Introducción

En los estudios de fisiología y mejoramiento genético de cultivos se realizan muestreos para registrar el número de granos por m², por espiga y el peso de mil granos, las cuales son variables importantes para evaluar la interacción de los genotipos con el ambiente e identificar los más sobresalientes (^{Pietragalla y Pask, 2013}) y para conocer los mecanismos involucrados en la producción del grano (^{Severini et al., 2011}). Además, se contabilizan y preparan cientos de miles de muestras para enviar a otros sitios de evaluación y selección de genotipos; aunque el número de granos puede calcularse con sistemas computacionales especializados o contadores electromecánicos, su costo en México propicia que el registro se realice de manera manual.

También se utilizan muestras de granos de trigo para evaluar el tamaño y la forma, que son importantes en los objetivos del mejoramiento genético, pero es poco su estudio debido a la dificultad de su medición (^{Gegas et al., 2010}). El tamaño es componente significativo del rendimiento (^{Tanabata et al., 2012}; ^{Williams y Sorrells, 2014}) y contribuye en el vigor de germinación (^{Whan et al., 2014}); asimismo, se relaciona con la calidad de molienda (^{Williams et al., 2013}). La cuantificación manual generalmente es exacta, pero requiere mano de obra, es tediosa y debido al tiempo que requiere se utilizan muestras limitadas (^{Maloney et al., 2014}).

El registro de mil granos de trigo para obtener su peso, se puede acelerar con el uso de bandejas con rejillas para separar 100 granos. Otra opción es registrar (a mano o contador) y pesar sólo 200 granos; o bien, el número de granos en 10 g y se realiza la conversión respectiva (^{Pietragalla y Pask, 2013}), aun así cuando el conteo se realiza en forma continua provoca cansancio y aumentan los errores (^{Zhang et al., 2005}). ^{Mebatsion et al. (2013)} señalan que el análisis visual de granos es subjetivo, influenciado por factores humanos y condiciones de trabajo.

La obtención tradicional de la longitud y el ancho de los granos requiere técnicas más laboriosas y medición individual (^{Whan et al., 2014}), con mayor consumo de tiempo, aunque se utilicen calibradores digitales. ^{Tanabata et al. (2012)} sugieren que éstos análisis son más eficientes, rápidos y precisos a través del procesamiento y análisis de imágenes digitales (PAID), debido a que facilita información consistente, eficaz y objetiva (^{Mebatsion et al., 2013}). Los avances en los procesadores computacionales, en los sistemas de adquisición de imágenes y la reducción del precio de los mismos, favorecen el implemento del PAID (^{Cleva et al., 2013}).

Las imágenes con granos agrupados o en contacto entre sí, dificultan el análisis (^{Mebatsion et al., 2013}), ignorar u omitir tal situación provoca mediciones erróneas (^{Lin et al., 2014}). Para evitar dificultades, en varios estudios sobre medición de granos de trigo mediante PAID, éstos se colocaron separadamente (^{Mebatsion et al., 2013}; ^{Rasheed et al., 2014}; ^{Williams y Sorrells, 2014}; Mussadiq et al., 2015). La separación física de los granos por cualesquier medio es impráctica (^{Mebatsion et al., 2013}), por el tiempo que requiere, pero puede resolverse con el desarrollo de algoritmos eficientes en separar los granos en contactos en la imagen (^{Lin et al., 2014}). Otro riesgo es sub o sobrestimar el número de granos; sin embargo, se puede reducir con restricción del tamaño y la circularidad o forma de los objetos de interés, si no está entre los valores especificados se ignoran (^{Ferreira y Rasband, 2012}).

Debido a los inconvenientes que presentan la obtención de las dimensiones y el registro manual de granos de trigo, el objetivo en el presente estudio fue analizar el tamaño y número de granos de trigo mediante procesamiento de imágenes digitales.

Materiales y métodos

Las variedades utilizadas fueron Cirno C-2008, Roelfs F-2007, Kronstad F-2003 más cuatro líneas de trigo duro y tres harineras (Cuadro 1), provenientes del programa de mejoramiento genético de trigo del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), las cuales se cosecharon en el Campo Experimental Valle del Fuerte (Guasave, Sinaloa), durante el ciclo otoño-invierno 2012-2013.

Cuadro 1 Identificación de genotipos utilizados. 

ID= identificación del genotipo; Triticum durum Desef. (1 al 5); Triticum aestivum L. (6 al 10).

La adquisición de las imágenes se realizó con escáner de cama plana (Epson Stylus modelo CX4700), las muestras de grano se distribuyeron rápidamente sobre el cristal, sin esmerarse en separarlos. En la parte inferior de la tapa del escáner se colocó papel foamy (etilvinilacetato) negro, para evitar el ruido por la proyección de sombras causadas por la luz ambiental y permitió un mejor contraste de los granos.

Las imágenes se guardaron en formato jpeg, a color RGB (Red, Green, Blue) con 24 bits por pixel y resolución de 300 ppp, de 2 544*3 508 pixeles (ancho*alto); el tamaño promedio por archivo fue de 760 KB. El tiempo para digitalización fue 14.2 s y el total desde colocar la muestra de grano hasta finalizar fue 55 s, en un equipo con Windows 7 Ultimate (64 bits), procesador AMD Phenom^™ X3 B73 a 2.8 GHz y 3 GB de memoria RAM.

La metodología se desarrolló con cuatro muestras de 200 granos enteros y limpios de cada variedad y se obtuvo el peso de éstas. La validación del método fue con 277 muestras de tamaño variable de granos enteros y quebrados, en total se utilizaron 317 imágenes con 155 637 granos.

El PAID se realizó con el programa ImageJ Ver. 1.49b, el cual soporta diferente formatos de imagen; admite establecer y calibrar la escala en cualquier unidad espacial, permite restringir del análisis objetos por tamaño y forma, la cual es de 0 (polígono alargado) a 1 (esférica), proporciona estadísticas descriptivas de los resultados (^{Rasband, 2014}). Incluye la opción de crear rutinas o complementos para automatizar tareas repetitivas (^{Ferreira y Rasband, 2012}) y está disponible gratuitamente en la página electrónica del National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html).

La segmentación del color de las imágenes se efectuó mediante umbralización (Image/Adjust/Color Threshold), con el método por defecto (default), el cual es una variación del algoritmo Isodata (^{Ferreira y Rasband, 2012}); el espacio de color RGB original se transformó al espacio HSB, porque facilitó el análisis de la imagen; es decir, la identificación y localización de los granos de trigo. La diferenciación entre el fondo de la imagen y los granos se obtuvo mediante el ajuste de los umbrales mínimo y máximo, para tono fueron 0 y 255, para saturación 0 y 255, y para brillo 75 y 255. Posteriormente la imagen se convirtió a binaria; es decir, a blanco y negro (Process/Binary/Convert to Mask). La separación de los granos en contacto en la imagen se realizó con el algoritmo de transformación divisoria (Watershed), con tolerancia de 1 (Process/Binary/Watershed).

El número total de granos enteros y quebrados (NGC) se obtuvo con la función análisis de objetos (Analyze/Analyze particles) y se midió el tamaño o área proyectada de los granos (mm²), longitud (mm), ancho (mm) y forma (circularidad) de los mismos. La sobreestimación del total de granos, ocasionada por impurezas u objetos extraños, se redujo con restricción de tamaño (4 a 30 mm²) y por circularidad, debido a que el grano entero presentó la menor circularidad por ser alargado y fue de 0.4 a 1, de esta forma se incluyen los granos quebrados.

Los pasos anteriormente descritos se grabaron y guardaron en una rutina (macro), la cual permite calcular automáticamente la escala de cualesquier tamaño de imagen mediante el ancho (getWidth) dividido entre la resolución, que en una imagen digitalizada con escáner es de 8.5 pulgadas (215.9 mm) como resultado de dividir 2 550 entre 300 (pixeles / pulgadas por pixel). La rutina analiza de forma automática todas las imágenes contenidas dentro de una carpeta, calcula el tiempo empleado en el procesamiento y análisis con la instrucción (getTime()), los resultados se guardan por separado o en un solo archivo delimitados por comas, etiquetados con el nombre del archivo (jpeg) para facilitar su identificación.

También se utilizó un contador electromecánico, semiautomático (NUMIGRAL SEED COUNTER EPL) para registrar la cantidad de 100, 200, 300, 400, 500 y 600 granos en cinco repeticiones, dichas muestras se contabilizaron mediante el PAID y en forma visual (NGO). Se registró el tiempo total (segundos) requerido por cada método.

Las datos se analizaron con InfoStat 2014 (^{Di Rienzo et al., 2014}) mediante las pruebas de normalidad y homogeneidad de varianzas, se realizó ANDEVA para peso de 200 granos, tamaño y ancho de grano y comparación de medias de Tukey (p≤ 0.01; 0.05). La variable largo de grano no presentó normalidad y se realizó un análisis de varianza no paramétrico de Kruskal-Wallis; el estadístico de prueba (H) fue una aproximación a la X² de Pearson al 1% (K-W≈X²), se realizó una comparación de pares entre las medias de los rangos de tratamientos. Entre NGO y NGC se realizaron correlaciones no paramétricas de Spearman (r_s), se aplicó regresión localmente ponderada (LOWESS), con parámetro de suavizado de 0.5 y prueba de bondad de ajuste (X²). Para el tiempo requerido por los métodos para registrar el número de granos se obtuvieron estadísticas descriptivas.

Resultados y discusión

El tamaño medio del grano de trigo fue desde 15.41 mm² en la variedad Kronnstad F2003 hasta 19.6 mm² del genotipo 4 (DMS= 1.274, p≤ 0.0001), las líneas 5 y 8 sobresalen en tamaño medio de grano, lo que sugiere efectividad de la selección hacia esta característica; el tamaño fue mayor en trigos de grano duro con 17.82 a 19.6 mm², mientras que en harineros fue de 15.41 a 18.37 mm² (DMS= 0.3850, p≤ 0.0001), similares a los obtenidos por ^{Visen et al. (2001)} mediante el análisis de fotografías digitales obtuvieron 22.5 mm² en granos de trigo cristalino ámbar del oeste de Canadá (CWAD) y 17.59 mm² en trigos rojos de primavera (HRS); asimismo, están dentro del intervalo de 11.68 a 24.52 mm² señalado por ^{Whan et al. (2014)}; pero son más grandes que los obtenidos por ^{Konopka et al. (2007)} en la variedad Nawra (12.6 a 15.91 mm²) que se cultiva en primavera, y en trigos de invierno variedad Sukces (13.28 a 14.74 mm²) y Tonacja (12.94 a 15.75 mm²). La variación en tamaño de los granos entre y dentro de trigos duros y harineros analizados en este estudio, así como los señalados por otros autores, se deben al efecto del genotipo, el ambiente y la interacción entre éstos (^{Breseghello y Sorrels, 2006}).

El genotipo 10 presentó menor longitud de grano (6.1 a 6.2 mm) y los más largos (7.6 a 7.8 mm) los mostró el genotipo 4 (H= 37.81, p≤ 0.0001); todos los trigos duros tuvieron más de 7.1 mm de largo, mientras que en los harineros la longitud de grano fue menor a 7.06 mm (H = 29.27, p≤ 0.001). El largo de grano de trigo duros fue desde 7.1 hasta 7.8 mm, longitud similar que la obtenida por ^{Konopka et al. (2007)} en la variedad Nawra (7.03 a 7.25 mm), en Sukces (6.55 mm) y Tonacja (6.86 mm); aunque son más largos que los reportados por ^{Ramya et al. (2010)} en dos localidades de India (Ludhiana, Punjab y Pune, Maharashtra), y cinco ciclos de producción de trigo harinero obtuvieron desde 5.1 mm hasta 5.37 mm. Pero son menos largos que los señalados por ^{Okamoto et al. (2013)} en cuatro líneas de trigo hexaploide, con el software Smartgrain obtuvieron desde 8.40 hasta 9.48 mm; la longitud de grano de los trigos harineros en el presente estudio (6.14 - 7.06 mm) fueron menores que los registrados por ^{Visen et al. (2001)} en trigo CWAD (8.03 mm) y en trigo HRS (6.99 mm).

El ancho medio del grano en los trigos harineros fue de 3.37 mm y en los trigos duros de 3.33 mm (DMS = 0.043, p≤ 0.05). Los genotipos 8 y 10 presentaron grano más ancho (3.47 mm); mientras que el grano más delgado (3.19 mm) lo presento la variedad Kronnstad F2003 (DMS= 0.191, p≤ 0.1). Los valores medios de ancho de grano fueron desde 3.19 hasta 3.47 mm y concuerdan con los obtenidos por ^{Rasheed et al. (2014)}, de 2.8 a 3.8 mm en los genotipos AUS30288 y AUS34239, respectivamente. Aunque son ligeramente más anchos que los reportados por ^{Visen et al. (2001)} en granos de trigo CWAD (3.27 mm) y HRS (2.91 mm); asimismo que los obtenidos en la variedad Nawra (2.41 mm) y Tonacja (3.04 mm) a través de fotografías digitales y el uso del software LUCIA G ver. 4.8 (^{Konopka et al., 2007}); son más delgados los registrados por ^{Ramya et al. (2010)} en Pune, Maharashtra, India, donde en 2007 fue de 2.17 mm y en Ludhiana, Punjab en 2003 fue de 2.97 mm. También ^{Okamoto et al. (2013)} obtuvieron granos menos anchos que fueron desde 2.86 hasta 3.16 mm.

El tamaño de grano en variedades de trigo emmer o farro (Triticum dicoccum Schübl) de 12.4 mm² y el ancho de 2.37 mm (^{Braadbaart y van Bergen, 2005}), son menores en comparación con los obtenidos en el presente estudio y los reportados por otros autores, es posible que se deba a que son trigos ancestrales, ya que el incremento en tamaño de grano se debe en parte al proceso evolutivo (^{Eckardt, 2010}) y al mejoramiento genético (^{Gegas et al., 2010}). ^{Shouche et al. (2001)} también obtuvieron grano más angosto (2.02 mm), menos largo (4.48 mm) y de menor tamaño de grano (14.15 mm²) en la variedad semienana Kalyansona (Triticum aestivum L.), en los estudios realizados por ^{Shouche et al. (2001) y Braadbaart y van Bergen (2005)} el grano se colocó sobre el escáner con la parte ventral hacia abajo, la cual es más angosta y proyecta menor área, no obstante el largo del grano no es afectado por esta situación, dado que las dimensiones están relacionadas entre sí, se debe considerar el lado del grano para la medición del ancho. En el presente estudio no se consideró dicho aspecto, pero debido a la forma afilada de la parte dorsal del grano de los genotipos utilizados, la probabilidad de que éste quede en vista lateral es 2:3 (dos lados y parte ventral).

La longitud de grano en las variedades de trigo emmer fue de 7.14 mm (^{Braadbaart y van Bergen, 2005}), similar con las obtenidas en el presente estudio y con las reportadas por otros autores (^{Visen et al., 2001}; ^{Konopka et al., 2007}), de acuerdo con ^{Sadras y Egli (2008)}, el largo de grano tarda menos tiempo en definirse con respecto al ancho, por lo que está menos expuesto a la influencia del ambiente; ésta comprobada por ^{Konopka et al. (2007)}, quienes señalan que la longitud del grano de trigo es menos afectada por estrés hídrico; en diversos estudios es evidente la mayor variación que presenta el ancho de grano, con respecto a longitud (^{Visen et al., 2001}; ^{Breseghello y Sorrels, 2006}; ^{Ramya et al., 2010}; ^{Wiwart et al., 2012}; ^{Williams et al., 2013}). La forma o circularidad del grano fue mayor en los granos de trigo harineros (0.7) y menor en los duros (0.66); el genotipo 10 presentó la mayor circularidad de grano con 0.74.

El peso de 200 granos en trigos duros fue de 8.42 a 11.25 g y difieren a los harineros que presentaron desde 6.19 a 9.79 g (DMS= 0.411, p≤ 0.01). La variedad Kronnstad F-2003 presentó el menor peso medio de grano (7 g), mientras que el genotipo cuatro sobresalió con 10.42 g (DMS= 1.362, p≤ 0.01). El peso de 200 granos presentó correlación lineal positiva con el tamaño (r= 0.94, p≤ 0.01), con el largo (r_s = 0.79, ≤ 0.01) y el ancho del grano (r= 0.63, ≤ 0.01), lo anterior concuerda con concuerda con ^{Gegas et al. (2010)} y ^{Okamoto et al. (2013)}, asimismo con ^{Ramya et al. (2010)}, quienes señalan que el peso del grano de trigo presenta estrecha asociación con el largo y ancho de los mismos. El tamaño del grano tuvo correlación con el largo (r_s= 0.85, p≤ 0.01) y con el ancho de grano (r= 0.47, p≤ 0.01), pero no hubo relación entre largo y ancho del grano (p= 0.76). La ausencia de relación entre largo y ancho del grano en este estudio, puede atribuirse a la colocación arbitraria de los granos sobre el cristal del escáner, porque es contrario a lo reportado cuando el ancho del grano se obtuvo de manera sistemática, como en la comparación entre el largo y ancho de grano de trigo obtenidos con vernier (^{Ramya et al., 2010}) y cuando se utilizó fotografías digitales de la parte dorsal de granos colocados separadamente (^{Rasheed et al., 2014}).

La diferencia entre el número de granos observados y calculados fue desde -1.5 a 1.68 % (X = 0.13 ± DE= 0.52%) y presentan concordancia (X²= 2.73, p= 1.0), con estrecha correlación entre ambas variables (r_s= 1.0, p≤ 0.01, Figura 1). El 32.2% de los casos fueron empates, 60.2% con diferencias porcentuales menores a uno, aunque en 42.6% de casos se sobrestimó el número de granos; las sub y sobrestimaciones mayores a uno presentó 6% de los casos (Figura 2). La subestimación del número de granos obtenidos mediante el PAID ocurrió porque el algoritmo de transformación divisoria (Watershed) no separó algún par de granos en contacto, por lo que los contabilizó como uno, o bien los excluyó debido a la restricción por tamaño; en cambio la sobrestimación fue porque grano completo fue dividido en dos, debido a la forma del grano, ya que dicha situación ocurrió en granos aislados o en contacto, por lo que en ningún caso influyó el tamaño de la muestra, situación contraria a la señalada por ^{Severini et al. (2011)}, quienes al registrar el número de granos de maíz (Zea mays L. var. everta) mediante fotografías digitales (entre 100 y 700 granos por imagen) y el uso de ImageJ, observaron que en muestras pequeñas ocurrió subestimación y sobrestimación en las muestras grandes.

Figura 1 Relación entre el número de granos de trigo observados y calculados mediante PAID.  

Figura 2 Distribución de frecuencias del error relativo entre número de granos observados y calculados.  

Las diferencias porcentuales son más grandes cuando el número de granos contenidos en la muestra es menor a 500, al superarse dicha cantidad, el error relativo es menor de uno (Figura 3). La reducción del error relativo medio entre el número de granos observados y los calculados conforme se incrementa el tamaño de la muestra indica que el número de granos sub y sobrestimados se mantiene, de acuerdo con ^{Maloney et al. (2014)}, la exactitud se incrementa a mayor tamaño de la muestra e indican que una limitante es la cantidad de grano que se puede capturar en una imagen, la cual depende de la cámara digital y su configuración, de la capacidad del contenedor o recipiente dónde se coloquen las muestras. Dicha cantidad también depende del tamaño del grano, en las observaciones de este estudio con el escáner de cama plana utilizado caben alrededor de 2 000 granos distribuidos al azar, sin tocar los bordes del cristal.

Figura 3 Distribución del error porcentual con respecto al número de granos de trigo observados.  

El método basado en PAID es capaz de separar los granos en contacto con efectividad mínima de 98.32%, resultado superior a 25 y 90% reportado por ^{Faessel y Courtois (2009)} en arroz (Oryza sativa L), con el uso de los algoritmos Watershed (transformación divisoria) y Gap-Filling (relleno de líneas) respectivamente, implementados en ImageJ, es ligeramente superior a 97.3% en trigo rojo de primavera del oeste de Canadá (CWRS) y a 96.1% en trigo CWAD, obtenidos por ^{Zhang et al. (2005)} mediante análisis de imágenes segmentadas con el algoritmo ajuste de elipses (Ellipse Fitting), programado en Visual C++^® (Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA). Está dentro de los valores de precisión señalados por ^{Mebatsion y Paliwal (2011)}, quienes obtuvieron 99.5% en CWAD, 97.5% en CWRS, en avena y centeno 97% y en cebada 96.5%, utilizando fotografías digitales y algoritmos de trazado de contorno (Elliptic Fourier) en Matlab 7.9^® (The Math Works, Natick, USA). La efectividad en la separación de los granos en contacto además depende del contraste entre el color del grano y del fondo, la calidad de la imagen y el proceso previo a la aplicación del algoritmo de separación utilizado. ^{Lin et al. (2014)} señalan que los errores en la segmentación de la imagen se deben principalmente al ruido durante la obtención de la imagen.

El tiempo para procesar las imágenes fue de 1.71 a 4.59 s, con muestras de hasta 1 500 granos, y presenta una respuesta lineal positiva con el tamaño de muestra (R²= 0.94, p≤ 0.01). El tiempo promedio para el procesamiento fue de 2.62 s, y para todo el proceso incluyendo la digitalización fue de 55 s para cualesquier cantidad de grano que contenga la superficie del escáner, mientras que en forma visual y con el contador electromecánico hay un incremento lineal conforme aumenta el tamaño de la muestra (Cuadro 2). El tiempo de procesamiento también depende del tamaño o resolución de la imagen, el número de granos y el número de contacto, programa y equipo computacional utilizado. Las imágenes a escala de grises o con resolución >300 ppp requieren menor tiempo para la digitalización. ^{Lin et al. (2014)} reportan 4.3 s en el programa Matlab R2009a^® para procesar imágenes (1 200 ppp) de muestras de 100 granos de arroz, con diferentes escenarios de granos en contacto. ^{Faessel y Courtois (2009)} señalan 8 s para procesar muestras con alrededor 200 granos de arroz, en imágenes de 300 ppp y escala de grises. ^{Severini et al. (2011)} indican aproximadamente 120 s por muestra, desde la toma de fotografías digitales hasta el PAID con ImageJ para contabilizar granos de maíz (Zea mays L. var. everta).

Cuadro 2 Estadísticas descriptivas del tiempo (s) requerido por el contador electromecánico, con el PAID y en forma visual (individuo 1 y 2). 

n= 5; DE= desviación estándar; CV= coeficiente de variación.

El método visual requiere mayor tiempo para registrar 100 granos o más, el contador electromecánico es más rápido contar 100 granos e igual que el PAID para registrar 200, pero incrementa a casi el doble a partir de 300 granos y presentó el mayor coeficiente de variación (Cuadro 2), debido a que el avance de los granos en el contador no es constante, éste se reduce conforme disminuye la muestra en el recipiente, también ocurre por no presionar con firmeza el botón de avance o dejar de hacerlo involuntariamente. Además requiere de muestras de grano completamente limpias, porque el sensor registra pequeñas impurezas. La desviación estándar del tiempo requerido para el registro visual y con contador del número de granos se incrementó a mayor tamaño de la muestra, lo cual es indicador de fatiga, de acuerdo con ^{Mascord y Heath (1992)} la desviación estándar y el tiempo en sí, que los individuos tardan en reaccionar, se incrementa conforme aumenta el tiempo dedicado a realizar una tarea monótona y repetitiva.

La restricción por tamaño permite clasificar los granos, los enteros midieron desde 14.2 a 30 mm², los quebrados y chicos de 4 a 14.1 mm², por lo que el criterio para considerar todos, fue de 4 a 30 mm² y circularidad de 0.4 a 1, la circularidad y el largo del grano permite separar entre granos chicos y quebrados, éstos últimos presentan menor longitud y circularidad arriba de 0.8, ésta última característica resulta útil para reforzar el análisis de calidad física del grano, ya que un criterio utilizado para clasificar el grano de trigo como quebrado, es cuando mide menos de – partes del largo promedio de granos completos (^{Punn y Bhalla, 2013}).

Conclusiones

El procesamiento y análisis de imagen digital (AID) registra con precisión el número de granos de trigo y permite obtener sus dimensiones individuales aunque éstos en la imagen se encuentren en contacto. La diferencia entre el número de granos observados y los calculados disminuye con el incremento del tamaño de la muestra; también la velocidad es superior con respecto al conteo manual cuando las muestras presentan cien granos o más, y a partir de doscientos supera al contador electromecánico, lo que representa una ventaja en ahorro de tiempo.