En el estado de Sinaloa, México, el moho blanco es una enfermedad que afecta a las plantas de frijol en cualquiera de las etapas de desarrollo, su incidencia y severidad varía en función de la humedad invernal y de las poblaciones del hongo en el suelo, llega a reducir el rendimiento hasta 75%, de ahí que se le considere la enfermedad fúngica más importante de este cultivo (^{Apodaca et al., 2011}). Los agricultores comúnmente intentan manejar la enfermedad mediante aspersiones de fungicidas convencionales, cuya eficacia frecuentemente es baja porque: a) no se utilizan los ingredientes adecuados; b) son aplicados con una mala cobertura sobre las plantas; y c) y es posible que exista selección de resistencia a estos plaguicidas, entre otras razones. Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar la efectividad de fungicidas convencionales y biorracionales contra S. sclerotiorum in vitro.

El estudio se realizó en el Laboratorio de Fitopatología de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte- UAS, Juan José Ríos, Sinaloa, durante la primavera de 2013.

Aislamiento de S. sclerotiorum. Se colectaron plantas de frijol infectadas con moho blanco, en el Valle del Fuerte, Sinaloa. Para aislar al hongo, se cortaron trozos de tejido infectado en el borde de la lesión en los tallos y vainas. El material se desinfectó con hipoclorito de sodio al 5% durante treinta segundos; luego se lavó tres veces con agua destilada estéril y se secó con servilletas de papel esterilizadas. Finalmente cinco trozos de tejido de cada muestra se colocaron en una caja Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA, Bioxon^®) y se incubó a 18-20 °C. Con el fin de obtener cultivos puros, a las 24-48 h, del borde de las colonias en crecimiento activo, se cortaron pequeñas porciones de puntas de hifa mediante una aguja esterilizada, mismas que se transfirieron a cajas con PDA. Los aislados purificados se preservaron en tubos de cultivo con PDA a 4-6 °C hasta su utilización en los bioensayos.

Ensayo con fungicidas convencionales. Se evaluaron 10 productos fungicidas (Cuadro 1), que se encuentran registrados por SENASICA -SAGARPA para el control de S. sclerotiorum en frijol [com benomyl, boscalid + pyraclostrobin, carbendazim, fluazinam, metil-tiofanato y pyrimethanil, entre otros (^{Apodaca et al., 2011})] y otros fungicidas comerciales que se utilizan contra hongos del suelo o follaje en diversas especies vegetales. Cada fungicida se evaluó a1 menos en dos concentraciones (ppm); boscalid, boscalid + pyraclostrobin y fludioxonil + ciprodinil se evaluaron en tres concentraciones, generándose un total de 23 tratamientos químicos más el testigo agua.

Cuadro 1 Efecto de fungicidas sintéticos convencionales sobre el crecimiento miceliar de S. sclerotiorum in vitro. 

1. PHC Mil Stop, Plant Health Care; 2. Cantus, Basf; 3. Cabrio, Basf; 4. Bavistin, Basf; 5. Shogun, Syngenta; 6. Switch, Syngenta; 7. Vigold, Bayer; 8. Kasumin, Arysta; 9. Cueva, Mitsui de Mexico; 10. Sportak, Bayer. 11. Testigo agua. Los datos transformados a raíz cuadrada (√x+0.5) antes de análisis. Medias con misma letra en cada columna no son significativamente diferentes (Tukey α= 0.05).

Se seleccionó al azar un aislado de S. sclerotiorum, mismo que en condiciones asépticas se transfirió, del tubo con PDA donde se hallaba preservado, al centro de placas con PDA. Las cajas se incubaron a a18-20 °C durante cinco días. Los fungicidas, se incorporaron a las concentraciones deseadas en matraces con PDA recién esterilizado, cuando éste se hallaba aproximadamente a 45 °C y de inmediato se dispensaron en cajas Petri desechables (8 cm de diámetro) esterilizadas. Enseguida en el centro de cada una de las cajas tratadas, se colocó una rodaja circular de 1 cm de diámetro de PDA-hongo. El testigo se estableció en PDA sin fungicida.

Se utilizó un diseño completamente al azar; la unidad experimental consistió de una caja Petri sembrada con el hongo. El efecto de los tratamientos se evaluó a las 48, 96 y 144 h, midiendo el radio de la colonia del hongo en las cinco repeticiones de cada tratamiento.

Ensayo con fungicidas biorracionales. Se probaron 10 ingredientes (Cuadro 2), de los que se desconocía su toxicidad hacia S. sclerotiorum. El ensayo se estableció de manera similar a la descrita para los fungicidas sintéticos, pero en este caso se incubó a 14-16 °C; se utilizaron tres repeticiones por tratamiento, y el efecto de los tratamientos se evaluó a las 48, 96 y 240 h.

Cuadro 2 Efecto de fungicidas biorracionales sobre el crecimiento micelial de S. sclerotiorum in vitro. 

1. Compuesto químico; 2. Serenade; 3. Oxidate; 4, 5, 6 y 7. Extractos artesanales. 8. Fractal; 9. Spectra10. Citripower; 11. Testigo agua. CAN= complejo de antibióticos naturales. Los datos se transformaron a raíz cuadrada (√x+0.5) antes de su análisis. Medias con la misma letra en cada columna no son significativamente diferentes (Tukey α= 0.05).

Los datos obtenidos del radio de la colonia, se transformaron a raíz cuadrada para homogenizar las varianzas (^{Little y Hills, 1989}); después se sometieron a un ANOVA y las medias aritméticas se compararon mediante la prueba de Tukey (p = 0.05) a través del programa ^{SAS, versión 9.0 (2002)}.

Efectividad biológica de fungicidas convencionales. Después de las 48 h de sembrado el hongo, el menor radio de la colonia (p< 0.0001) de S. sclerotiorum se registró en las concentraciones evaluadas de boscalid (excepto la de 0.25 ppm) + pyraclostrobin, carbendazim, fluazinam, fludioxonil+ciprodinil, fluoxastrobin y procloraz. En contraste, los tratamientos con kasugamicina, octanato de cobre y bicarbonato de potasio (dosis baja), fueron similares al testigo (Cuadro 1).

A las 96 y 144 hds boscalid + pyraclostrobin, carbendazim, fluazinam, fludioxonil+ciprodinil y procloraz, en todas las concentraciones evaluadas, mantuvieron la mayor supresión de la colonia (p< 0.0001), tal y como se observó a las 48 hds. El bicarbonato de potasio, 4.25 ppm, así como las dos dosificaciones de kasugamicina y octanato de cobre, permitieron un desarrollo similar o mayor que el testigo. El fluoxastrobin, en las dos concentraciones probadas, y el boscalid (5. 0 y 0.5 ppm), con buen efecto de control a las 48 hds, permitieron el crecimiento significativo del micelio del hongo a las 96 y 144 hds (Cuadro 1).

Al final del ensayo, boscalid+pyraclostrobin, carbendazim, fluazinam, fludioxonil+ciprodinil y procloraz inhibieron en mayor proporción el crecimiento de S. sclerotiorum, en todas las concentraciones e intervalos de tiempo probados. Esto corrobora lo encontrado por otros investigadores ( ^{Walter et al., 2005}; ^{Junior et al., 2008}). En otro estudio in vitro, el carbendazim a 1 ppm inhibió en 90% el crecimiento micelial del hongo mencionado (^{Martínez-Pérez, 2008}). En tanto en el presente estudio, carbendazim 0.25 ppm redujo significativamente el desarrollo del aislado S. sclerotorium de Sinaloa. El carbendazim ha sido ampliamente utilizado en el norte de Sinaloa. Sin embargo, al igual que otros bencimidazoles, su eficacia disminuye cuando la presión del inóculo es alta y el ambiente es favorable al hongo. En éste sentido, es importante determinar si el uso prolongado de bencimidazoles, por más de 30 años en la región, ha provocado la pérdida de sensibilidad de algunas poblaciones.

La inhibición in vitro de S. sclerotiorum con fluazinam no es de sorprender ya que este fungicida es uno de los más eficaces contra el moho blanco a dosis de 0.5 L ha-1. En la literatura se reporta una supresión del micelio de este hongo, a concentraciones tan bajas como 0.1, 1 y 10 µL L-1 (^{Junior et al., 2008}).

Desde hace más de 10 años el carbendazim y el fluazinam son ampliamente utilizados contra moho blanco en frijol, en el norte de Sinaloa. En las últimas temporadas los fungicidas más usados son boscalid + pyraclostrobin; el fludioxonil + ciprodonil y el procloraz se representan nuevas alternativas para el control químico de moho blanco en frijol.

Efectividad biológica de fungicidas biorracionales. A las 24 hds, el crecimiento del hongo fue nulo en todos los tratamientos, excepto en el testigo, cuyo radio de la colonia fue de 4 mm, aunque estadísticamente no hubo diferencia entre los tratamientos.

A las 48 hds, el hongo fue suprimido en 100%, por el ácido salicílico, dióxido de hidrógeno, así como por extractos de citronela, clavo y semilla de toronja en sus dos concentraciones; también con la concentración de 1 000 ppm de los extractos de canela y ajo. En cambio, el extracto de canela 500 ppm y las dos concentraciones de extracto de semilla de cítricos, ESC+quercetina+complejo de antibióticos naturales (CAN), se comportaron de forma similar al testigo (Cuadro 2).

A las 72, 96 y 120 hds, la supresión del hongo se mantuvo con ambas dosificaciones del ácido salicílico, dióxido de hidrógeno, extractos de semilla de toronja y con la concentración de 1 000 ppm de ajo y citronela. Por el contrario, el extracto de canela en concentración de 500 ppm y las dos dosis de ESC+Quercetina+CAN presentaron un crecimiento similar al testigo. También la concentración de 500 ppm del extracto de ajo a los 96 y 120 hds tampoco disminuyó el desarrollo de S. sclerotiorum con respecto al testigo (Cuadro 2).

Al finalizar el bioensayo con sustancias biorracionales (240 hds), las dos concentraciones evaluadas de ácido salicílico, dióxido de hidrógeno y extracto de semilla de toronja, así como 1 000 ppm de extracto de citronela mantuvieron un control absoluto del hongo. La eficacia de diferentes tratamientos disminuyó a medida que transcurrió el tiempo. El extracto de ajo y citronela en concentración de 500 ppm, así como el extracto de cítricos y la mezcla extracto de semilla de cítricos ESC+Quercetina+CAN, en sus dos concentraciones, mostraron un desarrollo de la colonia mayor a la del testigo (Cuadro 2).

Estos resultados sugieren que algunos compuestos poseen el potencial de controlar al moho blanco en condiciones de campo. Se sugiere confirmar dicha eficacia evaluando el efecto de diferentes dosis, intervalos de aplicación, entre otros ensayos. También es necesario evaluar el posible efecto fitotóxico. En otro sentido, los extractos de semilla de toronja y de citronela, podrían también ser efectivos en el tratamiento de frutos y verduras en post-cosecha, en donde S. sclerotiorum puede ser potencialmente importante (^{Agrios, 2005}), dado que los frutos recién cosechados pueden presentar infecciones incipientes, que al paso de pocos días se manifiestan en severas pudriciones en el almacén o anaquel.

Aunque el moho blanco se puede controlar con fungicidas sintéticos, éstos son costosos, además del impacto negativo al ambiente, de ahí que se haya incentivado incentivado el uso de sustancias biorracionales que puedan sustituir a corto plazo a las sustancias químico-sintéticas (^{Stauffer et al., 2000}). Con relación a lo anterior, al ácido salicílico le considera como un activador de los mecanismos de resistencia sistémica adquirida (SAR) por sus siglas en inglés en plantas contra el ataque por patógenos, estrés por frío, radiación UV y estrés osmótico (^{Conrath et al., 1995}), a lo anterior hay que agregar, que a las concentraciones probadas resultó fungitóxico in vitro. El dióxido de hidrógeno es un fungicida de contacto y preventivo, cuya acción desinfectante de amplio espectro incluye hongos y bacterias fitopatógenas. Este desinfectante (1000 ppm) controló a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en tezontle y solución nutritiva, por lo que tiene potencial de utilizase en hidroponía contra esta enfermedad (^{García- Jiménez, 2012}). El extracto de semilla de toronja ha demostrado su capacidad in vitro para matar o inhibir el crecimiento de una gran cantidad de bacterias potencialmente perjudiciales, hongos, virus y protozoarios parásitos (^{Trapman, 2004}); además de ser un microbicida natural de amplio espectro, es un antioxidante biodegradable, no es tóxico a animales, ni es corrosivo. Finalmente, el aceite esencial de citronela Cymbopogon nardus (L.) Rendle con buen nivel de control de S. sclerotiorum, también mostró actividad fumigante sobre los hongos Aspergillus spp., Colletotrichum musae y Pyricularia grisea (^{Aguiar et al., 2014})