Incremento de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea

La primera etapa inicio con el incremento de inóculo. Según el protocolo establecido por ^{Cañedo y Ames (2004)}, a partir del material infectado se obtuvo el hongo, ya sea por la siembra de trozos de papa-dextrosaagar (PDA).

La identificación para cada hongo se realizó de acuerdo con la monografía de ^{Jarvis (1975)}, además de las claves de ‘CMI descriptions of pathogenic fungi and bacteria’ perteneciente a la Commonwealth Micological Institute. De igual forma se recurrió al apoyo de las claves para identificación de hongos de ^{Barnett y Hunter (1998)}; ^{Gilman (1963)}; ^{Romero (1993)}. Para tener los hongos con la mínima variación genética, se realizaron cultivos monospóricos de todas las cepas, de los que se tomó la muestra.

Las suspensiones de conidias en tubos fueron almacenadas en refrigeración a 4 °C hasta su uso. Posteriormente, con este material fueron realizadas las pruebas de patogenicidad en semilla para Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1)= (Folr1), se desarrolló en material vegetativo de tomate Bonny Best y Manapal (sin genes de resistencia y resistente a Folr1), para A. solani fue en hojas y B. cinerea en fruto realizándose en la variedad ‘Río Grande’ cuyas características es de tipo determinado y fruto tipo saladette y susceptible a ambos agentes fitopatógenos.

Las pruebas de patogenicidad consistió en una inoculación de Folr1 en los materiales diferenciales; para el caso de semilla, se embebieron 20 semillas en 200 ml en una suspensión de conidias (Folr1) de 10⁸ conidias ml^-1 y se sembraron las semillas en vasos de unicel (½ litro) conteniendo sustrato estéril tipo peat-moss (Sunshine, Sun Gro Horticulture Canada, Ltd.); asimismo, se realizó en plántulas con un desarrollo de 20 días después de la siembra, a través de una suspensión conidial de 10⁸ conidias ml^-1 a través, de la inmersión de raíces a las cuales previamente se les hicieron pequeñas heridas con una aguja hipodérmica.

Inmediatamente se trasplantaron en vasos de unicel de ½ litro conteniendo el mismo sustrato estéril tipo peat-moss (^{Rueda et al., 2006}). Las plantas se mantuvieron con una temperatura ambiente aproximada de 30 ±2 °C. Se utilizaron cuatro repeticiones de una planta en cada material para la toma de datos, se observó y se registró la respuesta de los materiales diferenciales para asegurar la alo y autoinfección por Folr1. El riego se llevó a cabo con agua destilada estéril, de acuerdo con las recomendaciones técnicas (^{INIFAP, 2005}). Los síntomas de marchitamiento en plántulas inoculadas, se presentaron 30 días después de la inoculación. La evaluación se hizo nuevamente con base en la presencia o ausencia de la enfermedad.

Respecto a las pruebas en hojas y frutos, las primeras fueron inoculadas de A. solani con la ayuda de un rociador-aspersor de mano, de 250 ml, mientras que el fruto se inoculó con B. cinerea punzándolos primeramente y adicionando con un cotonete 1ml de suspensión conidial a una concentración de 10⁸ ml^-1. Después de las inoculaciones, los órganos se colocaron en cámaras húmedas a una temperatura de 30 ±2 ºC en un período de 30 días (^{Jarvis y Hargreaves, 1973}; ^{Jarvis, 1975}; ^{Davised, 1988}; ^{Eckert, 1988}; ^{Tello y Lacasa, 1988}; ^{SAGARPA, 2005}), las cuales son condiciones apropiadas para inducir los signos de la enfermedad. En cada prueba se incluyó un testigo (control negativo- uso de agua estéril). La confirmación de los patógenos se realizó mediante la técnica serológica Elisa siguiendo el protocolo de identificación de hongos AGDIA.

Producción de antisuero

La inmunización se realizó en conejos de raza Nueva Zelanda con un peso de 3 kg, de 9-24 meses y evitando que las hembras estuviesen preñadas (^{Kirali, 1974}; ^{Bokx, 1980}; ^{Valdés, 1995}; ^{Villarreal, 1980}). El plan de inmunización, fue llevado a cabo en tres esquemas, con cinco conejos por esquema (Cuadro 1), con la metodología recomendada por ^{Flores (1994)}; ^{Rueda et al. (2006)}.

Obtención de semilla de tomate de importación que se siembra el estado de Sonora

Para la obtención de la semilla se contó con la colaboración de la Confederación Nacional de Productores Hortícolas (CNPH) región Sonora, donde cada productor facilitó una cantidad de 100-150 semillas para el análisis.

Muestreo en plantas (plántula, hoja desarrollada y fruto)

Para el muestreo de lotes se reprodujo el muestreo nacional de papa realizado por la ^{SARH (1994)}. El muestreo se realizó en 10% del total de la superficie cultivable de tres de los municipios productores de tomate (Cuadro 2). En 10% de la superficie de cada región se realizaron divisiones de 5 ha que serían considerada como parcela hipotética a muestrear. En cada punto se trazó una línea diagonal imaginaria de esquina a esquina, y en esa recta trazada se colectaron 10 muestras, las muestras colectadas, previamente identificada, se envolvió con papel húmedo y se colocó en una hielera para ser trasladada al laboratorio para su análisis.

Detección de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea en semilla de importación en medios de cultivo

De acuerdo con la técnica de ^{Randhawa (1996)}; ^{Rueda et al. (2006)}, cada muestra de semilla se lavó en agua corriente durante 30 min con la finalidad de eliminar productos químicos (i.e. fungicidas) y se colocó en charolas de plástico con capacidad de 2 L. A cada charola con la semilla se le añadieron 2 ml de solución amortiguadora fosfatasa con un pH= 7. A la mezcla de agua con fosfatasa conteniendo cada muestra de semillas se le llamó ‘suspensión madre’, las charolas se incubaron durante 12 h en refrigeración a 4 ºC con la finalidad de que se liberara conidias de Folr1, A. solani y B. cinerea a la suspensión madre.

Después de la incubación, se tomaron 10 ml de suspensión madre de cada una de las charolas, se le realizaron cuatro diluciones a tal suspensión (10:1, 10:2, 10:3, 10:4) y de la última dilución se tomó 0.1 ml que se sembró en medio de cultivo PDA en cajas de Petri por el método de dispersión por varilla (^{Roger et al., 1981}). Los medios se incubaron durante siete días a 34 ºC. Una vez germinadas las conidias y existiese crecimiento micelial con estructuras reproductivas, éstos fueron identificados considerando las claves indicadas en la fase de incremento de las cepas.

Detección de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea en semilla, plántula, hoja desarrollada y fruto con el antisuero producido

Las plántulas, hojas desarrolladas y frutos muestreados, se sometieron por un proceso de cortes de 0.5 a 1 cm de diámetro e introducidas directamente en una solución salina al 0.85% de NaCl, denominada solución madre. Para la detección de Folr1, A. solani y B. cinerea, se desarrolló la técnica de aglutinación en portaobjeto según lo indica ^{Kiraly (1974)}.

Detección de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea en semilla, plántula, hoja desarrollada y fruto por la técnica Elisa

Para la detección de Folr1, A. solani y B. cinerea, con respecto a la técnica serológica Elisa, se consideró el protocolo descrito en la detección en semilla.

Pruebas de patogenicidad de aquellas muestras positivas a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea, con los diferentes métodos de detección

Para la reafirmación de los hongos Folr1, A. solani y B. cinerea que resultaron ser positivas en los anteriores métodos de detección, las pruebas de patogenicidad fueron llevando a cabo la técnica de ^{Randhawa (1996)} y ^{Rueda et al. (2006)}, tal como se describió en la purificación e incremento de inóculo para producir antígeno.

Pruebas de identificación

Al realizar las pruebas previas de incremento de inóculo, identificación (medios de cultivo específicos y ELISA) y de patogenicidad, el resultado fue igual a los indicados por ^{Jarvis (1973)}; ^{Cañedo y Ames (2004)}; ^{Ascencio-Álvarez et al. (2008)}; López (2012); (^{CESAVEG, 2016}); ^{Robles-Carrión et al. (2014)}; ^{Valencia et al. (2016a)}, indicando que para Folr1 son producir colonias de crecimiento rápido, presentan un micelio aéreo, algodonoso y de coloración blanca; microscópicamente muestran macroconidias, fusiformes, curvas en los extremos y septadas; las dimensiones de los macro y microconidios (29.1-45 X 2.9-4.7 µm), el desarrollo de conidias se logró observar a los nueve días, rubro que concuerda con ^{Valencia et al. (2016b)}.

Con relación al hongo Alternaria solani, el desarrollo de conidias se logró obtener al cabo de 8 días; resultado que concuerda con ^{Cázar et al. (2014)}, éste presentó un micelio aéreo algodonoso, que pronto se tornó de color negro cuando esporula. Los conidióforos son oscuros midiendo 12-20 X 120-296 µm, oscuros, con apariencia de mazo y presentan septos longitudinales y transversales (^{Martínez-Ruiz et al., 2016}).

Por su parte Botrytis cinerea, presentó colonias grises. Al quinto día se observaron conidióforos bien diferenciados, simples, rectos, de 205-210 x 18 -20 µm, ramas de 18 - 20 x 6-8 µm. Conidios elipsoidales, lisos, casi hialinos, de 7-14 x 5 - 8 µm, frecuentemente con un apéndice de 3 µm de largo según ^{Farrera et al. (2007)}; ^{Robles-Carrión et al. (2014)}.

Con relación a las pruebas de patogenicidad, los síntomas de las semillas embebidas en la suspensión conidial de 10⁸ conidias^.ml^-1, con Folr1, 100% germinó entre los 36 y 48 h bajo condiciones favorables de la enfermedad en ambos materiales utilizados (Bonny Best y Manapal), las plántulas al cabo de 18 días presentaron una leve marchitez en tallo. Los cotiledones mostraron manchas irregulares de aspecto más oscuro y grasoso con relación al área sana. Esta misma sintomatología fue identificada en plántulas que una vez muertas se observó como el hongo fructificó sobre la superficie del tallo bajo condiciones de ambiente húmedo. Lo contrario, ocurrió con el material Manapal, donde la manifestación de síntomas no fue detectada ni al desarrollar cortes trans y horizontales a lo largo de los tejidos conductores en raíz y tallo de plántula. Los resultados obtenidos concuerdan al realizar inoculaciones en el mismo material Bonny Best y Manapal, con ^{Ascencio-Álvarez et al. (2008)}.

Para Alternaria solani son los síntomas sobre hojas, a los nueve días fueron aquellos característicos de forma circular, cercano a 1.5 cm de diámetro, de color marrón conteniendo anillos concéntricos. Los resultados concuerdan con ^{Martínez-Ruiz et al. (2016)}, indicando que los primeros síntomas, aparecen en las hojas más viejas y van progresando hacia las hojas más nuevas; de ahí también se pueden ver manchas marrones sobre los pedicelos y sobre los cálices cuando están adheridos a la flor o fruta. De esta manera, los frutos se infectan; a través, del cáliz o del pedicelo tanto cuando están verdes o maduros.

Para Botritys cinerea la sintomatología inició con la formación de pequeños anillos concéntricos; los primeros olores de putrefacción fueron detectados y en el 13º día ya existían conidiosporas. Los resultados obtenidos concuerdan con ^{Martínez-Ruiz et al. (2016)}.

Mediante la confirmación por la técnica serológica Elisa, se obtuvo un resultado positivo para los ejemplares fúngicos proporcionados por la empresa donante, así como también para las suspensiones de jugo celular y tejido infectado rico en conidias obtenidas de las pruebas de patogenicidad antes mencionadas.

Producción de antígeno contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea

Debido a que no todos los animales de sangre caliente reaccionan igual a un antígeno, sólo el esquema 3 (Cuadro 1) resultó ser eficiente para producir un alto contenido de anticuerpos. La aglutinación fue reafirmada realizando lecturas bajo el microscopio compuesto para observar una microaglutinación con la ayuda de un microscopio compuesto (Cuadro 2) (^{Bokx, 1980}).

Detección de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), Alternaria solani y Botritys cinerea en el estado de Sonora

En el caso de semilla, los resultados se muestran en el Cuadro 2. Bajo la técnica de Diagnóstico utilizando medio sólido papa-dextrosaagar (PDA), se demostró la presencia de Folr1 en la semilla donada por productores pertenecientes a la región Costa de Hermosillo, Valle de Guaymas y del Yaqui, con los materiales DMX1 y DMX2, resultados similares a las indicadas por ^{Valencia et al. (2016a)}, ^{Robles-Carrión et al. (2014)}. Un mismo resultado ocurrió en la semilla obtenida de Valle del Yaqui en el material BER y GLO, pero con la diferencia de que éstas resultaron ser positivas para Alternaria solani, ya que las conidias observadas correspondían a aquella según ^{Robles-Carrión et al. (2014)} y ^{Martínez-Ruiz et al. (2016)}.

Con respecto a la técnica Elisa, los resultados indican que, mediante esta técnica, la semilla obtenida de las tres regiones con los materiales DMX1 y DMX2, resultó ser positiva a la presencia de Folr1, confirmándose con las muestras procesadas con respecto al testigo.

Con respecto a la técnica de aglutinación y microaglutinación los resultados fueron positivos para Folr1, en muestras de semilla obtenidas de productores de las regiones muestreadas (DMX1 y DMX2, BER y GLO), con excepción de la región de Guaymas con los materiales RUE, ZAP, LEO y DAR que resultaron también ser negativas. En el Cuadro 2, los resultados varían únicamente para el patógeno A. solani, donde la técnica de diagnóstico con el antisuero producido se logra detectar en los materiales DMX1 y DMX2, lo contrario ocurrió en la Elisa, de ahí la importancia de la diferencia de resultados y definir si esas muestras presentaban o no células conidiales pertenecientes a los hongos estudiados (^{Rueda et al., 2006}).

Muestreo de plántula, hoja desarrollada y fruto en lotes comerciales

Respecto al estudio de plántula, hoja y fruto realizado por medio de la técnica de medio de cultivo PDA, la técnica Elisa y antisuero producido para detección de Folr1, A. solani y B. cinerea, los resultados se observan en el Cuadro 3. Se puede apreciar que los materiales vegetativos de las tres regiones muestreadas que y que resultaron ser positivos a la presencia de Folr1, en semilla, al momento de detectarlo en plántula o en las subsiguientes etapas fenológicas, el resultado fue negativo; lo anterior puede deberse a que las variedades que se siembran son resistentes a Folr1 o bien a que las condiciones culturales y de manejo, así como de aquellas al interior de las áreas de producción, como alta temperatura y baja humedad atmosférica, pudiese originar que el patógeno no tenga la capacidad de sobrevivir y por lo tanto no producir una infección en la planta de tomate. Alternaria solani y Botritys cinerea bajo las técnicas llevadas a cabo, varían entre las técnicas; se puede apreciar que la técnica de Elisa y de Antisuero producido, fueron sensibles a la presencia de estos dos fitopatógenos, lo contrario ocurrió el medio PDA (Cuadro 3).

Pruebas de patogenicidad a los hongos positivos en muestras vegetativas mediante los tres métodos de detección

Estas pruebas solamente se realizaron en aquellas muestras obtenidas de los lugares de muestreo y que resultaron ser positiva en las técnicas de diagnóstico utilizadas. Las pruebas de patogenicidad mostraron que, al inocularse en semilla, plántulas de 20 días, hojas y fruto, semilla y plántula para Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (R1), hoja para Alternaria solani y fruto para Botritys cinerea con un respectivo testigo positivo y negativo, bajo condiciones favorables de la enfermedad, resultaron ser positivos acorde a las características que describe ^{Ascencio-Álvarez et al. (2008)}, en material vegetativo Bonny Best y Manapal. Por su parte A. solani fue en hojas y B. cinerea en fruto realizándose en la variedad ‘Río Grande’.