Desinfestación de la semilla y preparación de semilleros para la siembra

Las semillas utilizadas para la siembra de cada uno de los 23 genotipos de chile se introdujeron en una solución de hipoclorito de sodio al 5% durante siete minutos, después se realizaron tres enjuagues con agua destilada y finalmente colocadas al sol para eliminar los excesos de agua. A la par, semilleros de unicel de 200 cavidades se les agregó sustrato de turba (Peat moss) más Agrolita en una proporción 50:50 (V/V). La esterilización del sustrato se realizó en olla de presión a 18.5 lb pulg^-2 (psi), con una temperatura de 120 °C y un tiempo de duración de seis horas, distribuidas en dos fases de tres horas cada una con un tiempo de reposo de 24 h entre ambas. La siembra de los 23 genotipos de chile se realizó el 5 de julio del año 2019, depositando dos semillas por cavidad a una profundidad de 0.5 cm, cubriendo con una capa ligera de sustrato Peat moss humedecido. Posteriormente se procedió a la inoculación de consorcios.

Tratamientos de estudio

Los tratamientos de estudio fueron cuatro: T1= Testigo (Sin aporte nutrimental (agua)), T2= Consorcio = (mezcla) de los seis HMA, T3= Consorcio de seis HMA más el consorcio de cuatro Rpcv, T4= Fertilización química a base una solución nutrimental Long Ahston completa (^{Yépez-Hernández et al., 2016}). Se desarrollaron 5 repeticiones por tratamiento; cada repetición presentó 30 plantas; 600 plantas fue el total de unidades experimentales en el presente estudio.

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) fueron obtenidos de inóculos establecidos por el área de Microbiología de Suelos, del Programa de Edafología, en el Colegio de Posgraduados Campus Montecillo y las rizobacterias del Laboratorio de Bacteriología de la Universidad tecnológica de Torreón (UTT). Los hongos corresponden a seis cepas de Rhizophagus intraradices con las claves Zac-19, Ced-20, Tab-21, Mér-22, Pap-23 y Jal-24. Asimismo, se incluyeron cuatro cepas de rizobacterias (Rpcv = Rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal), tres del género Pseudomonas que corresponden a P. lini, P. fluorescens, Acinetobacter guillouiae y una del género-especie Aeromona caviae.

Inoculación en la siembra con un consorcio de seis HMA y de las Rpcv

Acorde a ^{Bécard y Piché (1992)} se reprodujeron los HMA usando Allium schoenoprasum para obtener suficiente inóculo. El consorcio de los HMA se aplicó al momento de la siembra en concentraciones de 10 gramos de inoculo micorrízico por semilla sembrada depositada en los semilleros de unicel de 200 cavidades conteniendo el sustrato Peat moss más Agrolita; los 10 gr de inóculo micorrízico contuvo 1,788 esporas por 100 g de suelo húmedo.

Las cepas de Rpcv por separado, fueron cultivadas en caldo nutritivo a 26 ºC durante 18 horas en agitación. La suspensión bacteriana se centrifugó durante 15 minutos a 7000 rpm. El pellet de cada rizobacteria se resuspendió en 20 mL de agua destilada estéril y se hicieron diluciones decimales hasta 10^-5 UFC/mL o bién hasta alcanzar una concentración celular de 1*10⁵ UFC/mL de cada especímen. Con una micropipeta, un mL de la dilución bacteriana de cada espécimen fue depositado en la semilla depositada en los semilleros de unicel de 200 cavidades conteniendo el sustrato Peat moss más Agrolita.

Condiciones de germinación y emergencia

Después de la inoculación, los semilleros de cada tratamiento, fueron cubiertos con polietileno negro por 48 hrs para conservar el contenido de humedad (100%) a una temperatura de 22 °C. Posteriormente, los semilleros se liberaron de la cubierta de polietileno y, durante 10 días se mantuvieron en los semilleros irrigándolos (a saturación) con una solución nutrimental química a base una solución nutrimental; la preparación de la solución nutritiva se basó en una solución química tipo Long Ashton completa (400 ml/charola) (^{Yépez-Hernández et al., 2016}), la que fue aplicada cada tercer día.

Trasplante a macetas e inoculación con zoosporas de Phytophthora capsici

A los 10 días después de la siembra, se desarrolló un trasplante de plántulas en macetas plásticas de dos litros (0.70 kg). El sustrato utilizado fue Peat moss y arena fina obtenida de río de la región esterilizado en una relación 40 y 20%, más Agrolita en un 40%. Al finalizar el trasplante, 12 hrs después, se procedió a realizar una nueva inoculación de los consorcios con base a los tratamientos indicados. La irrigación fue diaria a las macetas fue depositando 200 mL/día de la solución nutritiva previamente indicada durante 60 días a partir del trasplante.

Para la inoculacion con Phytophthora capsici, se desarrollaron aislamientos puros de aquella donada por el Laboratorio agricola del Colegio de Postgraduados en Montecillos; estos se cultivaron en medio PDA (papa dextrosa agar) para su incremento masivo. Despues de 15 dias de crecimiento se elaboro el inoculo de la siguiente manera: en cajas Petri con 20 mL de agua destilada esterilizada se colocaron discos de medio de cultivo que contenian micelio de P. capsici; el material se incubo a 25 °C por tres dias para la formación de esporangios y la posterior liberacion de sus zoosporas al ubicar las cajas Petri a 12 °C por 30 min.; posteriormente, con la ayuda de un hemacitometro se ajusto una suspension de zoosporas a una concentracion de 3 x 103 mL-1. A los 11 dias despues de trasplante, las plantas de chile correspondientes a los cuatro tratamientos de estudio fueron inoculadas con tres gramos de hojarasca esteril conteniendo 3x103 zoosporas de P. capsici, con 36 hrs de crecimiento. Las plantas se mantuvieron durante 60 dias en invernadero en condiciones favorables de la enfermedad las cuales son: una temperatura de 25 + 5 °C y una humedad relativa de 80 + 5%. El riego de las plantas se mantuvo constante (cada 3 dias) para todos los tratamientos (^{Ramirez-Villapudua y Romero-Cova, 1980}).

Variables evaluadas

Las variables evaluadas en la etapa de semillero fueron: El número de plántulas emergidas en semillero (npes) a los 10 días después de la siembra. La altura de la plántula fue contabilizada a los 10, 28, 57 y 70 días después de la siembra.

El porcentaje de plantas muertas por ataque del hongo fitopatógeno (P. capsici), se llevó a cabo mediante una escala subjetiva, realizando revisiones, conteos y registro de las plantas muertas a los 14, 28, 36, 40 y 45 días después de la inoculación que mostraran marchitez, característico de la enfermedad en cuestión. Se realizaron en cada uno de los cuatro tratamientos de estudio. Las plantas afectadas, fueron trasladadas al laboratorio, para re-aislar el hongo P. capisici, e identificarlo con las claves ^{Erwin y Ribeiro (1996)}, ^{Martin et al. (2012)} y ^{Lamour et al. (2012)}.

Detección de células microbiológicas adheridas al sistema radicular de chile

Para las Rpcv al finalizar el estudio (60 días después del trasplante), se seleccionaron cinco plántulas de los diferentes tratamientos; sus raíces previamente lavadas con agua destilada estéril, se cortaron para transferirse a un tubo Eppendorf con agua estéril y se agitaron durante 1 m, para provocar el desprendimiento de las bacterias adheridas a la raíz. De la solución resultante se tomaron 100 μL que se sembraron por dispersión en placa de medio OAB selectivo. Las placas se incubaron a 30 ºC durante 24 h para cuantificar las unidades formadoras de colonia (UFC). Esta prueba se realizó por triplicado.

Para el caso de Rhizophagus intraradices se llevó a cabo mediante su tinción con azul de tripano (^{Phillips y Hayman, 1970}) y observación al microscopio electrónico de las estructuras características de esta asociación (hifas, arbúsculos y vesículas). Se determinó el porcentaje de colonización mediante la técnica de ^{McGonigle et al. (1990)}.

Se realizó un análisis microbiológico para apreciar la presencia del hongo de P. capsici, considerando la técnica de aislamiento previamente citada (Trasplante a macetas e inoculación con zoosporas de Phytophthora capsici).

Análisis estadístico

En el presente trabajo se aplicó un diseño completamente al azar. Se realizaron análisis de varianza y pruebas de comparación múltiple de medias (Tukey p<0.05). Los análisis estadísticos fueron realizados con el programa de cómputo SAS (^{SAS, 2004}).

Altura de la planta

El promedio de la altura obtenida al analizar los tratamientos por separado (23), los resultados indican que el mejor tratamiento fue el 23 (87 (±8 cm)). Isabel/Chih a base de fertilización química. Sin embargo, éste no se mostró superior con p<0.05 en comparación con los tratamientos 16 al 22 (Tabla 1), excepto aquellos considerados como testigo control (T1).

Por su parte cuando fueron agrupados en tipo Pasilla (3), Ancho (4), Guajillo (4), Puya (4), Serrano (4) y Jalapeño (5), se pudo apreciar que los de tipo serrano y jalapeño, fueron los que mostraron valores numéricos altos en comparación de los de tipo Pasilla (3), Ancho (4), Guajillo (4), Puya (4), respectivamente (Tabla1).

Los resultados obtenidos con los encontrados por ^{Cardona et al. (2008)} muestran que las Rpcv (Pseudomonas sp.) por si solas mejoran el crecimiento de las plantas; en el estudio los mismos autores obtuvieron alturas de planta de glicófitas a los 20 días después de la inoculación. ^{Gholami et al. (2009)} y Bashan et al. (2009), alcanzaron un incremento de 21.31%, para la altura de planta cuando inocularon plantas de pimiento morrón con Bacillus sp. MA 12, con respecto al testigo a los 60 días después de la inoculación. Diversos estudios son los que destacan la capacidad de las Rpcv para favorecer la micorrización (Founoune et al., 2002; Mediavilla et al., 2015; Miransari, 2011) y promover el crecimiento de las plantas micorrizadas (^{Barman et al., 2015}; ^{Frey-Klett et al., 2007}).

Ataque de P. capsici en plantas de chile a los a los 14, 28, 36, 40 y 45 días después de la inoculación

En el presente estudio, P. capsici a los 23 cultivares de chile en condiciones de invernadero, se encontró que a los 14 después de la inoculación (ddi), al analizarse por grupos de inoculantes vs controles (T1= Testigo (agua)), T2= Consorcio = (mezcla) de los seis HMA, T3= Consorcio de seis HMA más el consorcio de cuatro Rpcv, T4= Fertilización química), los resultados arrojaron que el testigo y el de fertilización química, mostraron al inicio del estudio plantas con síntomas característicos de la enfermedad los cuales se distinguen porque aparecen manchas oscuras en el cuello de la raíz, que provoca que la planta se marchite y muera. Las plántulas se marchitan y se pudren cuando la infección ocurre en los semilleros (^{Guigón-López y González-González, 2003}). Por su parte los tratamientos a base de consorcios no mostraron síntoma alguno. A los 28 ddi, se observó que el tratamiento a base de HMA, fue el más susceptible en esta etapa, quedando en segundo orden el testigo control y el de fertilización química (Tabla 2); por su parte aquel a base de la coinoculación de ambos consorcios (MHA+Rpcv), se mantuvieron sin mostrar los síntomas de la enfermedad.

Al cabo de 36 ddi, el testigo control, manifestó un alto porcentaje de plantas muertas (50%) en comparación del T2 y el Tratamiento a base de fertilización química. Por su parte el tratamiento con ambos consorcios fue el menos afectado. Un similar comportamiento fue registrado a los 40 ddi, sobresaliendo como el más sano, el tratamiento a base de (MHA+Rpcv). El testigo control resultó el más afectado por el agente en estudio P. capsici (Tabla 2). Diversos estudios muestran que la protección de las plantas contra enfermedades ocasionadas por hongos fitopatógenos (^{Gholami et al., 2009}; Lugtenberg et al., 2009), puede ser favorecida por los HMA y las Rpcv, los cuales presentan un control biológico en contra de Phytophthora, Fusarium, Rhizoctonia y otros agentes fitopatógenos (Kloepper et al., 1978; ^{Rai, 2001}).

A los 45 ddi, se realizó la evaluación final del ataque de P. capsici en el desarrollo de las plantas de chile. Los análisis arrojaron que los genotipos o cultivares más susceptibles fueron los chiles tipo Jalapeños (95%), los tipo Puyas (62.5%) y los tipo Serranos (75%), mientras que los menos vulnerables fueron los Pasilla (37.5%), tipo Ancho (50%) y tipo Guajillo con 37.5% (Tabla 3). Se pudo apreciar que el T2 en los tipo Serrano, no repercutió en una protección a la planta; este comportamiento del T2, resultó similar para todos los restantes tratamientos y para el Testigo control. Lo contrario ocurrió con el T3, ofreciendo resultados favorecedores en comparación del T4 a base de fertilización química (Tabla3).

Los 23 cultivares de chile en estudio, agrupados estos en los tipo Pasillas, Anchos, Guajillos, Puyas, Serranos y Jalapeños, evaluados en el presente estudio, muestran una respuesta favorable evitando una infección de P. capsici cuando éstos son coinoculados con HMA y Rpcv; resultados que concuerdan con aquellos de ^{Frey-Klett et al. (2007)} y Kloepper et al. (1978), citado por ^{Rai, (2001)}, donde señalan la acción de “biocontrol” de Phytophthora, Fusarium y Rhizoctonia figuran ciertos mecanismos como son la antibiosis, parasitismo, sideróforos, y resistencia sistémica inducida, principalmente (^{Gholami et al., 2009}; Lugtenberg et al., 2009). Cabe indicar que aquellas plantas del tratamiento a base de fertilización química, resultaron con altos porcentajes de plantas infectadas por el fitopatógeno en estudio, lo cual fue evidenciado en las “pruebas de Koch” descrito en el apartado metodológico (Detección de células microbiológicas adheridas al sistema radicular de chile).

Al finalizar el estudio, se pudo apreciar que las seis cepas del HMA Rhizophagus intraradices con las claves Zac-19, Ced-20, Tab-21, Mér-22, Pap-23, Jal-24 y, las cepas de Rpcv, de Pseudomonas y que corresponden a P. lini, P. fluorescens, Acinetobacter guillouiae y una del género-especie Aeromona caviae, al ser analizados en las raíces de las plantas de los diferentes cultivares de chile, se identificaron células y/o esporas de los microorganismos en estudio (Tabla 4).