Localización

El estudio se estableció en la localidad “La casa” en el ejido de Cumbres de Huicicila, en el Municipio de Compostela, Nayarit (21° 01´ 48´´ latitud N y 105° 0´45´´ longitud W y 860 msnm). La huerta se considera como un sistema productivo rústico tradicional o de montaña (^{Moguel y Toledo, 1999}), con tendencia a orgánico, de temporal, café tipo arábiga, de tres años con Catimor (Caturra X Hibrido Timor) y Típica, con cosecha durante los meses de diciembre a febrero, con reporte de alta incidencia de la roya del café en ciclos anteriores, la vegetación empleada como sombra abarca guamo (Inga spp.), cuero de indio (Bursera simaruba (L.) Sarg. 1890) tepehuacate (Lysiloma acapulcense (Kunth) Benth.), tepezapote (Ternstroemia tepezapote Schltdl. & Cham.) y forma parte de la provincia fisiográfica de la Faja Volcánica Transmexicana, con clima cálido subhúmedo con vegetación considerada como selva baja caducifolia y selva perennifolia (^{INEGI, 2010}).

Recolecta de muestras para aislamiento de Trichoderma y Lecanicillium

Las cepas empleadas en el estudio se aislaron del suelo y follaje de huertos de café de las zonas cafetaleras de Nayarit en los municipios de Tepic, Xalisco, San Blas, Rosamorada, Compostela, Ruíz y Santiago Ixcuintla. Se realizaron recolectas en octubre y noviembre del 2021 de un total de 15 huertos que no han sido perturbados por actividades agrícolas y con abundante vegetación. Las muestras obtenidas fueron de suelo y follaje de cafetos, raíces de gramíneas, raíces adventicias y hojas de árboles silvestres. En el caso de las muestras de suelo, éstas se tomaron debajo de la copa de tres árboles por huerto, así mismo se quitó la hojarasca superficial y se obtuvo 1.0 kg de muestra compuesta de los primeros 30 cm de profundidad de suelo, mientras que del follaje de los mismos árboles se consideraron 10 hojas por planta. En el caso de las raíces adventicias se cortaron pedazos de raíz de seis árboles por huerto diferentes a los seleccionados para muestras de suelo. Posteriormente las muestras se trasladaron al Laboratorio de Fitopatología del Campo Experimental Santiago Ixcuintla, del INIFAP-Nayarit para su almacenamiento y procesamiento.

Aislamiento y selección de cepas

Las cepas de Trichoderma y Lecanicillium se aislaron a partir de muestras de suelo mediante la técnica de diluciones seriadas (proporción de 1.0 gramo de suelo por 9.0 mL de agua estéril, respectivamente). Estas muestras se sembraron en cajas Petri de 9.0 cm de diámetro, utilizando medio de cultivo PDA. Posteriormente, se realizaron resiembras sucesivas hasta obtener cultivos puros, de los cuales se obtuvieron cepas monospóricas, siguiendo la metodología descrita por ^{Gilchrist-Saavedra et al. (2005)}. En el caso del follaje y las raíces adventicias, se realizaron raspados del tejido vegetal donde se observaba crecimiento micelial, y se sembraron por estriado en el medio utilizando un asa bacteriológica. Posteriormente, se llevó a cabo la identificación morfológica de las cepas de Trichoderma spp., siguiendo la guía taxonómica de ^{Siddiquee (2017)}, donde se consideraron características macroscópicas como la forma y disposición de conidios y conidióforos, fiálides y clamidosporas, así como la textura del micelio, la formación de anillos concéntricos y la pigmentación de los conidios. En cuanto a las cepas de Lecanicillium spp., su identificación se basó en claves taxonómicas tanto generales como específicas (^{Humber, 1997}; ^{Zare y Gams, 2004}).

De las cepas aisladas, tanto del suelo como de follaje y raíces adventicias, se determinó su capacidad de crecimiento radial y velocidad de esporulación. Se seleccionaron aquellas que mostraron el crecimiento más rápido y una mayor rapidez en la esporulación. Se obtuvieron 12 cepas de Trichoderma (1, 4, 6, 9, 11, 13, 15, 25, 27, 28, 31, 39) y tres de Lecanicillium (1, 3 y 4) (Tabla 1). Para su evaluación en campo las cepas se incrementaron en cajas Petri con medio de cultivo PDA. Se realizó un conteo del número de esporas mediante un hematócimetro para obtener una concentración de 1.0 x 10⁸ esporas por mL. Los tratamientos (cepas) se aplicaron con mochila Swissmex de 15 L, con boquilla de cono para insecticidas. A todos los tratamientos se les adicionó adherente Inex® a dosis de 1.0 ml/L de agua más 10 mL de Tween 20® para provocar la emulsión, en total se realizaron cinco aplicaciones con intervalo cada siete días.

Pruebas en fase de campo para el control de roya

Se realizaron de septiembre de 2021 a enero de 2022, en un diseño en bloques completos al azar con 16 tratamientos (15 cepas más un testigo absoluto) y 20 repeticiones por tratamiento, considerando un árbol como unidad experimental. En cada unidad experimental se marcó la hoja central de la rama donde se determinó la incidencia en la rama y la severidad de la enfermedad en dicha hoja.

Para la incidencia se contaron las hojas presentes en la rama seleccionada y las hojas con daño y se determinó el porcentaje de hojas dañadas (^{SENASA, 2013}; ^{Julca et al., 2019}). Mientras que para la severidad se recolectó la hoja marcada y se determinó el grado de daño acorde a la escala de Eske, 1983 (Figura 1); la cual considera los siguientes niveles: 0 = sano, 1 = leve, 2 = moderada, 3 = alta y 4 = muy alta. Donde el nivel l, es cuando existen pústulas en 1 - 5 % de la superficie de la hoja, nivel 2 se presentan pústulas en 6 - 20 % de la superficie de la hoja, nivel 3 se observan pústulas en el 21 - 50 % de la superfcicie de la hoja y el nivel 4 cuando hay > 50 % de la superficie de la hoja afectada. Los datos obtenidos se transformaron a media ponderada de la infección (^{Townsend y Heuberger, 1943}) mediante la siguiente formula:

Figura 1 Escala para determinar la severidad del daño por roya en hojas de café. 

Figure 1 Scale to determine the severity of rust damage in coffee leaves. 

Donde: PI= media ponderada de infección, n = número de hojas por cada clase en la escala, v = valor numérico de cada clase, CM= categoría mayor, N = número total de hojas en la muestra. Para su análisis, los datos se transformaron a raíz cuadrada de X+0.5 para disminuir la varianza y se analizaron mediante el paquete estadístico SAS ver 9.2 (^{SAS, 2010}) y las diferencias entre medias se compararon mediante Tukey al 0.05 %. Para determinar la efectividad biológica de los tratamientos, se aplicó la fórmula de ^{Abbott (1987)}:

Donde: % E = porcentaje de efectividad, IT = infección en el testigo, It = infección en el tratamiento.

Antes de la aplicación de los tratamientos, donde se detectó una infestación inicial de la enfermedad se realizó un blanqueo, el cual consistió eliminar todas las hojas dañadas.

Incidencia

Todos los tratamientos de control biológico fueron estadísticamente diferentes con respecto al testigo, siendo este último el que mostró la mayor incidencia de roya (Tabla 2). En términos generales, los tratamientos basados en Lecanicillium exhibieron una menor incidencia de roya en comparación con los tratamientos de Trichoderma, con la excepción de la cepa 39. La cepa de Trichoderma con un rendimiento inferior fue la cepa 13, aunque no difirió significativamente de la mayoría de las cepas de Trichoderma evaluadas. En cuanto a esta variable, se observó la menor incidencia de roya en los tratamientos con Trichoderma 39 y Lecanicillium 1. El grado de parasitismo generado por estos dos organismos contra H. vastatrix también fue reportado por ^{Halpay et al. (2020)} en condiciones de laboratorio.

Severidad y porcentaje de infestación

En relación con la severidad de la roya en las hojas bajo tratamiento de control biológico (Tablas 3 y 4), se observó que todos los tratamientos fueron estadísticamente diferentes al testigo. Las cepas que exhibieron un menor grado de severidad de daño fueron Trichoderma 39 (valor de 1.04), Lecanicillium 1 (valor de 1.24), Lecanicillium 3 (valor de 1.25) y Lecanicillium 4 (valor de 1.29). Estos niveles de severidad encontrados en la presente investigación son comparables a los reportados por ^{Alomía-Lucero y Cosigna-Eslava (2021)}, quienes registraron valores de severidad de daño de 0.93 con el uso de Lecanicillium y 1.27 con Trichoderma. Por otro lado, las cepas de Trichoderma 11 y 13 mostraron un rendimiento inferior, aunque no difirieron estadísticamente de las cepas 9, 6, 15, 28, 4, 25, 27 y 1. Las cepas de mejor desempeño fueron Trichoderma 39 y 31, así como Lecanicillium 1, 3 y 4.

Los valores de infestación (PI) variaron del 10 al 36.25 % en los tratamientos con control biológico, mientras que en el testigo fue del 85 %, los de menor PI fueron los tratamientos con Lecanicillium y Trichoderma 39 con PI del 10 - 15 %, estos resultados son inferiores a los obtenidos por ^{Alomía-Lucero y Cosigna-Eslava (2021)}, quienes reportaron valores de 35 a 36.47 % de infestación utilizando la combinación de Trichoderma y Lecanicillium. En general los tratamientos con control biológico presentaron un 70 % de efectividad con excepción de la cepa 13 de Trichoderma. Los mejores tratamientos fueron las tres cepas de Lecanicillium y la cepa Trichoderma 39 con 80 % de efectividad. ^{Gómez-De la Cruz et al. (2017)} reportan que Lecanicillium spp., presentó un nivel de control de 68.10 %, a las 120 horas posteriores a la inoculación con roya del café. Estos datos son inferiores a los encontrados en esta investigación. ^{Arriola et al. (1998)} mencionaron que el porcentaje de parasitismo de Lecanicillium sp., varía entre especies y aislamientos.

Al aplicar los tratamientos de control biológico con Trichoderma y Lecanicillium, los niveles de daño en las hojas (ver Tabla 4) se sitúan predominantemente en las categorías 1 y 2, mientras que en ausencia de control, los niveles de daño alcanzan las categorías 3 y 4, como se observa en el testigo. Este fenómeno se atribuye a la capacidad del Trichoderma como hongo micoparásito, el cual ataca, penetra y elimina al hongo H. vastatrix (^{Vidal-Martínez et al., 2021}). ^{León et al. (2019)} corroboraron que Trichoderma genera un 100% de micoparasitismo, gracias a los metabolitos que inhiben el crecimiento micelial de H. vastatrix, promoviendo así la obtención de niveles bajos de daño. De manera similar, ^{Díaz-Vicente et al. (2014)} señalan que Lecanicillium lecanii ha sido identificado como micoparásito de H. vastatrix.

El nivel de parasitismo inducido por los dos organismos (Trichoderma y Lecanicillium) sobre H. vastatrix fue también documentado por ^{Halpay et al. (2020)} en condiciones de laboratorio. Los grados de severidad identificados en este trabajo de investigación son consistentes con los informados por ^{Alomía-Lucero y Cosigna-Eslava (2021)}, quienes señalan valores de severidad de daño de 0.93 y 1.27 para Lecanicillium y Trichoderma, respectivamente.

El hongo antagonista Trichoderma spp., se ha utilizado como agente de control biológico para combatir enfermedades de plantas causadas por hongos fitopatógenos. Este hongo afecta el desarrollo de los fitopatógenos al competir por recursos, producir antibiosis, alimentarse de ellos mediante enzimas líticas y micoparasitismo (^{Fravel, 1988}; Ghrisalberti y Sivacithamparam, 1991; López-Ferrer et al., 2017). Además, se ha reportado que Trichoderma induce mecanismos de resistencia al producir fitoalexinas, flavonoides y derivados fenólicos (Vinale et al., 2010; Mukerjhee et al., 2013) y promueve el crecimiento vegetal mediante la producción de sideróforos que facilitan la absorción de nutrientes y fitohormonas (^{Castro y Revillas, 2005}; Ortuño et al., 2013; Candelero et al., 2015). Estos mecanismos favorecen el control de hongos fitopatógenos (^{Jensen y Wolffhechel, 1995}; Martínez et al., 2013; Candelero et al., 2015). La combinación de estas estrategias muestra efectos sinérgicos, lo cual es especialmente importante en condiciones de campo. En este experimento, se observó que la aplicación en campo con algunas de las cepas de Trichoderma aisladas logró disminuir la incidencia y severidad de H. vastatrix, lo cual contribuyó a la reducción del daño por roya en hojas de café. Además, se ha reportado la actividad antagónica in vitro de cepas de Trichoderma spp. hacia hongos fitopatógenos como Fusarium oxysporum, F. solani, Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides y Alternaria alternata, con porcentajes de inhibición superiores al 60 %. Por lo tanto, Trichoderma representa una alternativa para el control biológico de enfermedades causadas por hongos fitopatógenos (Rubio-Tinajero et al., 2021; Savin-Molina et al., 2021). En general, el desempeño de una cepa de Trichoderma en el campo es el resultado de diferentes estrategias, como la competencia, la antibiosis y el micoparasitismo, que influyen en su capacidad para controlar los fitopatógenos. Por lo tanto, el uso de consorcios de cepas puede ser una buena opción para potenciar el efecto de cada una de ellas (^{Pérez et al. 2015}).

Lecanicillium spp., el segundo hongo antagonista que se evaluó en este experimento, se ha utilizado como agente de control biológico en regiones tropicales. Sin embargo, es necesario considerar el efecto de factores abióticos como la humedad relativa (HR) y la temperatura para seleccionar cepas con mayor potencial como agentes microbianos fúngicos (Kamney, 2008). ^{Alavo y Accodji (2004)} informaron que la eficacia de L. lecanii es mayor en condiciones de alta humedad relativa, lo que puede limitar su eficacia, especialmente en condiciones de campo con ambientes secos o de baja HR. Por otro lado, ^{Ayala-Zermeño et al. (2020)} estudiaron el efecto de diferentes temperaturas en el crecimiento de cultivos polispóricos, monospóricos y cepas de referencia de Lecanicillium lecanii, observando que todos los hongos estudiados presentaron la mayor tasa de crecimiento a 25 °C y ninguno creció a 35 °C, lo cual sugirió que este micoparásito es más tolerante a temperaturas más frescas, ya que encontraron diferencias significativas en la tasa de crecimiento de los cultivos polispóricos, monospóricos y cepas de referencia a 15, 25 y 30 °C, lo que indicó la variabilidad intraespecífica del hongo. Para el caso de este experimento, se determinó que las cepas de Lecanicillium disminuyeron de manera significativa la incidencia y severidad de H. vastatrix, estos efectos probablemente pudieron estar asociado a las temperaturas que prevalecieron en el periodo que se realizaron las aplicaciones del hongo (diciembre y enero), donde la temperatura máxima promedio fue de 29 °C en ambos meses, y la temperatura mínima promedio fue de 17 °C en diciembre y de 15 °C en enero (CONAGUA, 2024). En cuanto al control natural de la roya del café por L. lecanii, se ha mencionado la existencia de un mecanismo ecológico complejo que implica el mutualismo entre una hormiga (Azteca instabilis) y una escama (Coccus viridis). En este contexto, se observó que a medida que aumentaba la población de insectos, disminuía la incidencia de la roya y viceversa. La conclusión obtenida fue que, además de las condiciones ambientales, el mutualismo con insectos y otros hongos desempeñan un papel crucial en la densidad general de esporas de L. lecanii, favoreciendo así su presencia constante en el entorno (^{Cortez-Madrigal et al., 2003}; ^{Vandermeer et al., 2009}).