marino y ulvan. ECP4 y L1 = D.
hansenii, IRIICB = C. laurentii e
IR4CF = R. minuta. Las líneas verticales sobre las
barras representan la desviación estándar (n= 5). Las letras
representan la diferencia estadística entre tratamientos (Tukey,
P≤0.05).
Figure 6.
Incidence of P. italicum in Persian lemon fruits
inoculated with marine yeasts and ulvan. ECP4 and L1 = D.
hansenii, IRIICB = C. laurentii and
IR4CF = R. minuta. Vertical lines on the bars
represent the standard deviation (n = 5). Letters represent the
statistical difference between treatments (Tukey,
P≤0.05).
Figura 7 Diámetro de lesión ocasionado por P. italicum en frutos de limón
persa inoculados con levaduras de origen marino y ulvan. ECP4 y L1 =
D. hansenii, IRIICB = C.
laurentii e IR4CF = R. minuta. Las
líneas verticales sobre las barras representan la desviación
estándar (n= 5). Las letras representan la diferencia estadística
entre tratamientos (Tukey, P≤0.05).
Figure 7. Diameter of lesion caused by
P. italicum in Persian lemon fruits inoculated
with marine yeast and ulvan. ECP4 and L1 = D.
hansenii, IRIICB = C. laurentii and
IR4CF = R. minuta. Vertical lines on the bars
represent the standard deviation (n = 5). Letters represent the
statistical difference between treatments (Tukey,
P≤0.05).
La actividad enzimática de POX, CAT y SOD fue incrementada en los frutos de limón persa inoculados con levaduras de origen marino y ulvan (Tabla 1). Los valores más altos de las enzimas fueron cuantificados en el tratamiento de los frutos con el fitopatógeno más las levaduras y ulvan.
Tabla 1 Actividad enzimática de frutos de limón persa inoculados con levaduras de origen marino, ulvan y P. italicum. Table 1. Enzymatic activity of Persian lemon fruits inoculated with marine yeasts, ulvan and P. italicum.
| Tratamiento§ | Actividad enzimática (U/g de proteína) | |||
|---|---|---|---|---|
| POX¥ | CAT | SOD | ||
| P. italicum | 8.41±2 d£ | 7.98±1 g | 6.35±2 e | |
| Ulvan+P. italicum | 14.92±3 b | 10.28±2 e | 8.19±1 d | |
| IRIICB+P. italicum | 8.19±2 d | 7.78±2 g | 10.67±1 c | |
| ECP4+P. italicum | 7.91±1 d | 8.98±1 f | 10.31±2 c | |
| IR4CF+P. italicum | 7.33±1 d | 8.54±1 f | 11.41±2 c | |
| L1+P. italicum | 8.28±2 d | 5.47±3 h | 10.11±3 c | |
| + P. italicum + ulvan | IRIICB+ECP4 | 11.21±2 bc | 12.64±3 cd | 13.21±3 b |
| IRIICB+IR4CF | 11.92±3 bc | 13.15±2 c | 13.48±3 b | |
| IRIICB+L1 | 12.17±2 bc | 12.87±3 cd | 14.11±2 b | |
| IRIICB+ECP4+IR4CF | 14.29±3 b | 15.68±1 b | 14.56±2 b | |
| IRIICB+ECP4+L1 | 14.89±1 b | 16.47±1 b | 14.89±3 b | |
| IRIICB+IR4CF+L1 | 15.27±1 b | 15.87±2 b | 15.13±2 b | |
| IRIICB+ECP4+IR4CF+L1 | 19.97±3 a | 20.45±3 a | 19.55±1 a | |
| ECP4+IR4CF | 12.19±2 bc | 12.35±2 c | 14.38±1 b | |
| ECP4+L1 | 12.34±2 bc | 13.01±1 c | 13.98±2 b | |
| ECP4+IR4CF+L1 | 11.97±1 bc | 13.22±1 c | 14.78±2 b | |
§Tratamiento: ECP4 y L1 = D. hansenii, IRIICB = C. laurentii e IR4CF = R. minuta. ¥ Actividad enzimática: POX (peroxidasa), CAT (catalasa), SOD (superóxido dismutasa). £Las letras en las columnas representan la diferencia estadística entre tratamientos (Tukey, P≤0.05).
Diversos mecanismos antagónicos por levaduras están relacionados con el control biológico de enfermedades en los frutos (Wassermann et al., 2019), incluyendo la competencia por nutrientes y espacio, toxinas killer, producción de enzimas hidrolíticas, parasitismo, bio-películas, compuestos orgánicos volátiles, inducción de resistencia del hospedero, entre otros (Konsue et al., 2020; Solairaj et al., 2020). La protección de los frutos puede ser incrementada cuando se aplican más de dos microorganismos antagónicos compatibles (Zhimo et al., 2020), los cuales presentan varias ventajas sobre el uso de una sola especie, incluida una mayor eficacia de biocontrol de los fitopatógenos, resistencia al estrés ambiental y rápida adaptación al hospedero (Pandhal y Noirel, 2014; Mukherjee et al., 2020).
Por otra parte, levaduras de origen marino y ulvan son capaces de activar la producción de enzimas SOD, CAT y POX en diversos hospederos disminuyendo las infecciones ocasionadas por diversos fitopatógenos (Khedia et al., 2020; Zhang et al., 2020). Las enzimas de defensa protegen a los frutos de diversas especias reactivas de oxígeno (ROS) causadas por fitopatógenos (Czarnecka et al., 2019). Las ROS originan daños directamente sobre las células vegetales afectando diversas funciones metabólicas de las plantas (Qi et al., 2019). La inducción de SOD en las plantas permite la reducción de las ROS en la célula, la POX y CAT disminuye y protege a las células vegetales de la actividad de H2O2 (Klein et al., 2018; Guo et al., 2020).
Conclusiones
Las levaduras de origen marino (D. hansenii, R. minuta y C. laurentii) inhibieron in vitro e in vivo a P. italicum. La aplicación de los consorcios de levaduras y ulvan sobre los frutos de limón persa disminuyó al moho azul ocasionado por P. italicum superando al fungicida sintético Benomyl 50 ® . La competencia por fuentes de carbono e inducción de resistencia del hospedero son dos mecanismos antagónicos de levaduras hacia fitopatógenos. La validación de consorcios a base de microrganismos antagónicos en empacadoras de limón persa permitirá la disminución del uso de fungicidas sintéticos.
