Medios de cultivo para la germinación in vitro

Los medios para la germinación in vitro se prepararon según las formulaciones de ^{Brewbaker y Kwack (1963)} (BBK): CaNO₃ 300 mg L^-1, MgSO₄7H₂O 200 mg L^-1, H₃BO₃ 100 mg L^-1, KNO₃ 100 mg L^-1, Sacarosa 100 mg L^-1. ^{Lora et al. (2006)}: MgSO₄7H₂O 200 mg L^-1, Ca (NO₃)₂4H₂O 250 mg L^-1, KNO₃ 100 mg L^-1, H₃BO₃ 100 mg L^-1, Sacarosa 80 g L^-1. ^{Leal, (1969)} modificado: sacarosa 80 g L^-1. A los tres medios se les ajusto el pH a 6.5, se gelificaron con 10 g L^-1 de agar y se esterilizaron en una autoclave vertical marca AESA, durante 20 min a 121 °C y a presión de 15 lb pulgada^-2. Se usaron sales minerales de grado reactivo de la marca SIGMA.

Estimación de la viabilidad del polen recién liberado de las anteras

Para este estudio se utilizó polen fresco de las variedades ‘Colimex’, ‘Lise’, ‘Colimón’, los híbridos naturales de limón mexicano CV 63-64 y CV 67-68 y el ‘Citrange C-35’ como testigo, extraído dos horas después de antesis. Se colectaron 25 a 30 flores recién abiertas y con anteras en proceso de liberación del polen. Las flores se depositaron en cajas Petri de plástico estériles de 10 x 100 mm y dos horas después se friccionaron entre ellas para propiciar que el polen se desprendiera de las anteras abiertas. Para la siembra de polen, se utilizó el método de la gota sobre el portaobjetos. Con la ayuda de una micropipeta se depositaron cinco gotas del medio de cultivo en los portaobjetos. Se prepararon cinco portaobjetos por cada medio de cultivo.

Una vez gelificadas y frías las gotas, se dejaron caer los granos de polen sobre estas con un pincel de pelo de camello. Los portaobjetos se etiquetaron y se colocaron en una cámara húmeda para evitar la deshidratación del medio de cultivo. La cámara húmeda se llevó al cuarto de incubación por un periodo de 24 h con una temperatura que fluctuó entre 25 y 28 °C. Después de ese tiempo las muestras se observaron con el objetivo 40 x de un microscopio compuesto Motic BA200. En cada gota se observaron cinco campos y en cada uno se cuantificó el total de granos visualizados, así como el número de granos que emitieron y desarrollaron su tubo polínico, como lo señala (^{Kalinganire et al., 2000}). Con esos datos, se determinaron los porcentajes de germinación.

Determinación de la longevidad del polen conservado a temperatura ambiente

Para este experimento se utilizó polen de los genotipos diploides ‘Colimex’, ‘Colimón’ y ‘Lise’, así como del ‘Citrange C-35’ como testigo. Se colectaron 25 a 30 flores recién abiertas y con anteras liberando el polen. Las flores se depositaron en cajas Petri y se friccionaron entre ellas para propiciar que el polen se desprendiera de las anteras abiertas. Después de obtener el polen, se conservó en las cajas de Petri y se mantuvo a temperatura ambiente del laboratorio, que fluctuó entre 21 y 30 °C, hasta su utilización para las pruebas de viabilidad, misma que se llevaron a cabo 2, 24 y 48 h después de la antesis. Para la siembra, observación y registro de variables se utilizó la metodología descrita anteriormente.

Análisis de datos

En ambos experimentos se utilizó un diseño experimental en bloques al azar con arreglo factorial y cinco repeticiones. Para la estimación de la viabilidad de polen fresco, se probaron tres medios de cultivo y seis genotipos. Para estimar la longevidad del polen se utilizaron tres medios de cultivo y cuatro genotipos. El análisis se realizó con los promedios de dos años de estudio. Los valores en porcentaje se transformaron a valores de arcoseno mediante la ecuación: Bliss [y= arc sen (√(x/100)]. Andres et al. (1999). Los análisis estadísticos se realizaron con ayuda de los programas estadísticos Statistix 9 de Analytical Software, (2010).

Estimación de la viabilidad del polen recién liberado de las anteras

Los tres medios de cultivo permitieron la germinación de granos de polen de los distintos genotipos estudiados (Figura 1).

Figura 1 Germinación de granos de polen de limón mexicano ‘Colimex’ en tres medios de cultivo a) ^{Brewbaker y Kwack (1963)}; b) ^{Lora et al. (2007)} modificado; y c) ^{Leal (1969)}. 

Después de 24 h, se pudo observar crecimiento del tubo polínico a partir de los granos de polen, los que se cuantificaron como viables. Los resultados registrados en 2008 fueron coincidentes con los obtenidos en 2009 tanto para medios de cultivo como para genotipos.

Para el análisis estadístico se utilizaron los promedios de los dos años de estudio, de cada una de las variables registradas. El Anova no reportó diferencias significativas para el factor medios de cultivo. Sin embargo, se detectaron diferencias altamente significativas (p= 0.01) para el factor genotipos, así como para la interacción entre medios de cultivo*genotipos.

De acuerdo con los resultados que se muestran en el Cuadro 1, se puede apreciar que los tres medios de cultivo evaluados promovieron la germinación de granos de polen en proporciones muy similares y resultaron estadísticamente iguales entre sí. Los porcentajes de germinación en los tres medios de cultivo fluctuaron entre 20.4% a 21.6%.

Según ^{Soares et al. (2008)} la germinación in vitro es uno de los métodos comúnmente utilizados para estimar la calidad de granos de polen, en estudios de biología reproductiva y selección de progenitores masculinos en programas de mejoramiento genético. Es el principal indicador de la viabilidad funcional del polen (^{Cerovic et al., 2014}). Para ello se han desarrollado medios de cultivo simples y algunos más complejos para reproducir las condiciones que brinda el estigma de la flor para que el polen germine y el tubo polínico crezca por el estilo, hasta alcanzar el saco embrionario.

En nuestro estudio, no se encontraron diferencias en los porcentajes de germinación de granos de polen germinados entre los tres medios de cultivo evaluados. Desde la formulación más simple (^{Leal, 1969}) modificado, que solo incluyo 80 g L^-1 de sacarosa + 10 g L^-1 de agar, en el que se alcanzó un promedio de 20.4% de granos de polen germinados, hasta el medio más complejo (^{Lora et al., 2006}), que además de llevar 80 g L^-1 de sacarosa y 10 g L^-1 de agar, se adicionaron algunas sales minerales y que promedió 21.6% de granos germinados.

Esto significa que el polen recién liberado de las anteras en los seis genotipos estudiados, no requieren un medio de cultivo complejo y como lo señalan ^{Patel y Mankad (2014)}; ^{Ahmed et al. (2017)} una germinación satisfactoria del polen puede alcanzarse en una solución de agua y azúcar. Por lo tanto, cualquiera de las tres formulaciones evaluadas resulta adecuada para estimar la viabilidad del polen de limón mexicano en laboratorio. Si tomamos la composición de los tres medios, el descrito por ^{Leal (1969)} y modificado, resulta adecuado por lo simple y barato de la preparación.

El estudio también permitió detectar diferencias entre los seis genotipos evaluados respecto a la capacidad del polen para germinar in vitro. Con base a los resultados, las tres variedades de limón mexicano presentaron bajos porcentajes de germinación respecto a los otros genotipos evaluados. Particularmente las variedades ‘Colimón’ y ‘Lise’ registraron porcentajes de germinación de 0.78% y 3.05% respectivamente, por lo que se considera que estos genotipos no son deseables como donadores de polen en trabajos de mejoramiento genético.

Por su parte, la variedad ‘Colimex’ alcanzó 13.74% de granos germinados, aunque sigue siendo un porcentaje bajo de polen viable comparado con lo informado por ^{Khan y Perveen (2014)}; ^{Ahmed et al. (2017)} para otros cítricos, puede utilizarse como progenitor masculino con mejores expectativas de fecundar el ovulo y generar híbridos.

El resultado obtenido para ‘Colimex’ tiene coincidencia con lo informado por ^{Viloria y Grosser (2005)} que registraron 7.5% de polen viable, aunque estos autores hicieron sus estimaciones usando el método tinción con acetocarmín al 1%. Por otro lado, el ‘Citrange C-35’ alcanzó los porcentajes de viabilidad de polen más altos y por lo tanto puede ser considerado como un buen candidato para usarse como donador de polen (Cuadro 1). De acuerdo a estos resultados, la capacidad de germinación in vitro del polen fue diferente entre variedades de limón mexicano y especies cítricas. (^{Dominguez et al., 1999}; ^{Kundu et al., 2014}; ^{Khan y Perven 2014}; ^{Ahmed et al., 2017}) también reportaron diferencias en los porcentajes de germinación del polen entre distintas especies cítricas.

Determinación de la longevidad del polen conservado a temperatura ambiente

En este experimento el Anova reportó diferencias altamente significativas para el factor tiempo de almacenamiento después de la antesis (TDA), para el factor genotipos y la interacción TDA*genotipos. Con los resultados que se muestran en el Cuadro 2, es claro que los tratamientos con polen conservado a temperatura ambiente por 2 y 24 h a partir de la antesis presentaron valores entre 10.03 y 13.92% de granos de polen con capacidad de germinar y resultaron estadísticamente iguales entre sí. Para el caso del polen conservado por 48 horas en ambiente natural antes de la siembra, prácticamente perdió su viabilidad. Por su parte, los genotipos presentaron un comportamiento diferente para esta variable y registraron distintos porcentajes de granos de polen germinado, que los hizo estadísticamente diferentes entre sí. El ‘Citrange C-35’, alcanzó el mayor porcentaje de polen germinado in vitro, seguido por el ‘Colimex’, ‘Lise’ y ‘Colimón’.

Se puede apreciar que los genotipos muestran interacción sólo con los tratamientos de 2 y 24 h de almacenamiento. Con el polen sembrado dos horas después de la antesis, los genotipos alcanzaron diferentes porcentajes de germinación, resultando estadísticamente diferentes entre sí. El ‘Citrange C-35’ presenta el mayor porcentaje de germinación, seguido de la variedad ‘Colimex’, ‘Lise’ y ‘Colimón’. Con polen sembrado después de 24 h desde la antesis, los genotipos mostraron un comportamiento similar al descrito para el tratamiento de dos horas después de la antesis. Para el tratamiento con polen almacenado por 48 h, los porcentajes de germinación de los granos de polen se redujeron significativamente en todos los genotipos.

La longevidad de los granos de polen es una característica importante para un programa de mejoramiento genético mediante hibridación convencional. La duración de la viabilidad, monitoreada a través del tiempo y mediante el registro de la capacidad del polen para germinar in vitro, puede ayudar a estimar su longevidad. En muchas especies vegetales este período de tiempo generalmente es corto si el polen se mantiene a temperatura ambiente, aunque de acuerdo con ^{Dafni y Firmage (2000)}, esto puede variar fuertemente entre especies y condiciones de almacenamiento.

Al respecto, ^{Wang et al. (2012)} determinaron que bajo condiciones de días nublados el polen de pasto forrajero (Festuca arundinacea Schreb.) transgénico y no transgénico, permaneció viable hasta 240 min, con 5% de viabilidad después de 150 min de almacenamiento. Sin embargo, bajo un ambiente soleado, la viabilidad del polen se reduce al 5% en solo 30 min, con una pérdida completa de viabilidad en 90 min.

Es escasa la información detectada respecto a la longevidad del polen de cítricos. Sin embargo, ^{Khan y Perveen (2014)}, señalan que en almacenamiento bajo condiciones de refrigeración (4 °C), el polen de C. limon, C. aurantium, C.reticulata y C. sinensis perdió cerca de 50% de su capacidad para germinar in vitro en comparación con lo observado en polen fresco, después de 48 semanas, mientras que C. paradisi perdió cerca de 95% de su viabilidad en ese mismo período de tiempo. Estos autores no evaluaron la viabilidad con polen almacenado a temperatura ambiente.

Por su parte, ^{Ahmed et al. (2017)}, en un trabajo similar, determinaron que el polen de tres variedades de toronja (C. paradisi), en promedio perdieron 80% de capacidad para germinar in vitro, en comparación con lo registrado con polen fresco, después de 48 semanas de almacenamiento a 4 °C, mientras que en dos variedades de Tangelo (C. reticulata × C. maxima × C. paradisi), tres de pomelo (C. maxima.) y tres de mandarina (C. reticulata) la pérdida fue de 60% y en tres variedades de naranja, se perdió 49%. En ese mismo estudio, las muestras de polen de todas las especies y variedades conservadas a temperatura ambiente no presentaron granos de polen viables después de 8 días.

En nuestro estudio, el polen se conservó en el laboratorio a temperatura ambiente, que fluctuó entre 21 °C y 30 °C, lo que propició que la capacidad de germinación del polen se redujera rápidamente. Las muestras de polen tomadas dos horas después de la antesis alcanzaron los porcentajes más altos de germinación en los genotipos ‘Colimex’ y el ‘Citrange C-35’. En las muestras tomadas 24 h después de la antesis los porcentajes de germinación bajaron casi a la mitad en ambos genotipos. Mientras que en los genotipos ‘Colimón’ y ‘Lise’ los resultados fueron ligeramente diferentes y los mayores porcentajes de germinación se alcanzaron a las 24 h después de la antesis. Sin embargo, para las 48 h de almacenamiento, la viabilidad se redujo significativamente en todos los genotipos evaluados, que registraron en promedio 0.28% de granos de polen germinados.

Un resultado similar fue descrito por ^{Shekari et al. (2016)} en ortiga borde (Leonurus cardiaca) quienes registraron porcentajes de germinación de 82.84, 24.37, 11.04 y 0.19 en muestras de polen colectado a 2, 24, 48 y 72 h después de la antesis, mientras que el polen almacenado a -60 °C mantuvo los más altos valores de germinación in vitro después de las 48 semanas de almacenamiento. Es necesario, continuar este trabajo y determinar las mejores condiciones para la conservación a bajas temperaturas o crioconservación, lo que ayudará a contar con polen en cualquier época del año y coincidir con los donadores de semilla y eficientar el mejoramiento genético de limón mexicano.